家蠶病毒病防治研究進(jìn)展

邵榆嵐，白興榮，黃 平

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自661101）

家蠶病毒病是養(yǎng)蠶生產(chǎn)上最普遍、危害最嚴(yán)重的一類傳染性疾病，在各個(gè)養(yǎng)蠶季節(jié)均可發(fā)生，特別是夏秋季節(jié)，因環(huán)境條件、飼養(yǎng)管理、蠶體體質(zhì)等因素稍有不慎都可發(fā)生病毒病。生產(chǎn)中常見的家蠶病毒病多為核型多角體病、質(zhì)型多角體病、病毒性軟化病、膿核病4類?，F(xiàn)將家蠶病毒病防治研究進(jìn)展介紹如下。

1 早期診斷

不同蠶病都有不同的病癥表現(xiàn)，發(fā)病時(shí)肉眼觀察可初步判別其所屬蠶病種類，若此時(shí)才采取措施阻止蔓延，往往為時(shí)已晚，難以控制。因此，早期鑒別診斷是防止家蠶病毒病擴(kuò)散的有效措施。

1.1 血清學(xué)檢測技術(shù)

在家蠶病毒病的血清學(xué)診斷中，用已知抗體檢查蠶體內(nèi)是否存在相應(yīng)抗原，從而判斷蠶是否被某種病毒感染，其優(yōu)越性就是可以在病毒感染早期作出判別。

限于中國農(nóng)村經(jīng)濟(jì)條件與科學(xué)文化水平不高等原因，多數(shù)家蠶病毒病診斷方法僅停留在實(shí)驗(yàn)室，未能應(yīng)用于農(nóng)村生產(chǎn)。目前，根據(jù)農(nóng)村養(yǎng)蠶生產(chǎn)實(shí)際條件，時(shí)連根等人已制作出簡易實(shí)用的“家蠶病毒病血清學(xué)診斷盒”，選擇雙向免疫瓊脂擴(kuò)散法并結(jié)合混合抗血清，建立了在農(nóng)村檢測診斷家蠶病毒病的方法與技術(shù)。它能特異、靈敏、快速地檢測診斷出蠶體、蠶室、蠶具中的核型多角體病毒（NPV）、皮質(zhì)多角體病毒 （CPV）和膿核病毒 （DNV），檢出率高達(dá)76.5%。不僅能有效預(yù)防農(nóng)村養(yǎng)蠶生產(chǎn)上病毒病的發(fā)生流行，而且對大規(guī)模開展農(nóng)村蠶病調(diào)查、流行病學(xué)研究等都具有重大的實(shí)際意義[1]。

1.2 PCR檢測技術(shù)

PCR又稱聚合酶鏈反應(yīng)，可在體外使基因組的某個(gè)部分短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增幾百萬倍，已廣泛應(yīng)用于遺傳病診斷、病原體核酸序列、法醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)鑒定以及癌基因突變研究，并應(yīng)用于DNA分析和分子克隆[2]，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省時(shí)等特點(diǎn)。近年來，PCR檢測技術(shù)開始應(yīng)用于家蠶病毒病檢測，涂納新等人應(yīng)用PCR技術(shù)檢測家蠶核型多角體病毒，從患病家蠶血淋巴中抽提總DNA，根據(jù)病毒基因組序列設(shè)計(jì)一對特異性引物在體外擴(kuò)增，如果產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中有特異性條帶，則判定為感病。此外，通過感染病毒病的家蠶不同組織中檢測出陽性反應(yīng)時(shí)間的不同證明傳染途徑的不同和發(fā)病快慢的不同[3]。PCR檢測技術(shù)因其成本高，操作不便，在蠶病早期診斷的應(yīng)用不多，一般只應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室或質(zhì)檢機(jī)構(gòu)。

2 防治方法

2.1 高溫治療

日本學(xué)者井上元于1976年對感染病毒病的家蠶進(jìn)行高溫處理，研究其對病毒病的抑制作用。井上之分別用病毒性軟化病病毒（FV）和CPV病毒的致死劑量[FV（0.1/ml）和CPV（CP107／ml）]對蟻蠶和4齡起蠶添食接種，27℃飼養(yǎng)并在2～5齡各蛻皮期分別用37℃高溫處理，采用各種免疫化學(xué)方法研究高溫療效。結(jié)果表明，感染FV的家蠶在27℃下飼養(yǎng)，全部發(fā)病斃死；經(jīng)37℃高溫處理24h結(jié)繭率65%～95%。感染CPV的家蠶以27℃飼養(yǎng)，中腸病變明顯，發(fā)病斃死。經(jīng)37℃高溫處理24h、48h，有50%蠶結(jié)繭；37℃高溫處理72h，結(jié)繭率高達(dá)90%[4]。此外，余國東的研究也表明，高溫處理的適期是眠中至蛻皮12h，效果最為顯著，可能是因?yàn)楦邷乜勺璧K細(xì)胞質(zhì)多角體的形成，同時(shí)被病毒感染的中腸細(xì)胞在幼蟲蛻皮期向組織外脫落，從而填補(bǔ)了新生細(xì)胞[5]。

