大腸癌基因治療研究進(jìn)展

周 東（綜述），陳嘉勇（審校）

（昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院急診科，昆明 650101）

大腸癌是人類常見惡性腫瘤之一，治療仍以手術(shù)切除為首選，但療效欠佳;基因治療因其效果佳，不良反應(yīng)小，現(xiàn)已成為研究的熱點(diǎn)。目前，大腸癌基因治療的方法包括基因修正或基因置換、基因免疫治療、RNA干擾技術(shù)等。選擇腫瘤基因治療的理想載體和靶點(diǎn)，提高基因治療的安全性、靶向性、高效性和可調(diào)控性，是目前大腸癌基因治療需要解決的問(wèn)題。

大腸癌;基因治療;病毒載體

基因治療是指通過(guò)操作遺傳物質(zhì)來(lái)干預(yù)疾病的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)程，包括替代或糾正人自身基因結(jié)構(gòu)或功能上的錯(cuò)亂，殺滅病變的細(xì)胞或增強(qiáng)機(jī)體清除病變細(xì)胞的能力等，從而達(dá)到治病的目的。大腸癌是常見的惡性腫瘤之一，在我國(guó)的消化道腫瘤發(fā)病率中排第三位，發(fā)病率仍有上升趨勢(shì)。大腸癌的治療至今仍以手術(shù)治療為首選，輔以放化療，但療效欠佳，患者生存率低下，其基因治療一直是研究的熱點(diǎn)，現(xiàn)將大腸癌基因治療的研究進(jìn)展予以綜述。

1 大腸癌的基因治療

1.1 基因修正或基因置換 這是將正常功能基因通過(guò)載體轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，置換或增補(bǔ)腫瘤細(xì)胞缺陷的基因，主要是以病毒為載體把野生型基因重新導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞。p53是一種抑癌基因，參與細(xì)胞周期調(diào)控，在防止細(xì)胞癌變、抑制腫瘤血管生成、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性、增加放化療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力、刺激機(jī)體特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是迄今發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，其突變率平均為60%［1］。針對(duì)p53矯正來(lái)治療結(jié)直腸癌目前主要有兩種策略:①導(dǎo)入野生型 p53（wide type-p53，wt-p53）替代突變基因;②利用p53激活因子或核酶技術(shù)逆轉(zhuǎn)p53突變。大量體外培養(yǎng)細(xì)胞和動(dòng)物模型都證實(shí)了外源的wt-p53導(dǎo)入后，腫瘤細(xì)胞增殖減慢，細(xì)胞發(fā)生凋亡，瘤體體積縮小，對(duì)放、化療藥物的敏感性增高。Okimoto等［2］經(jīng)肝動(dòng)脈給結(jié)腸癌RCN-9細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移大鼠注入腺病毒介導(dǎo)的p53，48 h后注入順鉑，一段時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞廣泛死亡，而肝功能沒(méi)有損害。Cook等［3］發(fā)現(xiàn)，一氧化氮能夠促進(jìn)p53依賴性細(xì)胞凋亡，通過(guò)轉(zhuǎn)移一氧化氮合酶基因到結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)一氧化氮生成，激活p53，顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。

1.2 自殺基因治療 又名基因介導(dǎo)的酶前藥物治療（gene-directed enzyme prodrug therapy，GDEPT），是一種通過(guò)目的基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)，將外源酶轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞中，使無(wú)毒的前藥在腫瘤中代謝為有細(xì)胞毒性的藥物，從而殺死腫瘤細(xì)胞，這種基因轉(zhuǎn)導(dǎo)主要以病毒介導(dǎo)的酶/藥物前體療法（virus-directed enzyme prodrug therapy，VDEPT）。自殺基因轉(zhuǎn)染給腫瘤細(xì)胞將瘤細(xì)胞殺滅，此為直接細(xì)胞毒效應(yīng)。在自殺基因/前藥系統(tǒng)介導(dǎo)的腫瘤治療中，被殺滅的細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)超過(guò)表達(dá)自殺基因的細(xì)胞數(shù)，這是由于在前藥存在下，基因改造的瘤細(xì)胞能引起未經(jīng)基因改造細(xì)胞的細(xì)胞毒性和死亡，這種現(xiàn)象即旁觀者效應(yīng)。

GDEPT有下列3種成分:①能編碼一種酶的自殺基因:該基因通常來(lái)源于病毒或真核細(xì)胞，其編碼的酶能將無(wú)毒的前藥轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚远疚?，引起靶?xì)胞死亡，在缺乏前藥的條件下，該基因的表達(dá)對(duì)機(jī)體無(wú)害;②基因轉(zhuǎn)移載體:為了轉(zhuǎn)移自殺基因至靶細(xì)胞，一般采用基因工程改造的反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺病毒相關(guān)性病毒作為載體;③能被自殺基因編碼的酶作用的前藥:這種前藥在自殺基因不存在時(shí)，對(duì)機(jī)體無(wú)毒或有微小毒性，而在自殺基因編碼的酶特異性作用下，前藥轉(zhuǎn)化為活性藥物，后者的細(xì)胞毒性較無(wú)活性的前藥至少?gòu)?qiáng)100倍。

目前應(yīng)用的GDEPT主要有以下幾種:①丙氧鳥苷/單純皰疹病毒-胸苷激酶系統(tǒng);②氟胞嘧啶/胞苷脫氨酶系統(tǒng);③6-巰基嘌呤/黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng);④丙氧鳥苷/潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶-胸苷激酶融合蛋白系統(tǒng);⑤6-甲基嘌呤-2-脫氧核糖核苷酸/嘌呤核苷酸磷酸酶系統(tǒng);⑥環(huán)磷酰胺/細(xì)胞色素P450-B1系統(tǒng)。Sung等［4］在B超引導(dǎo)下將腺病毒單純皰疹病毒-胸苷激酶經(jīng)皮直接注射至16例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶中，其中2例患者有輕度的轉(zhuǎn)氨酶升高，5例有輕微發(fā)熱，3例有輕度白細(xì)胞減少，顯示了較高的安全性。胞苷脫氨酶將抗真菌藥氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化成具有抗腫瘤活性藥物氟尿嘧啶，后者在DNA復(fù)制過(guò)程中抑制胸腺嘧啶合成酶而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。許多體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)都證實(shí)，被轉(zhuǎn)染胞苷脫氨酶的細(xì)胞對(duì)氟胞嘧啶高度敏感，且存在很強(qiáng)的旁觀者效應(yīng)。尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶能增強(qiáng)氟尿嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问?-氟脫氧尿苷一磷酸鹽，抑制DNA的合成。將胞苷脫氨酶和尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶融合基因?qū)氚屑?xì)胞表達(dá)，可能會(huì)增加氟胞嘧啶對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性。Chung-Faye等［5］將腺病毒-胞苷脫氨酶-尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶注射到裸鼠結(jié)直腸癌模型中并腹腔內(nèi)注射氟胞嘧啶，顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)。

1.3 基因免疫治療 機(jī)體抗腫瘤的免疫必須依賴于腫瘤細(xì)胞的抗原被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別后激活。人類腫瘤免疫原性弱，且抗原呈遞中存在多個(gè)環(huán)節(jié)缺陷，從而使腫瘤出現(xiàn)免疫逃逸。將細(xì)胞因子或免疫相關(guān)基因?qū)肽[瘤細(xì)胞制備腫瘤疫苗，可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞抗原性以及抗體對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別和呈遞能力，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫能力?；蛎庖咧委煹幕舅悸窔w納如下。1.3.1 免疫相關(guān)基因?qū)肽[瘤細(xì)胞 腫瘤抗原需與主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類分子結(jié)合，被 CD8+細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）識(shí)別成為抗原呈遞細(xì)胞，攝取加工后與MHCⅡ分子結(jié)合，被CD+T

4細(xì)胞識(shí)別，方可激活腫瘤免疫。60%～70%大腸癌患者的MHCⅠ呈低表達(dá)狀態(tài)，從而使腫瘤組織逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)視，而 MHCⅠ和 MHCⅡ途徑都需 HLAB7（人類白細(xì)胞抗原B7）共刺激，腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入MHC基因，可提高抗原呈遞能力，激活抗腫瘤免疫。單獨(dú)B7基因治療對(duì)無(wú)免疫原性的腫瘤細(xì)胞作用弱，若聯(lián)合MHC呈遞和B7基因共刺激作用，則可激活CTL廣泛的腫瘤殺傷效應(yīng)，且B7分子還能增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的腫瘤殺傷活性。

1.3.2 細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤細(xì)胞 細(xì)胞因子具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，將編碼細(xì)胞因子的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞可構(gòu)建腫瘤疫苗。白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）的單獨(dú)皮下注射或靜脈注射主要引起毛細(xì)血管滲透性改變，并無(wú)明顯的抗腫瘤活性表現(xiàn)，但將編碼IL-2的基因?qū)氪竽c癌細(xì)胞構(gòu)建腫瘤疫苗，經(jīng)γ射線等處理后使其失去致癌性而保存分泌IL-2的能力。通過(guò)IL-2生物學(xué)活性，可誘導(dǎo)CTL、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活性及抗體產(chǎn)生，增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng)。許多細(xì)胞因子基因（如IL-2基因、集落細(xì)胞刺激因子基因）在鼠結(jié)腸癌模型中已被證實(shí)有效［6］。

1.3.3 基因瘤苗 結(jié)直腸癌細(xì)胞缺乏B7分子，不能為T細(xì)胞的激活提供協(xié)同刺激信號(hào)，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)能。轉(zhuǎn)染B7基因的腫瘤細(xì)胞，具有直接激活CTL的能力。癌胚抗原是一種糖蛋白，在絕大多數(shù)結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，能被T細(xì)胞識(shí)別，將癌胚抗原基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞可提高其免疫原性。聯(lián)合轉(zhuǎn)染B7和癌胚抗原在理論上可以促進(jìn)腫瘤特異性T細(xì)胞的激活。H?rig等［7］用重組有癌胚抗原和B7基因的復(fù)制缺陷型痘病毒對(duì)18例晚期結(jié)直腸癌患者進(jìn)行肌內(nèi)注射，在最高劑量4.5×108PFU（噬菌斑形成單位數(shù)，指每毫升試樣中含有侵染性噬菌體的粒子數(shù)）下沒(méi)有嚴(yán)重毒性作用及自身免疫反應(yīng)，其中有3例患者病情穩(wěn)定，且證實(shí)與癌胚抗原特異性T前體細(xì)胞的增高有關(guān)，重復(fù)注射后出現(xiàn)癌胚抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答的擴(kuò)大效應(yīng)。

1.4 反義基因治療 是指利用一些物質(zhì)干擾細(xì)胞中遺傳物質(zhì)信息天然加工的方法，尤其是在因基因變異所致疾病的情況下。其基本機(jī)制是通過(guò)阻抑從DNA到mRNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程或從 mRNA到蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程而阻斷細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成。利用這一技術(shù)所研制的藥物稱為反義藥物，通常指反義寡脫氧核苷酸（antisense oligodeoxy-nuclecotide，ASODN），其核苷酸序列可與基因組RNA或DNA或基因組衍生的RNA互補(bǔ)，防止或阻斷疾病相關(guān)蛋白的表達(dá)。Green等［8］的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ASODN能阻撓結(jié)腸癌細(xì)胞β-聯(lián)蛋白mRNA功能，降低結(jié)腸癌胞質(zhì)內(nèi)β-聯(lián)蛋白表達(dá)水平，從而抑制β-聯(lián)蛋白進(jìn)入核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動(dòng)下游靶基因轉(zhuǎn)錄，且ASODN對(duì)結(jié)腸癌的這種抑制作用呈劑量依賴性。

1.5 RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)RNAi現(xiàn)象最早在1998年由 Fire等［9］首次發(fā)現(xiàn)并命名，RNAi屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，其本質(zhì)是小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）高效特異地阻斷體內(nèi)同源基因表達(dá)，致使mRNA降解和基因表達(dá)受抑［10］。RNAi對(duì)腫瘤的作用機(jī)制包括可靶向抑制內(nèi)源性基因和外源性癌基因［11］，針對(duì)信號(hào)通路的多個(gè)基因或基因族的共同序列同時(shí)抑制多個(gè)基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)，通過(guò)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)分化相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并通過(guò)干擾細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。由于RNAi抑制基因表達(dá)具有特異性和高效性，同時(shí)伴隨近年來(lái)合成雙鏈RNA技術(shù)上的改進(jìn)，RNAi已成為研究大腸癌基因治療的新方法。目前，生物體內(nèi)siRNA給藥系統(tǒng)主要采用以下幾種方式:①陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹siRNA或siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體，前者的細(xì)胞毒性和兩者的低轉(zhuǎn)染效率限制了其應(yīng)用;②病毒siRNA表達(dá)載體，如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒和慢病毒等，具有特異和高效的基因轉(zhuǎn)移率，RNAi效應(yīng)高，并可在生物體內(nèi)產(chǎn)生可持續(xù)的表達(dá)，但多數(shù)病毒類載體潛在的免疫原性和致瘤性問(wèn)題一直未得到很好的解決。而慢病毒siRNA表達(dá)載體具有較低的免疫原性和細(xì)胞毒性，生物體內(nèi)穩(wěn)定性比較好，適用于體內(nèi)RNAi的研究，包括穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株成瘤實(shí)驗(yàn)、瘤內(nèi)注射、局部注射等，是抑制特定基因表達(dá)的理想工具［12］。目前已發(fā)現(xiàn)，通過(guò)RNAi抑制K-ras、Bcl-2、p53等腫瘤相關(guān)基因能夠使大腸癌腫瘤細(xì)胞增生速度減慢，惡性程度降低，凋亡加快［13］。β-聯(lián)蛋白和抗原遞呈細(xì)胞基因是WNT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵成分。這些基因的突變可引起β-聯(lián)蛋白表達(dá)水平的增加，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增生，促進(jìn)結(jié)腸息肉和結(jié)腸癌的發(fā)展。有學(xué)者構(gòu)建了β-聯(lián)蛋白基因的siRNA并轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞系 SW480和HCT116，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA后能顯著降低β-聯(lián)蛋白基因的表達(dá)并抑制癌細(xì)胞的增生［14］。siRNA可以針對(duì)β-聯(lián)蛋白基因的多個(gè)靶區(qū)域使得蛋白表達(dá)量降低90%。ASODN技術(shù)雖然也能用于抑制β-聯(lián)蛋白基因的表達(dá)，但其抑制效果明顯低于RNAi。RNAi可以單獨(dú)應(yīng)用，或與其他治療手段聯(lián)合應(yīng)用，RNAi正在替代ASODN技術(shù)及基因剔除技術(shù)在基因功能研究上的地位，而且作為腫瘤基因治療的新方法，其前景也是十分誘人的［15］。

1.6 抑制腫瘤血管生成基因治療 血管形成過(guò)程包括從內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖、遷移、血管基底膜的破壞，至血管和血管網(wǎng)的形成，由于多數(shù)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移依賴于血管生成，因此，抗血管生成治療被成為一項(xiàng)頗具潛力的腫瘤治療措施。Schmitz等［16］利用腺病毒介導(dǎo)的內(nèi)皮他丁和血管他丁相似分子基因轉(zhuǎn)導(dǎo)治療大鼠結(jié)腸癌和肝細(xì)胞癌，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮他丁和血管他丁相似分子都能夠顯著抑制試管內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及血管形成，而血管他丁相似分子抑制效果更顯著;同時(shí)發(fā)現(xiàn)血管他丁相似分子能夠抑制大鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。半乳凝素7是復(fù)層上皮細(xì)胞表達(dá)的β-半乳糖苷結(jié)合動(dòng)物凝集素，是一種凋亡前體蛋白，p53基因可誘導(dǎo)它的表達(dá)。Ueda等［17］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，半乳凝素7在人結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞系異位表達(dá)使得癌細(xì)胞更易于死亡，經(jīng)半乳凝素7轉(zhuǎn)染的DLD-1細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減緩，而且細(xì)胞集落形成明顯減少，腫瘤血管密度減低，表明半乳凝素7是通過(guò)抑制血管生成而起作用的。

2 大腸癌基因治療存在的問(wèn)題

盡管目前世界范圍內(nèi)已有100余項(xiàng)基因治療方案獲準(zhǔn)進(jìn)入臨床試治腫瘤，但臨床仍缺乏有顯著療效的治療方案。其原因主要有以下幾方面。

①目前的基因治療載體主要分為病毒載體和非病毒載體，病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，靶向性強(qiáng)，但其包裝能力小，易引起免疫反應(yīng);非病毒載體毒性低，具有低免疫原性，但轉(zhuǎn)染效率低，通過(guò)載體導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)量低等，且這些載體在體內(nèi)均表現(xiàn)出毒性［18］，因此需要改進(jìn)和尋找更加安全的載體。②大腸癌的發(fā)生跟其他惡性腫瘤一樣，是多基因水平的表達(dá)調(diào)節(jié)失控所致，其機(jī)制目前尚未完全被人們所認(rèn)識(shí)，不可能置換所有突變基因，因此單基因的修正、置換效果仍不盡人意。③把癌胚抗原作為啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因表達(dá)中有較好的腫瘤特異性，但只有當(dāng)大腸癌細(xì)胞表達(dá)癌胚抗原時(shí)才能發(fā)揮其啟動(dòng)子的作用，而且臨床中癌胚抗原的啟動(dòng)子作用效果很不明顯。④當(dāng)前基因治療中還存在許多關(guān)鍵問(wèn)題沒(méi)有解決，如對(duì)導(dǎo)入基因的可控性問(wèn)題等。同時(shí)，基因治療的安全性也是一個(gè)不可忽視的問(wèn)題，包括基因載體本身以及外源基因整合到宿主染色體帶來(lái)的一系列不良影響。⑤反義基因治療技術(shù)在腫瘤治療和病毒控制中顯示出了誘人的應(yīng)用前景，但ASODN自身的穩(wěn)定性、給藥途徑及與非靶DNA或mRNA雜交而出現(xiàn)對(duì)機(jī)體不良反應(yīng)等問(wèn)題尚未最終解決。⑥RNAi技術(shù)的出現(xiàn)對(duì)腫瘤基因治療帶來(lái)了新的希望［19］，但RNAi用于臨床腫瘤治療目前仍要解決的問(wèn)題是靶向性及提高RNAi的轉(zhuǎn)染效率，避免RNAi轉(zhuