揭秘化妝品安全性評價技術(四)

　　摘要：眼睛是最容易接觸化妝品及其成分的器官之一，眼刺激性評價是化妝品原料及產(chǎn)品安全性評價的主要內(nèi)容，傳統(tǒng)眼部刺激試驗采用實驗動物進行，不僅外推到人具有一定的風險，而且造成動物極大的痛苦。近年來，多種替代動物試驗的體外方法被開發(fā)和應用。
　　
　　在某些條件下，眼睛可能成為化妝品及其成分作用的靶器官或吸收途徑，因而外源物質(zhì)可能造成眼部的健康危害，這些可能發(fā)生的毒性作用包括：眼及外周組織的局部刺激、損傷和炎癥反應，過敏反應，眼深部的組織損傷，臨床表現(xiàn)為眼部疼痛、刺痛、灼熱、眼瞼眨動、淚液增多，嚴重者引起不同程度的功能性損失，如角膜渾濁、水腫、甚至視力下降。正常情況下，眼睛很少直接接觸外源物質(zhì)。但在化妝品使用過程中，通常由于意外使化妝品以稀釋的形式進入眼睛（例如香波），產(chǎn)生刺激作用。眼刺激性是指眼睛前表面直接接觸受試物后引起的眼及其周圍粘膜可逆性炎性變化。眼腐蝕性是指眼睛前表面直接接觸受試物后引起的眼及其周圍粘膜不可逆性組織損傷。
　　
　　檢測化學物的刺激性和腐蝕性的傳統(tǒng)實驗是由Draize等提出的兔眼實驗，目前仍是測定急性眼毒性的國際標準。近年來，在動物福利的壓力下，一些優(yōu)化的試驗方法被提出，并陸續(xù)被驗證和認可。除了經(jīng)驗證認可的替代方法外（BCOP試驗、ICE試驗、IRE試驗），大多數(shù)化妝品公司將一些所謂“有效（valid）”替代方法用于化妝品成品篩選。有效替代方法被定義為：還沒有通過完整驗證程序的技術，但存在足夠多的科學數(shù)據(jù)證明其相關性和可靠性。這些方法包括HET-CAM測試、RBC試驗及NRU試驗。這些方法目前可作為危險識別的篩選工具，用于非風險評估過程。
　　
　　一、體內(nèi)眼刺激的發(fā)生機制
　　體內(nèi)眼刺激的發(fā)生機制表明，實驗兔暴露受試物后最初幾個小時（一般3小時）內(nèi)，角膜的損傷程度可以預測眼睛損傷的持續(xù)時間和最終損傷程度。一般來說，輕度刺激物只影響表層角膜上皮，輕度和中度刺激物主要影響上皮和表層基質(zhì)，嚴重刺激物能穿透更深的基質(zhì)發(fā)揮作用，甚至可能是基質(zhì)全部。而且損傷的可逆性和最初的損傷程度相關。
　　角膜損傷程度（細胞損傷）和大體觀察兩者之間的相關關系，對于開發(fā)和驗證預測眼刺激性的體外/離體檢測方法提供了機理性基礎。在所有可能影響角膜損傷的動力學因素中，受試物的自身細胞毒性潛力排在第一位。那些可溶解細胞膜或者是導致蛋白質(zhì)凝集的物質(zhì)可立即產(chǎn)生細胞毒性，如表面活化劑和一些有機溶劑是這類物質(zhì)的代表。那些作用于細胞能量代謝的物質(zhì)也可快速產(chǎn)生作用，但可能沒有第一類物質(zhì)迅速?；瘜W物質(zhì)還可以通過對大分子的烷化或者其他影響而產(chǎn)生作用，這類物質(zhì)的作用可能表現(xiàn)為一種遲發(fā)性的細胞毒性（如遲發(fā)性壞死或者凋亡）。
　　體內(nèi)眼刺激實驗中受試物局部接觸角膜和結(jié)膜，而實際情況下暴露的持續(xù)時間并不確定，可能從幾分鐘到幾小時不等。角膜細胞層的暴露深度取決于受試物滲透和錨定于表層的速度和能力。這樣就很好理解產(chǎn)生明顯細胞毒性所需的時間和細胞接觸受試物后產(chǎn)生“損傷”所需的時間并不一致，而后者可能最終導致細胞死亡。那些快速損傷細胞的物質(zhì)可能更容易對眼細胞產(chǎn)生毒性作用。
　　
　　二、動物實驗及優(yōu)化方法
　　動物試驗是受試物直接接觸動物結(jié)膜囊，隨后通過肉眼仔細檢查角膜，虹膜和結(jié)膜的變化，并量化評分，從而對生理反應做出分類。目前在不同的法規(guī)中有多種不同的評分系統(tǒng)，評價范圍有最大單次組織計分和全部三種組織平均加權總分計分幾種。對于化妝品的安全評估，加權總分、最大平均分(MAS)和改良最大平均分（MMAS，不包括接觸受試物后1小時的結(jié)果）均在使用。
　　這些年來，為了減輕動物遭受的痛苦和使受損組織更快恢復，已經(jīng)提出一些優(yōu)化意見，例如低眼容量實驗（LVET）。目前，減少和優(yōu)化的方法已經(jīng)包括在試驗策略中，作為動物試驗的補充，而體內(nèi)兔眼試驗僅需要在最后一步進行，也就是說當全部其他序列試驗已經(jīng)得出陰性評價結(jié)果，需要對輕度到中度的刺激性混合物進行評價時才考慮性體內(nèi)試驗。
