遼河口蘆葦濕地土壤氨氧化菌的時(shí)空變化

白 潔,董 曉,趙陽國* (.中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 26600；2.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 26600)

遼河口蘆葦濕地土壤氨氧化菌的時(shí)空變化

白 潔1,2,董 曉1,趙陽國1,2*(1.中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266100；2.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266100)

采用傳統(tǒng)的最大或然數(shù)法(MPN)和不依賴于培養(yǎng)的變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE),對遼河口蘆葦濕地土壤中AOB的豐度、多樣性進(jìn)行了解析,并試圖探究AOB同土壤可溶性鹽分等環(huán)境因素之間的關(guān)系.結(jié)果表明:蘆葦濕地土壤中AOB多樣性指數(shù)時(shí)空分布存在較大差異,同一月份中不同站點(diǎn)之間群落結(jié)構(gòu)相似性較大,AOB細(xì)菌數(shù)量與土壤可溶性鹽分之間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.05),與土壤總氮和有機(jī)

質(zhì)含量之間存在極顯著性正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01),表明鹽分、總氮和有機(jī)質(zhì)含量是遼河口濕地AOB數(shù)量時(shí)空分布的重要影響因素.

遼河口濕地；氨氧化菌(AOB)；可溶性鹽分；有機(jī)質(zhì)；總氮

硝化作用是氮素生物地球化學(xué)過程的重要環(huán)節(jié),是生態(tài)系統(tǒng)中氮素?fù)p失的潛在途徑[1],深入理解該過程對于探討濕地氮源污染的去除、濕地生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力以及氮素界面過程具有重要意義[2].氨氧化菌(AOB)參與氨氮到亞硝酸鹽的好氧氧化過程,是硝化作用的起始階段,也是硝化作用的限速步驟.因此,在濕地土壤環(huán)境中,氨氧化菌生產(chǎn)的亞硝酸鹽將會(huì)立即被亞硝酸鹽氧化菌氧化,使這些區(qū)域的亞硝酸鹽濃度保持較低水平

[3].運(yùn)用分子生物學(xué)變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)不僅能對可培養(yǎng)的微生物進(jìn)行分析,還可以對不可培養(yǎng)的微生物進(jìn)行研究,能更真實(shí)地反映系統(tǒng)中微生物種群的構(gòu)成和分布[4-5].

遼河三角洲濕地是我國最大的濱海河口濕地,具有豐富的生物多樣性.目前,對遼河河口濕地的相關(guān)研究主要集中在植物、動(dòng)物特別是鳥類研究方面,但對該地區(qū)土壤微生物方面的研究工作很少[6],尤其是硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)方面目前尚未見報(bào)道.本研究采用 PCR-DGGE法研究了遼河口濕地土壤中AOB在不同月份和不同.地理區(qū)域的分布特征和變化規(guī)律,并分析了 AOB數(shù)量和土壤總氮等環(huán)境因素之間的關(guān)系,以期為進(jìn)一步合理開發(fā)遼河口濕地的微生物資源,保障河口濕地的生態(tài)健康提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2009年6月、8月和10月,在遼河河口蘆葦濕地分別選取蘆葦長勢良好的未退化區(qū)(W1,121°47￠30.52E,41°09￠34.72N)、完全退化后進(jìn)行人工恢復(fù)且蘆葦生長較好區(qū)(W2, 121°36￠32.72E, 40°52￠06.72N)、完全退化后進(jìn)行人工恢復(fù)但蘆葦長勢較差區(qū)(W3,121°36￠22.42E, 40°52￠11.92N)、退化嚴(yán)重但無人為恢復(fù)區(qū)(W4, 121°36￠12.42E,40°52￠10.22N)、已完全退化為無植被生長區(qū)(W5,121°36￠08.02E,40°51￠53.42N)為采樣站點(diǎn).采集各站位表層(0～10cm)土壤,混勻后裝入滅菌封口袋中,低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室,部分樣品用于AOB計(jì)數(shù),部分樣品在室內(nèi)風(fēng)干用于土壤理化因子的測定,其余樣品在-20℃下冷凍保存,用于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析.

1.2 樣品測定

1.2.1 AOB計(jì)數(shù) 采用最大或然數(shù)法(MPN)[7]對土壤AOB進(jìn)行計(jì)數(shù).

1.2.2 土壤理化性質(zhì)測定 土壤總氮的測定采用凱氏定氮法[8];可溶性鹽分測定采用重量法[9];有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量法-外加熱方法[8];石油類含量測定采用紫外分光光度方法[10]進(jìn)行測定.

