干擾骨髓基質(zhì)細(xì)胞 Hes1基因?qū)ash1基因表達(dá)的影響

龍志晶 王春芳＊ 李鵬飛 劉彩玉 鄧春圣 呼鐘理

干擾骨髓基質(zhì)細(xì)胞 Hes1基因?qū)ash1基因表達(dá)的影響

龍志晶1王春芳1＊李鵬飛1劉彩玉1鄧春圣2＊呼鐘理3

(1山西醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)教研室,太原030001;2中國(guó)人民解放軍第322醫(yī)院,山西大同037006;3太原市中醫(yī)醫(yī)院,太原030002)

目的 觀察對(duì)體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞 Hes1基因干擾后Mash1基因的表達(dá)變化。方法 采用全骨髓培養(yǎng)法體外分離培養(yǎng)獲得骨髓基質(zhì)細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)變化,應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析在干擾 Hes1基因表達(dá)的情況下Mash1基因表達(dá)的變化。結(jié)果 應(yīng)用200nM,100nM,50nM,25nM四種不同濃度梯度的Hes1的siRNA干擾抑制Hes1基因,與對(duì)照組相比 Hes1表達(dá)均降低。200nM干擾后 Hes1基因降低的程度是原來(lái)的0.036(P<0.05),50nM干擾后 Hes1基因降低的程度是原來(lái)的0.076(P<0.05),優(yōu)于其他濃度的干擾效果。Hes1降低可使Mash1基因表達(dá)增加,且 Hes1降低越顯著,Mash1表達(dá)增加越高。結(jié)論 體外培養(yǎng)BMSCs過(guò)程中干擾Hes1基因?qū)ash1基因的表達(dá)有影響,且呈負(fù)相關(guān)調(diào)控關(guān)系。

骨髓基質(zhì)細(xì)胞; 基因表達(dá); Hes1基因; Mash1基因; RNAi

在成體非神經(jīng)組織源性神經(jīng)干細(xì)胞研究中,骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是近年來(lái)干細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),其具有干細(xì)胞自我更新、高度增殖能力和多向分化的潛能。有研究發(fā)現(xiàn)BMSCs在體內(nèi)外特定條件下可以向多種間質(zhì)細(xì)胞分化[1,2],還可以分化為神經(jīng)元細(xì)胞[3]。因此,其又稱(chēng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)干細(xì)胞(bone marrowderived neural stem cells)[4]。目前,BMSCs已成為一種理想的種子細(xì)胞,在神經(jīng)再生領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景,但其定向分化為神經(jīng)元的分子調(diào)控機(jī)制仍不清楚。神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因Hes1和Mash1基因?qū)儆赽 HL H蛋白家族,研究發(fā)現(xiàn),它們廣泛表達(dá)于發(fā)育中的外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)[5]。Hes1(Hairy and enhancer of split 1)在維持神經(jīng)干細(xì)胞增殖,分化為適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞及分化的多樣性方面具有重要的作用;Mash1(Mammalian achaete-scute homolog 1)作為其下游基因,參與了神經(jīng)前體細(xì)胞的產(chǎn)生以及促進(jìn)這些多潛能前體細(xì)胞向不同類(lèi)型的神經(jīng)元分化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò) RNAi技術(shù)在體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs中干擾 Hes1基因的表達(dá),觀察Mash1基因的表達(dá)變化,了解在體外培養(yǎng)的BMSCs中 Hes1和Mash1兩者之間的關(guān)系。

材料和方法

1.試劑

B27(Sigma),DMEM(Gibco),Opti-MEM(Sigma),LipofectimineTM2000 Reagent(Sigma),siRNA(Sigma),胎牛血清(杭州四季青公司),RT-PCR試劑(Takara),CD71山羊抗大鼠一抗(BOSTER),FITC標(biāo)記的兔抗山羊二抗(BOSTER),超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司,SW-CJ-1FD),低溫高速離心機(jī)(美國(guó) Heraeus),CO2培養(yǎng)箱(美國(guó) Thermo Forma,3100),高壓蒸汽消毒器(北京市永光明醫(yī)療儀器廠,GMSX-280),PCR擴(kuò)增儀(美國(guó) ABI,7300),相差顯微鏡(日本OL YMPUS,CK40)。

