生豬屠宰場中沙門菌的傳播特點和防控新技術(shù)

彭通通，潘明星，孟闖，焦新安，潘志明

(揚州大學(xué)/江蘇省人獸共患病學(xué)重點實驗室/江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子(動物源)控制重點實驗室/教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 揚州 225009)

沙門菌屬于腸桿菌科，分為邦戈爾沙門菌和腸道沙門菌2個種。絕大多數(shù)沙門菌屬于腸道沙門菌，可分為2 600多種血清型[1]。不同血清型沙門菌的宿主適應(yīng)性不同，某些沙門菌血清型可感染多種宿主導(dǎo)致疾病，例如豬的豬霍亂沙門菌一般可造成豬的系統(tǒng)性疾病，也會影響哺乳動物宿主，宿主限制性的沙門菌血清型只能造成單一宿主的傷寒疾病，例如豬的豬傷寒沙門菌和人的傷寒沙門菌等；其中泛宿主沙門菌可在廣泛的宿主中造成疾病，常見于鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌等[2]。沙門菌是最常見和廣泛分布的食源性病原體之一，是引起全球人類胃腸炎和細菌血癥的主要原因之一。雖然我國缺乏對沙門菌的官方系統(tǒng)監(jiān)測數(shù)據(jù)，但據(jù)估計22.2%的食源性疾病是由沙門菌引起的[3]，其中70%～80%的細菌性食物中毒由沙門菌引起[4]，且引起沙門菌中毒的食品中90%以上是動物性產(chǎn)品[5]。馬呈珠等[6]對山東省1983—2002年間沙門菌食物中毒情況進行分析，共發(fā)生沙門菌食物中毒286起，其中15人死亡，11 228人中毒。沙門菌不僅在我國感染嚴重，還是世界范圍內(nèi)最重要的人獸共患病原菌之一，至2010年在全球造成了7 800萬例食源性疾病和59 000人死亡[7]，對食品安全造成了嚴重危害。

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們對肉類食品的需求日益增大，導(dǎo)致病原微生物引起的食源性疾病日益增多。自20世紀90年代初以來，豬肉被認為是人類沙門菌病的重要來源[8]。豬易受多種血清型沙門菌的感染，特別是鼠傷寒沙門菌、德爾卑沙門菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒單相變異株和羅森沙門菌，而且德爾卑沙門菌、鼠傷寒沙門菌及鼠傷寒單相變異株與大多數(shù)人類感染沙門菌病例相關(guān)。被感染的豬通常是健康的沙門菌攜帶者，這些亞臨床感染的豬可能會在糞便中排出沙門菌，或?qū)⒓毦粼谀c道、淋巴結(jié)及扁桃體中。據(jù)報道，被感染的豬是屠宰場和加工環(huán)節(jié)最主要的污染源[9]，筆者所在實驗室對某規(guī)模化大型半自動屠宰場進行了連續(xù)3 年的流行病學(xué)調(diào)查， 2016年3月至2019年12月間共采集2 256 份樣品，沙門菌總分離率達29%，污染遍布所有屠宰環(huán)節(jié)，可見生豬屠宰場沙門菌交叉污染嚴重。本文將重點介紹沙門菌在豬肉加工環(huán)節(jié)中的污染現(xiàn)狀及防控措施研究進展。

1 生豬屠宰場沙門菌的傳播

1.1 “養(yǎng)殖場-屠宰場”的沙門菌來源

生豬屠宰環(huán)節(jié)是肉品受沙門菌污染的關(guān)鍵風(fēng)險點之一，由于屠宰環(huán)境、日屠宰量、屠宰場規(guī)模的不同，不同地區(qū)屠宰環(huán)節(jié)的沙門菌污染率有所不同[10]。生豬屠宰場位于養(yǎng)豬業(yè)的下游及豬肉銷售的上游，是減少豬肉生產(chǎn)鏈中沙門菌流行的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11]。為了對沙門菌的污染進行有效控制，需了解沙門菌的來源。Patchanef等[12]對泰國清邁及周邊地區(qū)豬肉零售店中沙門菌的傳播進行了研究，利用脈沖場凝膠電泳(PFGE)和沙門菌地理分布分析發(fā)現(xiàn)多個來源的沙門菌間具有親緣關(guān)系，表明豬肉生產(chǎn)鏈中的沙門菌存在“養(yǎng)殖場-屠宰場”傳播途徑。Colello等[13]利用細菌基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)(ERIC-PCR)對來自養(yǎng)殖場、屠宰場及豬肉零售樣品中的沙門菌分析顯示，沙門菌菌株間具有克隆相關(guān)性，表明養(yǎng)殖場的沙門菌可垂直傳播到屠宰場及零售環(huán)節(jié)。在生豬養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，無論是受污染的豬還是受污染的飼料、車輛、靴子、過道、野生動物等，都是造成豬場環(huán)境污染的重要原因[14]。育肥豬的污染是豬養(yǎng)殖場沙門菌污染的關(guān)鍵點。在育肥豬運輸?shù)酵涝讏龅倪^程中，處理、裝載、高密度放養(yǎng)、環(huán)境和溫度的變化、長時間運輸?shù)榷紩o育肥豬造成應(yīng)激反應(yīng)，使攜帶沙門菌的豬產(chǎn)生糞便并導(dǎo)致交叉污染。有研究調(diào)查了中國四川省18個養(yǎng)豬場、下游屠宰場和市場的沙門菌分布，經(jīng)脈沖場凝膠電泳(PFGE)發(fā)現(xiàn)豬養(yǎng)殖場的沙門菌交叉污染嚴重，下游屠宰場也被養(yǎng)殖場的沙門菌污染[15]。養(yǎng)殖場的沙門菌被運輸車輛攜帶到生豬屠宰場，這種高度污染的環(huán)境增加了沙門菌污染屠宰場的可能。據(jù)文獻報道，育肥豬暴露在受污染的環(huán)境中2 h就可受沙門菌污染[16]，因此，如果屠宰環(huán)境受污染，待宰生豬很易在待宰圈被污染。

1.2 生豬屠宰場內(nèi)的交叉污染

生豬在待宰圈休息時會造成交叉污染，待宰圈清洗時也會造成生豬的交叉污染。胴體水平的沙門菌污染是屠宰場最關(guān)鍵的污染環(huán)節(jié)之一，在屠宰設(shè)施中發(fā)現(xiàn)了2種沙門菌來源：第1種是屠宰場環(huán)境中存在沙門菌；第2種是受污染的豬傳播沙門菌。環(huán)境中存在的沙門菌菌株已成“本地菌群”的一部分，長期污染屠宰場的豬胴體[17]。屠宰線上的污染主要來自于放血、燙毛、脫毛、劈半、拋光等半機械半人工屠宰區(qū)域，屠宰操作的不規(guī)范會造成嚴重的交叉污染，操作工人也會攜帶沙門菌進入屠宰場。研究發(fā)現(xiàn)10.3%的屠宰豬淋巴結(jié)中攜帶沙門菌，8.3%的豬胴體被沙門菌污染。許多研究表明，在放血環(huán)節(jié)豬體表面會受到高水平的污染，當(dāng)攜帶沙門菌的豬胴體經(jīng)過各個屠宰環(huán)節(jié)時會通過屠宰人員的手或刀具將沙門菌傳遞到其他胴體產(chǎn)生交叉污染[18]。筆者所在實驗室對江蘇省不同類型豬屠宰場的流行性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，豬放血后呈高水平的沙門菌污染，總分離率達46.9%，是屠宰環(huán)節(jié)中僅次于去內(nèi)臟環(huán)節(jié)沙門菌污染最嚴重的環(huán)節(jié)。燙毛和脫毛等過程可減少沙門菌污染，但燙毛水和刮毛刀具的反復(fù)使用易被豬攜帶的泥土、糞便中的沙門菌污染，導(dǎo)致燙毛池和刮毛刀具也成沙門菌的傳播污染源[19]。在劈半過程中，受污染的劈刀可傳播沙門菌。Zhou等[11]經(jīng)過對中國淮安某大型半自動化屠宰場的沙門菌流行性規(guī)律監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，在豬胴體劈半環(huán)節(jié)的沙門菌污染率達55.9%，是沙門菌流行率最高的污染環(huán)節(jié)。在屠宰場規(guī)范性操作中，去內(nèi)臟是重要的屠宰環(huán)節(jié)，腸胃道的腸系膜和回腸、盲腸、淋巴結(jié)，以及頭部的下頜或咽后淋巴結(jié)往往是沙門菌在豬體內(nèi)的藏身之處。不規(guī)范的屠宰程序和檢驗程序會導(dǎo)致豬體內(nèi)的沙門菌在屠宰線上擴散并造成豬胴體污染。Bonardi等[20]對兩家日屠宰量為3 000頭的生豬屠宰場進行了沙門菌的流行性調(diào)查，在豬胴體和屠宰工具上檢測到了親緣性關(guān)系極高的沙門菌，證明了屠宰程序與豬胴體之間存在嚴重的交叉污染。盡管還需更多的研究來深入探究屠宰場沙門菌的流行病學(xué)規(guī)律，但屠宰場沙門菌污染的防控需從屠宰操作和屠宰環(huán)境的消毒入手，通過最少的成本獲得最高的效益，這是豬屠宰場生產(chǎn)實際中最易實現(xiàn)的防控手段。

