急性脊髓損傷后線粒體的功能變化

程 剛綜述,張 寧,蔡衛(wèi)華審校

0 引 言

急性脊髓損傷(acute spinal cord injury,ASCI)是一種后果極其嚴(yán)重的創(chuàng)傷,雖然在過(guò)去的幾十年里其死亡率從 50%已經(jīng)下降了到目前的 6%[1]。目前研究結(jié)果都表明脊髓損傷的機(jī)制和損傷后線粒體形態(tài)和功能的變化有著密切的關(guān)系。在形態(tài)上線粒體主要變現(xiàn)為線粒體體積增大、膜結(jié)構(gòu)不清、線粒體嵴腫脹水腫、嵴腔擴(kuò)大、嵴排序紊亂。功能上,ASCI后的繼發(fā)性損害是加重脊髓神經(jīng)功能損害的主要因素。原發(fā)性脊髓損傷后導(dǎo)致的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的丟失和死亡會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的繼發(fā)性神經(jīng)元的損失或死亡[2]。此外,ASCI的有害因素主要有脊髓組織局部的缺血、缺氧、過(guò)氧化基團(tuán)生成及細(xì)胞內(nèi)成分的改變,其都會(huì)影響線粒體的形態(tài)和功能。ASCI后原發(fā)性損傷病變向縱、橫向逐漸發(fā)展,神經(jīng)元的喪失程度要根據(jù)損傷的時(shí)間和距損傷震中的距離而決定的。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),損傷會(huì)從震中不斷向遠(yuǎn)處擴(kuò)散,病變損傷范圍不斷擴(kuò)大[3]。線粒體變化機(jī)制主要包括如下幾個(gè)方面。

1 線粒體能量代謝的紊亂

線粒體能量代謝主要由呼吸功能來(lái)體現(xiàn),體現(xiàn)線粒體呼吸功能的重要參數(shù)有以下幾點(diǎn)[4]:線粒體呼吸Ⅲ態(tài)(R3)、呼吸Ⅳ態(tài)(R4)、呼吸控制率(respiratory control ratio,RCR=R3/R4)和磷氧比值(P/O比值)。P/O是指消耗 1摩爾氧原子所生成 ATP摩爾數(shù),P/0比值反應(yīng)的是線粒體利用氧化釋放能量轉(zhuǎn)化為 ATP的效率,它是線粒體氧化磷酸化效率和呼吸功能的重要指標(biāo)。氧化磷酸化脫偶聯(lián)可以導(dǎo)致P/O比值下降,同時(shí)損傷后由 R3降低和 R4升高共同變化造成線粒體 RCR的變化,RCR的變化也說(shuō)明線粒體氧化磷酸化偶聯(lián)程度明顯受到抑制,利用氧化釋放能量轉(zhuǎn)化為 ATP的效率明顯降低。有研究報(bào)道腦創(chuàng)傷后6～12h后,線粒體呼吸活性 R 3、RCR、P/0和氧化磷酸化效率(oxidative phosphorylation ratio,OPR)均明顯下降,R4相對(duì)正?；蛏遊4]。線粒體能量代謝紊亂的原因主要有以下幾個(gè)方面。

1.1 線粒體膜損傷 ASCI后線粒體膜通透性增加、腫脹、水腫,線粒體膜有序結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致質(zhì)子回流,從而使 H+泵發(fā)生障礙,膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能降低加重水腫。創(chuàng)傷誘導(dǎo) Ca2+進(jìn)入神經(jīng)元,這就激活了由磷脂酶介導(dǎo)的水解作用,從而釋放大量的游離脂肪酸類(free fatty acid)造成對(duì)線粒體膜的損傷[5],同時(shí)又影響線粒體的能量代謝功能。