1.2.3 土壤 AOB的群落結(jié)構(gòu)分析 采用PCR-DGGE對土壤AOB的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析.土壤總基因組使用快速提取試劑盒(土壤基因組DNA提取試劑盒,北京百泰克生物技術(shù)有限公司),為了提高擴(kuò)增的專一性,采用巢式PCR進(jìn)行擴(kuò)增.第一輪采用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物BSF8/20:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',和BSR1541/20:5'-AAGGAGGTGATCCAGCC GCA-3'[11]進(jìn)行擴(kuò)增,獲得約1.5kb的目的條帶;第二輪采用 AOB特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增,上游為帶GC夾的CTO189f:5'-CGCCCGCCGCGCGGCG GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAGGAAA GTAGGGGATCG-3',下游引物為 CTO654r:5'-CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC-3'[12].PCR 25μL反應(yīng)體系:10×Buffer2.5μL,2.5mmol/LdNTP 4μL,5U/μLTaqDNA聚合酶0.25μL,0.05-1μg/μL模板 0.25μL,ddH2O補(bǔ)足 1到 25μL.擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性 5min,94℃變性 40s,54℃退火40s,72℃延伸2 min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min.采用1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢驗(yàn) .采用Bio-rad公司的突變檢測系統(tǒng)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析.聚丙烯酰胺變性梯度膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 6%,變性梯度為30%～50%,溫度6O℃,電壓150V,1×TAE緩沖液中電泳210min后,用EB染色液染色30min,水洗10min,然后立即在紫外照射儀上攝相.

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Gel-PRO ANALYZER軟件對DGGE指紋圖譜進(jìn)行定量分析,繪制 AOB數(shù)量分布特征圖;統(tǒng)計(jì)及聚類分析采用SPSS13.0軟件.

2 結(jié)果與分析

2.1 AOB數(shù)量的分布特征

圖1 蘆葦濕地土壤AOB數(shù)量分布Fig.1 Distribution of quantitiy of AOB in reed wetland

由圖1可見,6月AOB的數(shù)量在6.80×103～5.61×104個(gè)/g干土之間,平均(1.92±2.10)×104個(gè)/ g干土;8月1.44×104～8.37×104個(gè)/g干土之間,平均值為(3.20±2.92)×104個(gè)/g干土;10月1.47×103～4.04×104個(gè)/g干土之間,平均值為(9.52±1.72)× 103個(gè)/g干土.AOB數(shù)量的季節(jié)變化較大,主要表現(xiàn)為8月較高、6月次之、10月較低(圖 1).8月其平均值分別比6月和10月高出幾倍和一個(gè)數(shù)量級,主要與氣溫和其他環(huán)境因素有關(guān).8月環(huán)境溫度較高,且降雨量較大致使土壤含水率較高,有利于AOB的生長和繁殖[13].

蘆葦長勢良好的未退化區(qū)AOB數(shù)量明顯多于其他區(qū)域,主要與蘆葦?shù)母H效應(yīng)有關(guān)[14];嚴(yán)重退化區(qū)、無植被區(qū)與人工恢復(fù)區(qū)之間沒有明顯差異,可能與人工恢復(fù)時(shí)間較短,生態(tài)功能還未趨于穩(wěn)定或完全恢復(fù)有關(guān),也表明河口濕地生態(tài)功能的完全恢復(fù)滯后于生態(tài)結(jié)構(gòu)的恢復(fù).

2.2 土壤AOB數(shù)量與環(huán)境因子之間的關(guān)系

由表 1可見,土壤總氮含量平均值為(1.117± 0.015)g/kg,各月平均值分布中,8月最低,10月最高,6月次之,與AOB數(shù)量的分布相反;這可能因?yàn)?月較高的溫度增強(qiáng)了硝化反硝化微生物的活性

[15],土壤硝化反硝化速率較高,總氮去除率增大;并且 8月降雨增加,一部分總氮隨徑流流失,相關(guān)性分析結(jié)果顯示土壤總氮與AOB數(shù)量呈極顯著相關(guān)性(r=0.745,P＜0.01).有機(jī)質(zhì)通過對總氮的影響間接影響 AOB分布,對二者進(jìn)行相關(guān)性分析,兩者呈極顯著相關(guān)性(r=0.848,P＜0.01),這與呂國紅等

[16]、袁可能[17]對濕地土壤的研究結(jié)果一致.