2.大鼠BMSCs的培養(yǎng)與鑒定

將120 g左右的雄性 Wistar大鼠腹腔注射1 ml肝素后,10%水合氯醛(0.4ml/100g)麻醉,用75%乙醇浸泡大鼠消毒10分鐘,無(wú)菌條件下取出大鼠的股骨和脛骨,分別剪去股骨和脛骨的兩端,用D-Hanks液沖洗骨髓腔2～3次,將提取的骨髓反復(fù)抽吸并制成細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞懸液并轉(zhuǎn)移至15 ml的離心管中,玻璃滴管吹打成單細(xì)胞懸液,1000 r/min,離心5 min后棄上清;將細(xì)胞沉淀用含10%胎牛血清的DM EM培養(yǎng)基懸浮,接種在六孔培養(yǎng)板中,在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)進(jìn)行原代培養(yǎng);3 d后更換培養(yǎng)液,除去未貼壁細(xì)胞,以后每3 d換液一次,待原代培養(yǎng)的細(xì)胞70%以上匯合時(shí),用含0.25%胰酶的消化液消化細(xì)胞,并按1:2進(jìn)行傳代培養(yǎng);傳至第三代,用CD71免疫熒光技術(shù)鑒定細(xì)胞。

3.siRNA干擾

將新鮮傳至P3代細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1～2天,用胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù),使其在轉(zhuǎn)染日密度為70～90%,細(xì)胞鋪板在2 mlOpti-MEM培養(yǎng)基中;分別使用250μl Opti-M EM 稀釋 siRNA 和 5μl的LipofectimineTM2000 Reagent試劑,室溫孵育5分鐘后,混合稀釋的siRNA和稀釋的LipofectimineTM2000 Reagent試劑,室溫孵育20分鐘;將復(fù)合物加入到每孔中,使 siRNA終濃度分別為200nM,100nM,50nM,25nM;6小時(shí)后更換為含血清含抗生素的正常培養(yǎng)基,在37℃的CO2孵箱中保溫72小時(shí)。

4.總RNA的提取

分別收集未進(jìn)行RNA干擾組和RNA高濃度干擾組、低濃度干擾組細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照,每孔細(xì)胞用1ml RNAiso Reagent試劑(Ta KaRa)按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作提取總 RNA,并用紫外分光光度計(jì)定量(D260/D280=1.8～2.0)。

5.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) Hes1和Mash1的表達(dá)

第一步:對(duì)提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系 10μl中含:2μg 總 RNA、1mMdNTP、5×M-MLV buffer、10 U RNase Inhibitor、50 μM Oligo(d T)、RTaseM-MLV(RNase H-)50 U。42℃反應(yīng)1h后,70℃保溫15 min冰上冷卻,將所得cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第二步:實(shí)時(shí)熒光定量 PCR:用ABI公司的引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Express設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的 Hes1、Mash1和18S r RNA引物。以實(shí)時(shí)熒光定量PCR來(lái)檢測(cè)未干擾及用不同濃度siRNA干擾 Hes1后Mash1表達(dá)變化情況,18s為內(nèi)參照。20μl的反應(yīng)體系包括:10μl的 2 ×SYBR Green Master Mix(ABI公司的 SYBR Green試劑盒),10μM 的上下游引物各 1μl,1 ul cDNA。在 ABI 7300型定量 PCR儀上以下列條件進(jìn)行擴(kuò)增:95℃10 min,95℃15 S,60℃1 min,循環(huán) 40次(表 1)。采用比較 CT值法,應(yīng)用 RQ study軟件(Applied Biosystems)進(jìn)行miRNAS的相對(duì)定量分析。