2.2 藥物添食

2.2.1 抗病毒藥劑

從家蠶病毒病的治療來看，用于臨床治療的藥劑并不多，原因可能是抑制病毒增殖的藥物對宿主也有毒性，難以實(shí)用化。盡管如此，家蠶病毒病的藥劑治療研究還是取得了一定的進(jìn)展。據(jù)報(bào)道5-氟尿嘧啶等尿嘧啶代謝類似物可作為抗病毒藥劑，有效濃度為5×10-4～5×10-5mol/L的5-氟尿嘧啶可使病毒性軟化病的發(fā)病率降低20%～30%；9-氨基乳酸吖啶能使核型多角體病的發(fā)病率降低30%～60%；烷基化5’-鳥嘌呤核苷酸能使蠶對NPV的抗性提高1000倍以上；萘啶酸銅對家蠶核型多角體病和病毒性軟化病的發(fā)病率有明顯抑制作用，但對質(zhì)型多角體病無效；胍對病毒性軟化病有一定的治療作用；果糖嗪對核型多角體病、質(zhì)型多角體病、病毒性軟化病的發(fā)生有一定的抑制作用。一些對家蠶病毒病治療有效的藥物[6～9]已經(jīng)投放市場，但在生產(chǎn)實(shí)際中卻未得到普通認(rèn)可。

2.2.2 抗菌藥物

國內(nèi)外研究證實(shí)，家蠶病毒病的發(fā)生與腸道細(xì)菌有密切關(guān)系。細(xì)菌病的發(fā)生會導(dǎo)致蠶體虛弱，降低對病毒病的抵抗能力。CPV與腸桿菌能同時(shí)感染圓筒狀細(xì)胞引起發(fā)病。FV與細(xì)菌混合接種，發(fā)病率比單獨(dú)接種明顯增加，單獨(dú)接種FV發(fā)病率很低或不發(fā)病，而細(xì)菌的存在會明顯提高病毒性軟化病的發(fā)病率。目前有效的應(yīng)對措施就是使用抗菌素。蠶期中添食諾氟沙星（氟哌酸）對抑制蠶體內(nèi)細(xì)菌的繁殖、降低死亡率和病毒感染率、保持蠶兒發(fā)育整齊和推遲發(fā)育時(shí)間等都有顯著效果[10]。以鹽酸環(huán)丙沙星為主要成分的蠶用鹽酸環(huán)丙沙星膠囊的預(yù)防用量（100mg/kg）和治療用量（150mg/kg），效果優(yōu)于氯霉素、紅霉素，且使用方便，安全可靠，可作為防治家蠶細(xì)菌病的理想藥物[11]。朱方容等人在多種抗菌藥物比較試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，蠶服康1號的治療效果最優(yōu)，其次為新藥B[12]。余柳濤等人的試驗(yàn)結(jié)果表明，中國農(nóng)科院蠶業(yè)研究所生產(chǎn)的亞迪蠶豐對預(yù)防家蠶細(xì)菌病的效果比鹽酸諾氟沙星好，與鹽酸環(huán)丙沙星相當(dāng)[13]。實(shí)際上，抗菌素對家蠶病毒病無直接作用，使用不當(dāng)反而對蠶造成潛在威脅，應(yīng)避免濫用。