2 沙門菌的快速檢測及分子分型技術(shù)

沙門菌常見于肉類、加工肉類、含有肉類的加工食品和加工過程中被污染的食品。因此，快速準確地檢測沙門菌感染對肉類加工業(yè)、食品安全和人類健康至關(guān)重要。沙門菌分子分型技術(shù)可快速準確地追蹤沙門菌污染源，檢測出不同來源的沙門菌，為沙門菌的防控奠定基礎(chǔ)。這些新檢測技術(shù)未來用于屠宰環(huán)節(jié)的沙門菌檢測，將為肉類食品安全和公共衛(wèi)生提供重要的保障。

2.1 快速檢測技術(shù)

隨著食源性致病菌的危害日益嚴重，快速篩查受污染食品是預(yù)防和控制食源性疾病暴發(fā)的關(guān)鍵。國家標準的沙門菌檢測方法依賴于常規(guī)的微生物培養(yǎng)方法，利用培養(yǎng)基進行增菌及分離純化，將純化后的菌落進行生化鑒定，國標法是沙門菌檢測的金標準，但操作繁瑣、耗時長。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)Zhang等[21]研究了一種使用鐵納米團簇放大和智能手機成像技術(shù)來快速檢測沙門菌的毛細管生物傳感器，利用操作簡便的多柱毛細管、可信號放大的鐵納米團簇和可圖像分析的智能手機APP實現(xiàn)快速靈敏地檢測沙門菌，但現(xiàn)階段檢測的樣品體積有限，不適合大體積檢測目標菌，而且玻璃毛細管易碎。Preechakasedkit等[22]建立了一種快速檢測沙門菌的免疫層析試紙法，該方法已成功用于檢測人血清中的沙門菌，特異性和準確性達100%，其在屠宰場沙門菌現(xiàn)場檢測中的應(yīng)用潛力具有重要研究意義。楊美榮等[23]建立了實時熒光PCR技術(shù)檢測飼料中沙門菌，并對空白飼料、人工污染飼料和自然感染飼料進行了檢測，結(jié)果均與國標方法一致。Fachmann等[24]提出了一種可以幫助屠宰場節(jié)省工作時間和冷藏成本的快速檢測方法，是可兼容快速循環(huán)實時PCR檢測和樣品制備的一種方法。近年來，利用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)的核酸擴增技術(shù)成為食品沙門菌PCR檢測的新方法。徐文文等[25]通過優(yōu)化引物濃度及熔解曲線分析判斷擴增靶標的來源，建立的二重LAMP法可用于乳制品企業(yè)大規(guī)模乳粉樣品中沙門菌和金黃色葡萄球菌的現(xiàn)場快速篩查。Liu等[26]將LAMP和色譜測流試紙結(jié)合用于沙門菌的快速檢測，此技術(shù)對腸炎沙門菌檢測的靈敏度是常規(guī)PCR的1 000倍。Han等[27]將單疊氮丙酸和LAMP技術(shù)相結(jié)合用于檢測病原微生物，顯示出較好的定量能力，是一種快速、靈敏、可靠的檢測方法。隨著人們對沙門菌危害性的認知日益增加，沙門菌的檢測技術(shù)也在不斷提高，目前國標法依然是金標準，但是其操作繁瑣、耗時長，不利于現(xiàn)場檢測。建立的新型檢測方法常具有一定的局限性，比如實時熒光PCR及生物傳感器的方法需要進行沙門菌培養(yǎng)，需要一定的培養(yǎng)時間。免疫層析試紙法與LAMP聯(lián)用的方法對于屠宰場沙門菌的快速檢測具有很大潛力，檢測范圍從食品到工業(yè)產(chǎn)品皆有涉及，未來對于LAMP技術(shù)仍需進一步研究，包括DNA的提取和現(xiàn)場檢測所需的存儲方法及樣品制備方法。