表1 Hes1,Mash1,18Sr RNA基因的引物序列Table 1 Primer sequences of Hes1,Mash1,18Sr RNA for Real-time PCR

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析,多組間指標(biāo)的比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA),LSD檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.分離培養(yǎng)BMSCs的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

經(jīng)分離的骨髓細(xì)胞懸液培養(yǎng)3d后全量換液,去除未貼壁細(xì)胞,可見(jiàn)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞大部分呈梭形,呈旋渦狀生長(zhǎng),少部分呈多角形,細(xì)胞核居中,折光性強(qiáng)。貼壁細(xì)胞呈單層生長(zhǎng),生長(zhǎng)迅速,細(xì)胞呈團(tuán)簇狀,分布不均,顯示出集群生長(zhǎng)趨勢(shì)。之后細(xì)胞相互間漸緊密貼附,呈條索狀匯合。7d左右細(xì)胞達(dá)到70%以上的匯合。P3以后的細(xì)胞形態(tài)較為均一(圖1)。傳代細(xì)胞形態(tài)呈多角形,隨著傳代次數(shù)增加,細(xì)胞突起增多。P3的細(xì)胞經(jīng)免疫熒光鑒定CD71表達(dá)陽(yáng)性(圖2)。

2.干擾 Hes1后Mash1的表達(dá)變化

實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:Hes1基因和Mash1基因在 BMSCs P3中都有表達(dá),分別用200nM,100nM,50nM,25 nM四組不同濃度的siRNA對(duì) Hes1干擾后,Hes1基因表達(dá)均有所下降,200 nM和50 nM濃度組降低最顯著,認(rèn)為以上四組不同濃度的siRNA與對(duì)照組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明 Hesl基因沉默成功。高濃度(200nM)干擾組的 siRNA對(duì) Hes1表達(dá)減弱以及Mash1表達(dá)增加的效果優(yōu)于低濃度(50nM)干擾組,基于以上結(jié)果,我們選擇200 nM和50 nM濃度組的siRNA用于檢測(cè)Mash1基因的表達(dá),結(jié)果顯示Mash1基因表達(dá)均有所增高。因此,我們認(rèn)為經(jīng)200nM和50nM的siRNA干擾Hes1后檢測(cè)Mash1基因的表達(dá)變化與對(duì)照組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

BMSCs是一種具有多分化潛能的干細(xì)胞,在體內(nèi)外特定條件下可以橫向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[6]。在課題組的前期實(shí)驗(yàn)中,我們分析了Hes1基因和Mash1基因在BMSCs中誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元過(guò)程中的表達(dá)變化情況,得出 Hes1在BMSCs表達(dá)較高,Mash1在BMSCs表達(dá)較低的結(jié)論[7]。Nakamura等的研究表明,Hes1-/-的小鼠過(guò)早地表達(dá)了早期和晚期的神經(jīng)元標(biāo)志,說(shuō)明 Hes1在維持神經(jīng)干細(xì)胞的增殖方面發(fā)揮了重要的作用[8]。Mash1作為 Hes1的下游基因,短暫性地表達(dá)于小鼠早期發(fā)育的神經(jīng)系統(tǒng)中,同時(shí)還是各器官在胚胎發(fā)育過(guò)程中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子。另外,Mash1還能夠促使神經(jīng)前體細(xì)胞產(chǎn)生以及促進(jìn)這些多潛能前體細(xì)胞向不同神經(jīng)元類(lèi)型分化[9]。因此我們觀察了干擾Hes1基因后下游基因Mash1的表達(dá)變化情況,以期了解 Hes1和Mash1兩者之間的關(guān)系。