1.2 呼吸抑制劑或解偶聯(lián)劑的生成 ASCI產(chǎn)生一些線粒體呼吸抑制劑或解偶聯(lián)劑,可直接抑制多種線粒體的電荷傳遞而影響能量代謝,如活性氮和過(guò)氧亞硝酸鹽等自由基,內(nèi)源性過(guò)氧亞硝酸鹽對(duì)線粒體的細(xì)胞色素 C氧化酶形成不可逆的損傷,同時(shí)也會(huì)對(duì)線粒體其他結(jié)構(gòu)構(gòu)成損傷[6]。自由基也是一種很強(qiáng)的炎癥介質(zhì),細(xì)胞膜極易遭受自由基的攻擊。它主要破壞細(xì)胞或亞細(xì)胞器膜脂質(zhì)分子,自由基產(chǎn)生增多使膜肽分子鏈斷裂、損壞、變性,導(dǎo)致線粒體脂質(zhì)層變薄、分子流動(dòng)性降低、出現(xiàn)細(xì)孔影響脊髓線粒體內(nèi)膜底物通透,而影響線粒體的氧化磷酸化。解偶聯(lián)劑則可以破壞線粒體膜兩側(cè)的電化學(xué)梯度使能量生成受到抑制。

1.3 組織缺血、缺氧 脊髓組織缺血、缺氧使線粒體呼吸功能受抑制。其機(jī)制為缺氧使 NADH不能經(jīng)呼吸鏈氧化成 NAD+,導(dǎo)致使 NAD+生成減少、NADH堆積增多,NAD+/NADH比值下降,抑制檸檬酸合成酶的活性,檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)的主要調(diào)節(jié)點(diǎn)之一,它的活性抑制會(huì)使三羧酸功能下降,ATP生成減少。

1.4 其他方面 此外,ASCI后發(fā)生繼發(fā)性缺血、缺氧會(huì)導(dǎo)致自由基不斷的生成會(huì)減少多不飽和脂肪酸鏈的長(zhǎng)度,破壞脂質(zhì)雙分子層的完整性,使線粒體膜流動(dòng)性降低、通透性增加[7]。而膜流動(dòng)性降低會(huì)對(duì)Na+-K+-ATP酶、細(xì)胞色素氧化酶、膜受體功能產(chǎn)生損害,細(xì)胞色素氧化酶是線粒體呼吸鏈的酶復(fù)合體的重要組成,Na+-K+-ATP酶、細(xì)胞色素氧化酶以及膜受體是線粒體發(fā)揮正常生理功能所必須的,進(jìn)而抑制了線粒體呼吸功能。

2 線粒體活性氧的生成

活性氧(reactive oxygen species)是體內(nèi)一類氧的單電子還原產(chǎn)物,是含有氧元素但比普通狀態(tài)的氧更具活性的一類分子,它對(duì)組織和細(xì)胞的損傷主要表現(xiàn)為脂質(zhì)過(guò)氧化作用(lipid peroxidation,LPO),活性氧可使磷脂分子不飽和脂肪氧化生成過(guò)氧化脂質(zhì),損傷線粒體膜?；钚匝踔饕ㄑ踝杂苫?、羥自由基、過(guò)氧化氫、過(guò)氧化物、過(guò)氧亞硝酸鹽。活性氧可直接與蛋白、脂質(zhì)、核酸等發(fā)揮作用使其失去功能,也可以起到中間信使作用[8]。機(jī)體對(duì)活性氧的反應(yīng)也可以造成繼發(fā)性損傷,繼發(fā)性脊髓損傷的原因部分是來(lái)自于對(duì)原發(fā)性損傷產(chǎn)生的物質(zhì)的反應(yīng),這些物質(zhì)就包括活性氧、活性氮,這些都是引起損傷后繼發(fā)性細(xì)胞死亡的重要因素。目前活性氧對(duì)脊髓的損傷已得到廣泛的證實(shí),在 ASCI 1h后,檢測(cè)線粒體中活性氧水平試驗(yàn)顯示活性氧上升緩慢,活性氧水平雖有上升但無(wú)明顯差異,脊髓損傷后4h后,活性氧水平卻升高48%[9]。在脊髓損傷后 24 h后,過(guò)氧化氫酶的活性和谷胱甘肽(glutathione)水平卻升高更加明顯,這些都說(shuō)明線粒體的功能、活性氧水平、脂質(zhì)過(guò)氧化作用在損傷后變化很快[10]。