2.2 分子分型技術(shù)

快速分子分型技術(shù)可提供更快、更具區(qū)分性和更準確的沙門菌分型，克服了傳統(tǒng)血清分型的局限性[28]。其中包括脈沖場凝膠電泳(PFGE)、多位點序列分型(MLST)、多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)和全基因組測序(WGS)等幾種常用的方法。其中WGS分型具有的高通量、高準確性及卓越的鑒別力使其優(yōu)于其他分型方法，正迅速成為沙門菌分型的首選方法和金標準。PFGE主要是使用限制性內(nèi)切酶進行酶切，將DNA片段化，通過不斷改變電流方向(脈沖場)，將大片段鑲嵌在瓊脂糖凝膠上，使DNA按大小分離，為分離株生成特定的“指紋圖樣”。PFGE暫時不能實現(xiàn)自動化，還需高水平的專業(yè)操作技能，因此，通量不足會阻礙大批量試驗。MLST是利用Sanger測序技術(shù)對核苷酸序列進行測序的分型方法，主要是通過測序評估菌株中的7對“管家基因”的DNA變化來完成分型的。傳統(tǒng)的MLST比PFGE更快更便捷，但是鑒別力不高[29]。多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)是一種基于PCR的分型方法，起源于法醫(yī)學(xué)。MLVA可分析的沙門菌血清型是特定的，因此不同的沙門菌血清型需要不同的MLVA方案[30]。該方法只需常規(guī)的PCR步驟進行毛細管電泳，與PFGE相比，MLVA的勞動強度小，耗時少，更易執(zhí)行，而且減少病原菌的處理時間有利于大規(guī)模調(diào)查。但MLVA只能運用于特有的血清型，具有較大局限性，并且目標位點的快速進化可能會降低MLVA分析的準確性[31]。