本研究區(qū)域各站位土壤可溶性鹽分平均值在8.9g/kg左右,屬于鹽土.相關(guān)性分析結(jié)果顯示, AOB 數(shù)量與可溶性鹽分呈顯著負(fù)相關(guān)(r= -0.637),說明鹽分能夠影響微生物的活性.退化濕地土壤鹽分高、植被稀少、土壤容重較大、孔隙度小,可能導(dǎo)致微生物活性受到抑制,數(shù)量較少

[18].高鹽環(huán)境造成土壤滲透壓較高,細(xì)胞酶活性以及生命活動(dòng)受到抑制,也會(huì)導(dǎo)致其數(shù)量較低.

表1 遼河口濕地各站位主要環(huán)境因子Table 1 Main environmental factors in the sampling sites of Liaohe estuary weland

石油是遼河口濕地一種典型的污染物質(zhì),對于 AOB的數(shù)量分布有一定影響,但相關(guān)性不很顯著(r＝0.552,P＞0.05).

2.3 土壤AOB群落結(jié)構(gòu)及時(shí)空變化

圖2 土壤樣品DNA巢式擴(kuò)增后獲得的目的條帶Fig.2 Positive bands obtained from total soil DNA by nested PCR

將遼河口濕地不同區(qū)域土壤樣品提取的DNA經(jīng)過巢式 PCR擴(kuò)增后,獲得約 500bp的AOB目的條帶,結(jié)果見圖2,土壤DGGE圖譜見圖3,聚類分析結(jié)果見圖4.樣性,條帶信號(hào)的強(qiáng)弱反映菌群的相對數(shù)量,因此可以根據(jù)指紋信息確定不同樣品所含有的菌群分類單元(OTU)和數(shù)量關(guān)系,即細(xì)菌的多樣性信息[19].由圖3結(jié)果可見,隨著采樣時(shí)間和地點(diǎn)的不同,AOB數(shù)量呈現(xiàn)明顯的差異.

圖3 16S rDNA片段DGGE指紋圖譜Fig.3 DGGE profiles of 16S rDNA fragments

AOB群落結(jié)構(gòu)和種類數(shù)表現(xiàn)出明顯的時(shí)間和空間差異.不同站位在同一季節(jié)細(xì)菌種類數(shù)表現(xiàn)出差異,并且條帶信號(hào)強(qiáng)弱明顯,說明 AOB的相對數(shù)量也不相同;同一站位不同月份的種數(shù)也不相同,既有某些種群的消失,也有新種群的出現(xiàn).b1、b2為本區(qū)域的優(yōu)勢菌群,除10月W3、W1站點(diǎn)外,其他皆有b1、b2的分布;10月除W2站點(diǎn)外,其余條帶數(shù)明顯少于8月,這可能與氣溫降低、土壤濕度減小及營養(yǎng)物質(zhì)氨氮的減少等因素有關(guān);8月各站位條帶亮度明顯較強(qiáng),顯示AOB相對數(shù)量較6月和10月多,與MPN法測得的AOB數(shù)量分布基本一致,主要與夏季氣溫升高等因素有關(guān);在 8月份 W4站點(diǎn)出現(xiàn)了新的種群b5,W1站點(diǎn)的b3、b4條帶亮度明顯大于其他月份,表明遼河口濕地的硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨時(shí)間和空間的不同存在明顯差異(圖3).

圖4 AOB菌群的DGGE圖譜UPGMA聚類分析Fig.4 UPGMA cluster analysis of DGGE profiles

不同站位不同月份的AOB種群相似性有所不同,總體分為3大族,同一地理區(qū)域不同時(shí)間的AOB菌群的相似性值較低,而同一月份不同地理空間的菌群的相似性較高,其中,8月的W3和W5站位,W2和W4站點(diǎn)之間具有很高的相似性,相似度接近98%;6月的W4和W5站位之間也幾乎達(dá)到95%(圖4),這與Cébron等[20]的研究結(jié)果不同,Cébron對塞納河的水體進(jìn)行研究,指出即使溫度在不同的季節(jié)間變化劇烈,AOB群落結(jié)構(gòu)仍保持時(shí)間的穩(wěn)定性;Roey等[21]對一個(gè)沙漠中季節(jié)性河流研究也發(fā)現(xiàn),以時(shí)間為尺度,AOB種群多樣性類型在大部分情況下是穩(wěn)定的,只是在不同季節(jié)間檢測到很小的變化;這說明不同緯度帶不同介質(zhì)中 AOB種群變化規(guī)律不同.遼河口濕地不僅氣溫變化劇烈,而且土壤含水率、營養(yǎng)狀況等土壤理化性質(zhì)隨季節(jié)也在劇烈地變化,導(dǎo)致同一區(qū)域AOB種群相似性隨季節(jié)發(fā)生較大變化;可見,不同生態(tài)環(huán)境土壤中 AOB相似性有較大差別,在含鹽量較高的遼河口濕地,其植被的不同生長期環(huán)境條件變化很大,對 AOB群落結(jié)構(gòu)的影響也較大,表明 AOB在不同季節(jié)的生態(tài)作用有所不同.