2.1 活性氧產(chǎn)生機(jī)制

2.1.1 炎癥反應(yīng) 在脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)也與活性氧的生成關(guān)系密切。在脊髓損傷后,組織的缺血、缺氧、水腫會(huì)使血管內(nèi)皮細(xì)胞受損而生成炎癥介質(zhì),這些介質(zhì)包括腫白細(xì)胞介素-1、5羥基花生四烯酸等致炎細(xì)胞因子和炎性趨化因子,它們使黏附分子表達(dá)增加,中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放的化學(xué)介質(zhì)也會(huì)增加,這些因素共同導(dǎo)致中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)和活化?；罨闹行粤＜?xì)胞和單核細(xì)胞在局部吞噬壞死組織并且釋放蛋白水解酶,產(chǎn)生大量的活性氧和溶酶體酶,活性氧和溶酶體酶又可成為炎性介質(zhì),促進(jìn)炎癥反應(yīng)和炎癥破壞。

2.1.2 補(bǔ)體系統(tǒng) 炎癥激活的補(bǔ)體系統(tǒng)也會(huì)產(chǎn)生大量活性氧,其中補(bǔ)體活化片段 C5a是中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞的趨化因子,它可增加白細(xì)胞表面的整合素的親和力,促進(jìn)白細(xì)胞黏附,增強(qiáng)炎癥反應(yīng)而激發(fā)活性氧大量產(chǎn)生,大量的活性氧加重氧化損傷?；钚匝跫せ钛a(bǔ)體又可誘發(fā)中性粒細(xì)胞進(jìn)一步產(chǎn)生活性氧,這樣就形成了補(bǔ)體活化與活性氧增加的正反饋機(jī)制[11]。

2.1.3 其他途徑 脊髓損傷缺血缺氧引起能量代謝障礙,ATP降解、氧化還原不完全可產(chǎn)生活性氧。除上述產(chǎn)生途徑外,細(xì)胞外 Ca2+內(nèi)流,激活磷脂酶,脂質(zhì)降解增強(qiáng),也會(huì)生成活性氧,線粒體內(nèi)外 Ca2+失衡也會(huì)誘導(dǎo)線粒體膜電位的降低使活性氧生成增加。Fe3+也可以作為催化劑催化介導(dǎo)體內(nèi)羥自由基生成[12]。

2.2 活性氧的損傷機(jī)制

2.2.1 脂質(zhì)過(guò)氧化作用 活性氧的氧化應(yīng)激作用在脊髓損傷中得到廣泛實(shí)驗(yàn)的證實(shí),脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)可能是活性氧對(duì)線粒體損傷的主要過(guò)程。脊髓損傷后過(guò)量的活性氧能通過(guò)與不飽和脂肪酸脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)攻擊線粒體膜,破壞膜的完整性,活性氧及其導(dǎo)致的 LPO與神經(jīng)細(xì)胞創(chuàng)傷的關(guān)系是緊密聯(lián)系的,其中丙烯醛(acrolein)和羥基壬烯醛(hydroxynonenal,HNE)是脂質(zhì)氧化作用過(guò)程中最具有毒性的副產(chǎn)品,這些醛類產(chǎn)物的積累會(huì)對(duì)線粒體損傷起著重要作用[13],如 HNE可促進(jìn)神經(jīng)肽等的釋放而引起相關(guān)的炎癥反應(yīng)。損傷組織中腫瘤壞死因子、一氧化氮等介質(zhì)的含量增高也不僅會(huì)對(duì)線粒體膜造成損傷,還可以生成氧自由基和氮過(guò)氧化物加重?fù)p傷。