全基因組測序(WGS)可捕獲單個微生物分離株中整個基因組的DNA序列變化。該數(shù)據(jù)可用于評估進化來準確描述分離株的遺傳相關(guān)性，使用WGS可對暴發(fā)調(diào)查和病原體來源追蹤中的沙門菌進行分型[32]。WGS可使用Illumina測序系統(tǒng)進行測序，后者是使用最廣泛的測序平臺之一。WGS技術(shù)的分析方法主要包括高質(zhì)量單核苷酸多態(tài)性分析(hqSNP)、全基因組多位點序列分型(wgMLST)和核心基因組多位點序列分型(cgMLST)等幾種[33]。hqSNP分析是指使用原始序列數(shù)據(jù)識別一組密切相關(guān)的分離株的SNP差異，這些數(shù)據(jù)被映射到參考基因組進行對比，hqSNP分析只對從祖先分離株垂直轉(zhuǎn)移到當(dāng)前分離株的SNP進行分析。wgMLST分析是利用單個基因組與數(shù)據(jù)庫的比較，該數(shù)據(jù)庫包含一組已知菌株(即血清型、亞種、種和屬)泛基因組的所有等位基因[34]。cgMLST方法與wgMLST方法相似，主要區(qū)別在于數(shù)據(jù)庫的大小和性質(zhì)。金宣辰[35]對來自生豬屠宰場的67株德爾卑沙門菌進行WGS分析，在基因組層面說明屠宰場中存在交叉污染，并且通過WGS分析結(jié)果找到了沙門菌的關(guān)鍵控制點。Kawakami等[36]對2次暴發(fā)的沙門菌流行病學(xué)數(shù)據(jù)進行WGS分析，證實了其高度相關(guān)，發(fā)現(xiàn)屠宰場的豬是鼠傷寒沙門菌單相變異株的主要來源。PulseNet(美國細菌分子分型國家電子網(wǎng)絡(luò))已經(jīng)將WGS定義為將要取代PFGE和MLVA的常規(guī)分子分型工具，PHE(世界衛(wèi)生組織公共衛(wèi)生部)已經(jīng)取消PFGE等分型方法開始使用“實時”WGS對沙門菌分離株進行分型[37]。Torpdahl等[38]對包括25種血清型的110株沙門菌進行了分子分型分析，結(jié)果顯示MLST區(qū)分為43個亞型，而PFGE區(qū)分為73個亞型，可見PFGE的分辨率要高于MLST；在另一項對52株腸炎沙門菌不同分子分型鑒別方法的研究中，PFGE結(jié)果是分為8個亞型，MLVA分為18個亞型，WGS分為34個亞型，PFGE、MLVA、WGS的區(qū)分力分別為0.81、0.92、0.97[39]，可見WGS具有最高的分辨力。隨著成本的持續(xù)下降和易用性的增加，WGS技術(shù)將越來越多地用于食品行業(yè)的污染事件調(diào)查，WGS分型對沙門菌的高分辨率有望提高在食品工業(yè)中追蹤和控制沙門菌污染的能力，并且成為公共衛(wèi)生當(dāng)局和食品監(jiān)管機構(gòu)的食品安全新標準。

3 生豬屠宰場的沙門菌防控措施

生豬定點屠宰場是不同地區(qū)出欄生豬及其產(chǎn)品的集散地，由于生豬的來源復(fù)雜、運輸應(yīng)激、高度集中等諸多因素，生豬定點屠宰場還是生豬傳染病的易發(fā)地，必須高度重視其傳染病的防控工作?，F(xiàn)階段屠宰場的防控多使用消毒劑和有機酸等便宜便捷有效的方法，其中消毒劑是屠宰場使用最廣泛的消毒方式，噬菌體作為生物抗菌劑有望在生豬屠宰環(huán)節(jié)使用，具有極大的發(fā)展前景。

3.1 消毒劑

有研究選擇愛爾蘭一家屠宰場對8種清潔及消毒方案消除和降低豬屠宰場待宰圈內(nèi)沙門菌的能力進行評估，結(jié)果顯示用季銨鹽類混合消毒劑和氯甲酚類消毒劑進行密集清洗后再晾干最有效[40]。Gosling等[41]調(diào)查了15種消毒劑對豬相關(guān)沙門菌的殺滅能力，結(jié)果顯示氯甲酚和戊二醛/甲醛產(chǎn)品對沙門菌的清除效果最好。羅薇[42]選用7種不同的消毒劑開展沙門菌消減能力評估試驗，結(jié)果顯示癸甲溴銨的效果較好。消毒劑的使用可有效地清除屠宰場的沙門菌，但是消毒劑的種類要經(jīng)常進行更換評估，防止沙門菌對消毒劑產(chǎn)生耐受性。在屠宰場中清洗和消毒可有效減少生豬圍欄地板和金屬桿上的空氣污染，但殘留的污染仍存在，清洗后使用消毒劑消毒并減少牲畜的休息時間，可有效減少空氣污染指數(shù)?？傊?，單靠高壓清洗不能有效地減少生豬屠宰場圍欄內(nèi)沙門菌的流行，配合使用消毒劑對屠宰場進行沙門菌的消減才是最便捷便宜的防控方法。