在Bai等人的實(shí)驗(yàn)中曾使用100nM的siRNA干擾Hes1,經(jīng) siRNA轉(zhuǎn)染后的神經(jīng)干細(xì)胞 Hes1基因表達(dá)顯著降低[10]。因此,本實(shí)驗(yàn)過(guò)程采用四種不同濃度梯度的 Hes1的siRNA干擾抑制BMSCs中 Hes1基因的表達(dá),終濃度分別為 200nM,100nM,50nM,25nM的 siRNA,得出 200nM和50nM干擾效果最好的結(jié)論,但考慮到經(jīng)濟(jì)成本,我們推薦使用50nM的siRNA。故本實(shí)驗(yàn)選定的最適濃度可以成為今后干擾試驗(yàn)的參考濃度。

Hes1和Mash1基因均屬于b HL H轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族基因,該家族參與了動(dòng)物體內(nèi)許多器官的發(fā)育過(guò)程,并發(fā)揮了重要的作用[11-13]。因此在本實(shí)驗(yàn)中,我們選用終濃度為200nM和50nM的siRNA干擾組進(jìn)一步檢測(cè)Mash1的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)干擾Hes1基因的表達(dá),Mash1基因的表達(dá)較干擾前增高。課題組前期實(shí)驗(yàn)證明,在BMSCs的培養(yǎng)過(guò)程中,隨著傳代次數(shù)的增加,Hes1的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì),而Mash1則逐漸上升,誘導(dǎo)分化后 Hes1較未誘導(dǎo)組降低,Mash1增高[7],與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中Hes1,Mash1變化趨勢(shì)相同。據(jù)報(bào)道,Hes1高表達(dá)于神經(jīng)干細(xì)胞中,在胚胎時(shí)期 Hes1的缺失可導(dǎo)致胚胎發(fā)育缺陷[14]。Mash1在神經(jīng)元分化及神經(jīng)元特定亞型選擇性分化中發(fā)揮中心調(diào)控作用[15]。Alexandros等證實(shí),降低 Hes1,Mash1 mRNA的降解率可影響神經(jīng)細(xì)胞分化的進(jìn)程[16]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在利用RNAi技術(shù)使 Hes1表達(dá)下調(diào)后,Mash1表達(dá)較未干擾組顯著上調(diào),由此我們認(rèn)為 Hes1和Mash1基因在BMSCs的培養(yǎng)過(guò)程中可能有重要作用,并且 Hes1對(duì)Mash1呈負(fù)相關(guān)調(diào)控關(guān)系。

研究中我們通過(guò)對(duì)BMSCs培養(yǎng)過(guò)程中 Hes1基因的人為干擾,運(yùn)用RNAi技術(shù)干擾發(fā)育調(diào)控基因 Hes1,同時(shí)利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)在BMSCs傳代中,Mash1的表達(dá)變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:成功地抑制 Hes1基因的表達(dá),Mash1基因的表達(dá)較干擾前增高,Hes1和Mash1兩者之間呈負(fù)調(diào)控關(guān)系。因此本實(shí)驗(yàn)可為了解BMSCs的分化機(jī)制提供了一個(gè)新的思路,也有助于對(duì)定向誘導(dǎo)分化關(guān)鍵因素的篩選與確定。在今后的實(shí)驗(yàn)中,我們還可以把干擾作為一種誘導(dǎo)手段應(yīng)用于BMSCs的誘導(dǎo)分化。

[1]Makino S,Fukuda K,Miyoshi S,et al.Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro.J Clin Invest,1999,103(5):697-705

[2]Kopen GC,Prockop DJ,Phinney DG.Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum,and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains.Proc Natl Acad Sci U S A,1999,96(19):10711-10716

[3]Johansson CB,Momma S,Clarke DL,et al.Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system.Cell,1999,96(1):25-34

[4]徐如祥.神經(jīng)干細(xì)胞.北京:軍事醫(yī)學(xué)出版社,2006:44-51

[5]Kageyama R,Ohtsuka T,Hatakeyama J,et al.Roles of b HL H genes in neural stem cell differentiation.Exp Cell Res,2005,306(2):343-348