2.2.2 活性氧與線粒體 Ca2+超載 原始的機(jī)械損傷會(huì)造成脊髓組織的水腫和局部缺血,細(xì)胞和亞細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)的通透性增加,Ca2+會(huì)大量進(jìn)入胞質(zhì)導(dǎo)致鈣超載。繼發(fā)性的損傷同樣會(huì)形成鈣超載,其可作為信號(hào)誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔(mitochondrion permeability transition pore,MPTP)開放 ,MPTP的蛋白構(gòu)成包括線粒體內(nèi)膜上的腺苷轉(zhuǎn)為分子、線粒體外膜的電壓依賴性離子通道和線粒體基質(zhì)的親環(huán)素 D[14]。它的開放可引發(fā) Ca2+內(nèi)流與線粒體電子傳遞鏈解偶聯(lián),同時(shí)促進(jìn)自身線粒體及其他線粒體產(chǎn)生活性氧 ,使活性氧損傷作用正向反饋擴(kuò)大。損傷后細(xì)胞內(nèi)的 Ca2+內(nèi)流超載是細(xì)胞死亡的最后共同途徑,一旦細(xì)胞內(nèi) Ca2+清除功能障礙或者細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)鈣庫(kù)釋放就會(huì)增加細(xì)胞內(nèi) Ca2+聚集,引起鈣依賴性蛋白酶和磷脂酶的活化,導(dǎo)致細(xì)胞骨架蛋白水解、花生四烯酸堆積和脂質(zhì)氧化作用的發(fā)生[15],最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

2.2.3 活性氧與細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡是某些體內(nèi)外因素觸發(fā)的細(xì)胞主動(dòng)死亡方式?；钚匝跏且活惡芑顫姷幕瘜W(xué)分子。活性氧可以直接與生物大分子作用,引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激而損傷細(xì)胞及細(xì)胞器,也可以作為觸發(fā)因素通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達(dá)誘發(fā)神經(jīng)元凋亡,還可以改變細(xì)胞內(nèi)酶活性,使 cAMP和cGMP濃度升高影響細(xì)胞增殖分化。Fas、Bax、P53都有能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡作用。Bax是 Bcl-2家族中促凋亡的成員之一,Bcl-2與 Bax的比值在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路起著關(guān)鍵的作用,比值減少會(huì)增加線粒體膜的通透性而加重線粒體損傷[16]。刺激信號(hào)活性氧升高的作用下可以上調(diào) Bax的表達(dá),Bax通過(guò)作用于 MPTP,降低線粒體跨膜電勢(shì),促使線粒體釋放細(xì)胞色素 C和凋亡酶(Caspases)的激活,以及其他凋亡誘導(dǎo)因子的釋放促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]?；钚匝鯇?duì)線粒體或細(xì)胞的損傷可以引起機(jī)體內(nèi)某些物質(zhì)變化以起到防御性或保護(hù)的作用,例如,胞外的抗壞血酸的生成增多就是針對(duì)活性氧而產(chǎn)生保護(hù)作用[18],這可以減少活性氧對(duì)細(xì)胞的損傷。當(dāng)活性氧的氧化效應(yīng)超過(guò)了體內(nèi)抗氧化防御機(jī)制的清除作用時(shí),就會(huì)啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),導(dǎo)致生物膜包括線粒體內(nèi)外膜的完整性和通透性發(fā)生改變,生成醛類產(chǎn)物抑制 ATP酶活性,進(jìn)一步損傷線粒體功能,線粒體功能的進(jìn)一步受損,導(dǎo)致更多的活性氧生成。由此構(gòu)成了氧化應(yīng)激的惡性循環(huán),導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙并最終死亡[19]。