3.2 有機酸

有機酸已較多地應(yīng)用于屠宰場，與消毒劑不同，有機酸可噴淋于肉類表面達到消減沙門菌的目的。有研究評價了丙酮酸和琥珀酸對肉類中沙門菌的抑菌作用，結(jié)果顯示能有效降低沙門菌載量[43]。據(jù)調(diào)查，將乳酸與磷酸氫鈉組合可減少肉類中沙門菌的產(chǎn)生[44]。董璦榕等[45]探討了苯甲酸、富馬酸及其2種酸組合的復(fù)合酸對常見致病菌的體外抑菌效果，結(jié)果顯示有機酸對沙門菌等3種致病性菌具有明顯的體外抑菌活性。在屠宰場使用有機酸來消除病原菌被普遍認為是一種安全、有效的方法。

3.3 噬菌體

噬菌體是傳統(tǒng)抗菌劑的天然替代品，其可有效地控制食品工業(yè)中的細菌病原體的暴發(fā)及傳播，利用噬菌體進行食品工業(yè)中沙門菌的防治具有廣闊前景。據(jù)報道，噬菌體的應(yīng)用已成功減少了各種食品中沙門菌的數(shù)量。Whichard等[46]將沙門菌噬菌體Felix-O1接種于香腸中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌減少了2個對數(shù)單位?，F(xiàn)如今，通過將噬菌體與動物性食品和食品中的其他微生物結(jié)合起來，也可以提高噬菌體的效力，例如“噬菌體雞尾酒”。Spricigo等[47]將3種不同的噬菌體組成了一種噬菌體雞尾酒，對生豬皮膚上的腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌的生長進行了檢測，結(jié)果顯示對這2種沙門菌的殺菌率分別大于2lg cfu/cm2和4lg cfu/cm2。有研究報道，將噬菌體、乳酸鏈球菌素及山梨酸鉀組合使用可大量降低鮮豬肉上的沙門菌和其他腸桿菌[48]。為了能更廣泛的在食品工業(yè)中使用，應(yīng)該從不同角度去證明噬菌體的安全性及有效性，爭取早日將其大規(guī)模應(yīng)用于屠宰場沙門菌的防控。

總而言之，在生豬屠宰過程中，避免生豬之間的交叉污染并結(jié)合有效的消毒及清潔手段可有效地防止沙門菌污染，對禁食、運輸和洗滌條件嚴格評估可避免屠宰前生豬間的交叉污染。最重要的是對屠宰操作的標準化培訓(xùn)和嚴格執(zhí)行，是實現(xiàn)控制沙門菌污染的重要保證。

4 展望

屠宰和加工環(huán)節(jié)交叉污染現(xiàn)象較為普遍，加工裝備設(shè)施、加工媒介、加工過程、健康豬和病豬交叉接觸等造成嚴重的沙門菌污染，快速準確地檢測沙門菌對食品安全及食源性疾病的診斷至關(guān)重要。全基因組測序(WGS)正迅速成為沙門菌分型的首選方法和金標準，未來將會全面代替?zhèn)鹘y(tǒng)的分子分型方法?，F(xiàn)階段，生豬屠宰場多使用消毒劑作為防控手段，由于消毒劑種類繁多，對特定屠宰場進行防控需要對各種消毒劑進行評估才能得到最佳消毒劑及消毒措施，對于開發(fā)新型手段代替消毒劑用于屠宰場防控值得期待。