圖 5為各站位 DGGE圖譜的 Shannon-Weiner指數(shù)H′,由下式計(jì)算:

式中:H′為多樣性指數(shù);ni為第 i個(gè) OTU的個(gè)數(shù);ni/N第i個(gè)OTU的個(gè)數(shù)占文庫序列的百分?jǐn)?shù).

圖5 6、8和10三個(gè)月份各個(gè)站點(diǎn)AOB菌群的多樣性指數(shù)分布Fig.5 Diversity index of AOB at sampling sites in June,August and October

從圖5中可以看出,其多樣性指數(shù)在不同月份存在明顯變化,可見植被生長狀態(tài)對 AOB種群的多樣性有明顯影響.8月,蘆葦未退化區(qū)以及人工恢復(fù)較好區(qū)的AOB多樣性指數(shù)均大于其他區(qū)域,原因能與植物根際分泌物對微生物種群多樣性產(chǎn)生的影響有關(guān).有研究發(fā)現(xiàn),根際微生物種群多樣性減少是普遍現(xiàn)象,植物根系分泌物的不同成分控制了微生物種群數(shù)量[22].此外可能跟土

壤中氧氣受限有關(guān),實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn),8月蘆葦濕地處于淹水狀態(tài),上覆水阻斷了空氣中氧向沉積物的擴(kuò)散,致使無植被生長區(qū)和植被生長較差區(qū)域的好氧性 AOB種群多樣性和數(shù)量都大大下降,而植被生長較好區(qū)域則通過植被的光合作用泌氧并傳導(dǎo)到土壤中,而8月中旬以后,此區(qū)域降雨量減少,蘆葦濕地上覆水逐漸退去,土壤通氣狀況的改善及總氮含量的恢復(fù),為 AOB種群多樣性的增加提供可能.蘆葦生長較好的W1樣點(diǎn),6月AOB種群多樣均小于8月,與硝化菌群最適宜在25～30℃生長繁殖有關(guān)[23],且 6月總氮含量普遍高于8月,不同月份土壤含水率也有較大差別,這對于AOB種群多樣性都有一定影響.

3 結(jié)論

3.1 河口濕地生態(tài)功能的完全恢復(fù)滯后于生態(tài)結(jié)構(gòu)的恢復(fù),影響 AOB數(shù)量的主要因素是植被狀態(tài)、土壤可溶性鹽分、有機(jī)質(zhì)和總氮含量.

3.2 AOB群落多樣性指數(shù)在時(shí)間和空間上存在明顯差異,植被狀態(tài)和環(huán)境條件是影響 AOB群落多樣性的主要因素.

3.3 植被的生長期環(huán)境條件對 AOB群落結(jié)構(gòu)的影響較大.

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Characteristics of temporal and spatial distribution of ammonia-oxidizing bacteria in Liaohe Estuary wetland soil.

BAI Jie1,2, DONG Xiao1, ZHAO Yang-Guo1,2*(1.College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China；2.Key Laboratory of Marine Environmental Science and Ecology,Ministry of Education, Qingdao 266100, China). China Environmental Science, 2011,31(11)：1870～1874

The nitrification from ammonia to nitrate is a rate-limiting step mediated by ammonia-oxidizing bacteria (AOB). The abundances and diversity of AOB in the soil of reed wetland of Liaohe Estuary were investigated by the most probable number (MPN) method and the denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) technique,and the relationship between AOB abundances and environmental factors, such as soluble salt, was further explored. The results indicated that the temporal and spatial distribution of the AOB diversity was different, and the bacterial community on the different sites was more similar in same month. The quantity of AOB and the concentration of soluble salt presented notable negative correlation(P＜0.05), while the quantity of AOB and soil total nitrogen and organ matter presented a significant positive correlation (P＜0.01). It concluded that the soluble salt, soil total nitrogen and orgaic matter had an important influence on the quantity of AOB in Liaohe Estuary wetland.

Liaohe Estuary wetland；ammonia-oxidizing bacteria (AOB)；soluble salt；organic matter；total nitrogen

X172

A

1000-6923(2011)11-1870-05

2011-01-30

國家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(2008ZX07208-009)

* 責(zé)任作者, 教授, baijie@ouc.edu.cn

作者簡價(jià)：白 潔(1962-),女,陜西神木人,教授,碩士,主要從事微生物生態(tài)學(xué)研究.發(fā)表論文50余篇.