[6]Mckay R.Stem cells in the central nervous system.Science,1997,276(5309):66-71

[7]蔚洪恩,王春芳,李鵬飛,等.骨髓基質(zhì)細(xì)胞在傳代與誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞過(guò)程中hes1和mash1基因的表達(dá)變化.解剖學(xué)雜志.2007,30(5):526-529

[8]Nakamura Y,Sakakibara S,Miyata T,et al. The b HL H gene hes1 as a repressor of the neuronal commitment of CNS stem cells.J Neurosci,2000,20(1):283-293

[9]Hamada M,Yoshikawa H,Ueda Y,et al.Introduction of the MASH1 gene into mouse embryonic stem cells leads to differentiation of motoneuron precursors lacking Nogo receptor expression that can be applicable for transplantation to spinal cord injury. Neurobiol Dis,2006,22(3):509-522

[10]Bai G,Sheng N,Xie Z,et al.Id proteins sustain Hes1 expression to maintain neural stem cells. Cell Research,2008,18:s19

[11]Greenbaum S,Zhuang Y.Regulation of early lymphocyte development by E2A family proteins.Semin Immunol,2002,14(6):405-414

[12]Kageyama R,Ohtsuka T,Hatakeyama J.Roles of b HL H genes in neural stem cell differentiation.Exp Cell Res,2005,306(2):343-348

[13]Chien CT,Hsiao CD,Jan L Y,et al.Neuronal type information encoded in the basic-helix-loop-helix domain of proneural genes.Proc Natl Acad Sci U S A,1996,93(23):13239-13244

[14]Ohtsuka T,Ishibashi M,Gradwohl G,et al.Hes1 and Hes5 as Notch effectors in mammalian neuronal differentiation.EMBO J,1999,18(8):2196-2207

[15]Yamamoto S,Nagao M,Sugimori M,et al.Transcription factor expression and Notch-dependent regulation of neural progenitors in the adult rat spinal cord.J Neurosci 2001,21(24):9814-9823

[16]Alexandros Kiparissides,Michalis Koutinas,Toby Moss,et al.Modelling the Delta1/Notch1 Pathway:In Search of the Mediator(s)of Neural Stem Cell Differentiation.PLo SONE,2011,6(2):e14668

The expression of Mash1 after the inhibition of Hes1 gene in BMSCs

Long Zhijing1,Wang Chunfang1＊,Li Pengfei1,Liu Caiyu1Deng Chunsheng2＊,Hu Zhongli3
(1Department of Biotechnology,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001;2The 322nd Hospital of PLA,Datong Shanxi 037006;3Taiyuan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Taiyuan 030002,China)

Objective To explore the expression of Mash1 after the inhibition of the Hes1 gene in BMSCs.Methods BMSCs isolated f rom bone marrow were cultured in vitro.The morphologic feature and growth status of BMSCs and differentiated BMSCs were observed by inverted microscopy.The expression of Mash1 was analyzed by real-time quantitative PCR.Results The concentrations of Hes1 siRNA were 200nM,100nM,50nM or 25nM.The expression of Hes1 was decreased in comparison with that of the control group.The level of Hes1 at the concentration of 200nM in interfered BMSCs was 0.036-fold of that in control BMSCs(P<0.05),and the level of Hes1 at 50nM in interfered BMSCs was 0.076-fold of that in control BMSCs(P<0.05),both better than the others.The expression of the Mash1 gene was increased after the inhibition of the Hes1 gene in a dose-dependent manner.Conclusion Hes1 can down-regulate the expression of the Mash1 gene in BMSCs.

Bone marrow stromal cell; Gene expression; Hes1; Mash1; RNAi

R322.812

A

10.3870/zgzzhx.2011.03.011

2010-11-10

2011-04-01

山西省自然科學(xué)基金(2009011057-1);中國(guó)人民解放軍第322醫(yī)院自然科學(xué)基金(2011001)

龍志晶,女(1983年),漢族,碩士研究生。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)