2.3 弱毒苗

弱毒苗是家禽疾病免疫防治用的1種生物制劑。它與強(qiáng)毒苗的根本區(qū)別在于前者無傳染性，后者有傳染性，且使用弱毒苗的原發(fā)動(dòng)物繼代數(shù)代后不會使弱毒變強(qiáng)，具有產(chǎn)生免疫早、免疫持續(xù)期長的特點(diǎn)。同一細(xì)胞被2種病毒入侵時(shí)，往往產(chǎn)生2種完全不同的結(jié)果：一種情況是2種病毒互不相干各自增值，另外一種情況是一種病毒抑制另一種病毒的增殖。第2種現(xiàn)象被稱為干擾現(xiàn)象。關(guān)于干擾現(xiàn)象的機(jī)制，推斷是家蠶食下不活化的病毒后，其消化液中或中腸皮膜細(xì)胞靠圍食膜一面形成抗病毒狀的物質(zhì)，由此抑制病毒的感染，因而病毒病發(fā)病率受到抑制[14]。質(zhì)型多角體病毒不同株系之間存在明顯的干擾現(xiàn)象。利用熱處理、紫外線照射、甲醛滅活的CPV毒力減弱，給蠶添食后，對活性CPV的感染有干擾作用。用丙內(nèi)酯或熱滅活的NPV給家蠶添食也可獲得一定的免疫。弱毒苗要求被接種對象是健康無病的，疫苗應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，使用過程中不斷搖動(dòng)，并且使用疫苗時(shí)最好停止使用消毒藥物。

2.4 抗病育種

在家蠶各種防病措施中，以提高家蠶本身的抗病能力為目的的抗病育種是最佳的解決途徑，能從根本上阻止或減少蠶病的發(fā)生。

家蠶的抗病性受基因控制，且受隱性基因控制的感染抵抗性容易導(dǎo)入實(shí)用品種中，如蠶對DNV的感染抵抗性多數(shù)情況下受隱性基因控制；從生產(chǎn)應(yīng)用的角度看，受顯性基因控制的感染抵抗性應(yīng)用價(jià)值最大，一旦導(dǎo)入實(shí)用品種，較穩(wěn)定且F1代抗病性就得以體現(xiàn)，如某些品種對NPV、CPV的感染抵抗性受顯性基因控制。段家龍認(rèn)為，家蠶對CPV的感染抵抗性受多基因控制，加性效應(yīng)占主要作用，F(xiàn)1代有雜交優(yōu)勢，有偏父遺傳現(xiàn)象[15]。張志芳采用閥性狀擬連續(xù)性方法研究發(fā)現(xiàn)，家蠶對CPV感染抵抗性的基因位點(diǎn)不少于2個(gè)，而且是顯性效應(yīng)大于加性效應(yīng)，并存在超顯性現(xiàn)象[16]。錢荷英等試驗(yàn)表明，家蠶對NPV的感染抵抗性存在雜種優(yōu)勢現(xiàn)象，即F1代的抵抗性明顯高出兩親本的平均值，而且還高出抗體親本，呈超顯性現(xiàn)象[17]。經(jīng)典的抗病育種常常采用回交的方法將抗病基因?qū)雽?shí)用品種，對于抗病顯性基因的導(dǎo)入可以在回交代中添毒篩選。但對于抗病隱性基因常常在回交后自交一代，再通過添毒篩選保留隱形抗病基因[15]?；奈湟郧锕狻笼埌椎碾s種后代為材料，用高濃度的游離NPV病毒注射蛹體，連續(xù)經(jīng)過8代，選育系對NPV蛹體皮下注射感染抵抗性比未選系提高10～100倍[16]。陳克平對中國部分家蠶實(shí)用品種和保存種進(jìn)行抗DNV調(diào)查，篩選出8個(gè)抗性品種，通過回交的方法將抗病基因?qū)爰倚Q實(shí)用品種，組配的一代雜交種對DNV全抗，并已達(dá)到家蠶實(shí)用品種的水平[17]。

傳統(tǒng)的抗病育種不僅周期長，添毒篩選準(zhǔn)確性差，且容易污染環(huán)境。隨著分子生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)給家蠶抗病育種工作帶來了新的發(fā)展契機(jī)。目前在家蠶育種分子標(biāo)記中一般運(yùn)用RFLP標(biāo)記（限制性片段長度多態(tài)性）、RAPD標(biāo)記（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）、AFLP標(biāo)記（擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）。家蠶分子標(biāo)記輔助育種是分子標(biāo)記在家蠶育種上的一個(gè)重要應(yīng)用。利用上述分子標(biāo)記在雜交和回交中追蹤特定基因流向，用最短的育種時(shí)間和最小的育種規(guī)模，達(dá)到育種期望。利用分子標(biāo)記輔助育種的步驟：（1）選擇供體親本和輪回親本；（2）篩選出期望導(dǎo)入目的基因的分子標(biāo)記；（3）分析BC1代各個(gè)體標(biāo)記進(jìn)行保留或淘汰，同樣的方法到BC5或BC6代；（4）若選擇的目的基因是隱性基因，則采用RAPD即可獲得，若選擇的目的基因是顯性基因，則進(jìn)行自交，自交后可采用RFLP標(biāo)記區(qū)分3種基因或用RAPD標(biāo)記選擇后代推測上代基因[18]。賀一原、何斯美等用RAPD技術(shù)對家蠶抗膿核病近等基因系進(jìn)行分子標(biāo)記，獲得OPF-062000和OPF-0619002個(gè)標(biāo)記[17]。姚琴、李木旺等進(jìn)行家蠶抗NPV分子標(biāo)記研究，獲得了與家蠶抗NPV有關(guān)的分子標(biāo)記OPA-18700，并在回交世代中檢測驗(yàn)證了其可靠性[20]。