3 線粒體內(nèi)鈣超載

Ca2+是最普通的信號(hào)傳導(dǎo)元素,但與其他第二信使分子不同,Ca2+過(guò)量會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡。因?yàn)殁}不能像其他第二信使分子一樣被分解代謝,只能通過(guò)細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)。大量的細(xì)胞內(nèi)蛋白和一些細(xì)胞器通過(guò)與 Ca2+結(jié)合和分離來(lái)確保內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。線粒體就是其中最為主要的一種細(xì)胞器,細(xì)胞內(nèi) Ca2+的超載已被認(rèn)為是神經(jīng)細(xì)胞死亡的最后共同途徑。ASCI后,在線粒體中游離 Ca2+的變化雖然早已引起人們重視,但研究結(jié)果尚不多。原因是測(cè)定線粒體游離 Ca2+比較困難,熒光探針 Reers法[20]使這一難題已得到初步的解決,人們發(fā)現(xiàn)脊髓損傷以后細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流超載,Na+-Ca2+交換體(Na+-Ca2+exchanger)在脊髓損傷后可導(dǎo)致細(xì)胞及線粒體內(nèi)Ca2+濃度升高方面起著重要作用[21]。而且損傷部位周圍的 Ca2+也流入損傷組織,細(xì)胞內(nèi)外的 Ca2+都增加。鈣超載的損傷機(jī)制主要有以下幾方面。

3.1 直接組織損傷作用 ASCI后,線粒體內(nèi) Ca2+增加可激活蛋白溶酶和脂質(zhì)溶酶,引起細(xì)胞器和膜結(jié)構(gòu)損傷或細(xì)胞自溶,如鈣依賴性磷酸脂酶和磷脂酶等導(dǎo)致細(xì)胞膜被破壞,而且其產(chǎn)物如花生四烯酸、血栓素、白三烯和自由基可以通過(guò)炎癥反應(yīng)而加重組織的損傷。此外,Ca2+作為凝血因子在凝血過(guò)程中起著重要的作用,ASCI后細(xì)胞內(nèi)外的 Ca2+濃度都增加,它可以迅速激活凝血酶形成局部血栓形成,導(dǎo)致微循環(huán)障礙、脊髓水腫[22]。

3.2 干擾能量代謝 Ca2+清除功能障礙或者是線粒體內(nèi)釋放 Ca2+,均可以增加細(xì)胞內(nèi) Ca2+積聚,Ca2+作為第二信使使鈣依賴性蛋白酶和磷脂酶的活化,影響線粒體的呼吸功能和能量代謝,最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡,線粒體 ATP生成減少又會(huì)是膜表面的Ca2+交換體不能發(fā)揮作用,這樣又能加重 Ca2+的積聚,形成惡性循環(huán)。

3.3 加重活性氧的生成 線粒體內(nèi) Ca2+超載也可引起線粒體 MPTP的開放,線粒體膜通透性的改變導(dǎo)致了線粒體內(nèi)外膜電位的降低,從而使電子傳遞體系和氧化磷酸化發(fā)生障礙,終止 ATP生成,大量乳酸堆積產(chǎn)生自由基增加等一系列活性氧的生成[23],加重細(xì)胞的繼發(fā)性損傷。此外,在 ASCI后由興奮性毒素所造成的損傷會(huì)使線粒體攝取大量 Ca2+,從而增加活性氧的生成[24]。鈣超載的發(fā)生與發(fā)展又是許多有害因素導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至凋亡的機(jī)制。

ASCI的病理機(jī)制很復(fù)雜,有關(guān)線粒體在脊髓繼發(fā)性損傷機(jī)制中的作用主要集中在損傷后線粒體的能量代謝紊亂、鈣超載、氧化應(yīng)激、活性氧的生成等幾大方面,同時(shí)也和線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系。大量的細(xì)胞以凋亡方式死亡,故細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是脊髓損傷的繼發(fā)改變的重要過(guò)程。但線粒體功能變化對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響以及其在神經(jīng)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中的作用等問(wèn)題仍有待進(jìn)一步研究。

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