　　
　　三、體外試驗方法
　　1991至1997年間在歐盟機構(gòu)主導下，共進行了6項眼刺激試驗的評價研究，對9項體外替代方法進行了評估。當時的結(jié)論認為沒有一項研究可以完全替代Draize實驗，但其中的一些實驗作為眼刺激物篩選的方法或組合試驗的一部分可用于眼刺激試驗的替代方法。后來經(jīng)過持續(xù)改進，部分替代方法通過了ECVAM、ICCVAM等驗證機構(gòu)的驗證，2009年，BCOP、ICE和IRE方法被OECD認可用于替代眼刺激試驗。
　　1 牛角膜渾濁和滲透性實驗（Bovine Corneal Opacity and Permeability，BCOP）使用屠宰場獲得的標本，將新鮮分離的角膜水平固定于支持架，然后放置于特殊改進的透光容器里。恒溫條件下，封閉角膜將測試容器分為上下2個隔室，受試物添加于上隔室中，通過測量下室培養(yǎng)液的光密度（OD）評估角膜的滲透性。測出的透光值和滲透值可用來進行體外分值計算。根據(jù)這一評分系統(tǒng)可對受試物進行分類。BCOP可用于化妝品原料及成品的安全評估，也可用于日用和工業(yè)用清潔產(chǎn)品、盥洗產(chǎn)品、殺蟲劑等相關化學品和配方。BCOP實驗非常適合用于測試不同物理性狀和溶解度范圍較大的受試物，適用于鑒定中度、重度和極重度眼刺激性物質(zhì)，但對區(qū)分輕度到極輕度的水平的刺激物似乎不太敏感，后者更適合用上皮樣組織結(jié)構(gòu)或者細胞毒性方法進行檢測。歐盟ECVAM和美國ICCVAM 于2007年通過對該方法的驗證，2009年成為OECD正式試驗指南（TG437）。
　　2 離體兔眼實驗（isolated rabbit eye test，IRE），其原理是眼球接觸刺激性物后，檢測角膜透光值和角膜增厚（角膜腫脹）評價受試物的眼刺激性。從人道處死的實驗兔分離完整眼球，固定和直立維持于超滲容器中，滴入生理鹽水使角膜保持濕潤。試驗時，將受試樣品直接與眼球接觸。暴露時間不定，例如鑒定嚴重刺激物接觸10秒，區(qū)分損傷程度較輕的受試物可接觸1分鐘或更長。去除受試物后，將眼球重新放入容器中，檢查角膜透光值和角膜厚度。30分鐘和1、2、3、4小時后進一步評估。染毒30分鐘和4小時分別檢查熒光素滲透性。記錄角膜透光值和熒光素滲透性。根據(jù)獲得的試驗結(jié)果，通過不同觀察指標的組合分析可對受試物的總體損傷做出評估。通常導致角膜水腫超過15%的化學物可認為具有嚴重眼刺激性。IRE實驗適合檢測大多數(shù)類型的受試物，特別是用來篩選嚴重刺激性的物質(zhì)（R41）。IRE實驗主要用來預測角膜損傷，它不能提供受試物對結(jié)膜的作用或角膜損傷后的恢復。因此不能絕對認為IRE實驗中未觀察損傷代表在體內(nèi)也無作用。
　　3 離體雞眼實驗（Isolated Chicken Eye，ICE），ICE是一種利用離體雞球短期培養(yǎng)進行眼刺激檢測的體外方法，眼損傷通過角膜水腫、通透性和熒光素滲透進行評價?？捎糜谠u價腐蝕物和嚴重眼刺激物，或作為組合試驗的一部分用于特定化學物質(zhì)的法規(guī)分類的標識。其原理和具體操作過程類似于IRE。角膜水腫、透光值和熒光素滯留的數(shù)值作為毒理學終點。平均最大分值用于對無刺激到嚴重刺激物進行分類，計算ICE刺激指數(shù)，其范圍從2到200。ICE實驗可作為替代兔眼刺激試驗的有效的常規(guī)檢測方法。法國和德國均認可ICE實驗用于鑒別嚴重刺激性物質(zhì)。荷蘭認可其作為鑒別“眼嚴重刺激物（R41）”的篩選方法，但不能作為區(qū)分刺激物和非刺激物的確認試驗。CEET實驗可用于化妝品和日用品企業(yè)實驗室。歐盟ECVAM和美國ICCVAM 均于2007年通過對該方法的驗證和認可。2008年列為OECD新的試驗指南草案，2002年EU認可用于嚴重眼刺激物(R41)的鑒定和標識方法，2008年美國認可其作為組合試驗策略中檢測眼腐蝕物和嚴重眼刺激物的篩選方法。2009年OECD認可為試驗指南438。
　　
　　
　　四、未驗證的方法
　　1 雞胚絨毛膜尿囊膜試驗（Hen`s egg test on the chorio-allantoic membr