2.5 消毒預(yù)防

病毒粒子的存在是家蠶病毒病發(fā)生的先決條件。能有效打開病毒多角體，使病毒粒子充分暴露的快捷途徑是使用消毒劑。目前常用的殺病毒消毒劑按其主要成分大致分為氯制劑、醛類、表面活性劑和石灰[21]。含氯消毒劑能迅速氧化、破壞病毒衣殼上的酪氨酸，抑制病毒的特異性吸附，阻止其對宿主細(xì)胞的感染，生產(chǎn)上一般使用堿性較強(qiáng)的漂白粉，而對于堿性不強(qiáng)或溶液呈弱酸性的優(yōu)氯凈可配合石灰等使用，用于蠶室蠶具的消毒；醛類消毒劑主要與蛋白質(zhì)中的氨基結(jié)合使其變性或使蛋白質(zhì)分子烷基化，主要有甲醛、戊二醛等制劑，多用于環(huán)境消毒；表面活性劑類消毒劑以季胺鹽類為主，能迅速滲入胞漿膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)體，改變細(xì)胞膜通透性，目前主要有蠶季胺Ⅰ號、蠶季胺Ⅱ號和蠶康寧等[22]；石灰是養(yǎng)蠶業(yè)最常用又廉價(jià)的消毒劑，其強(qiáng)堿性可使病毒多角體外殼迅速溶解，釋放出游離病毒而被殺死，對家蠶NPV、CPV有良好預(yù)防和控制效果[21]。一般消毒藥劑若單劑使用時(shí)，穩(wěn)定性較差，腐蝕性、刺激性強(qiáng)，其應(yīng)用范圍受到限制。近年來，復(fù)合配方和新劑型與其他消毒劑的協(xié)同作用，提高了消毒效果和穩(wěn)定性，是當(dāng)前消毒劑的研究方向。目前，國內(nèi)有許多有機(jī)氯復(fù)方劑出現(xiàn)，如二氯異氰尿酸鈉復(fù)方制劑、三氯異氰尿酸復(fù)方制劑等?！鞍矞鐨ⅰ毕緞槲於┖蛯＠景符}的復(fù)方劑，2種成分有相加效果，是消毒劑最佳組合之一[22]。

近年來，臭氧用于消毒殺菌已成為消毒劑行業(yè)的新型材料和研究熱點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、防疫、水處理等方面，但在蠶業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用甚少。有研究報(bào)道，采用新生臭氧氣流進(jìn)行局部有針對性的處理家蠶病毒多角體30min后，病毒對家蠶失去感染力，且蠶體生長發(fā)育及生理機(jī)能無不良反應(yīng)，進(jìn)一步研制出1種養(yǎng)蠶專用消毒儀器，臭氧有可能成為蠶桑生產(chǎn)中一種無污染而又高效的綠色消毒劑[23]。

3 展望

家蠶病毒病的防治一直以來都是生產(chǎn)上的重點(diǎn)處理環(huán)節(jié)，但目前應(yīng)對措施主要還停留在消毒防病的基礎(chǔ)階段。高溫治療在生產(chǎn)上存在2個(gè)問題，一是高溫療法對非包涵體病毒的作用較明顯，而對包涵體病毒的效果較差。二是高溫療法所用的溫度已超過蠶的適溫范圍，可能引起蠶體虛弱，發(fā)生細(xì)菌性腸胃病。所以在實(shí)際應(yīng)用中，最好只針對已早期診斷確定為病毒病的病蠶進(jìn)行高溫處理，以降低病害，減少損失，避免影響健康蠶。

100多年來，家蠶作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在經(jīng)典遺傳學(xué)、動(dòng)物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、昆蟲免疫學(xué)等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。隨著21世紀(jì)科學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，家蠶作為現(xiàn)代生命科學(xué)研究的模式生物，在基因組學(xué)、人類疾病、發(fā)生生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、鱗翅目病蟲害以及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域具有更重要的研究價(jià)值。

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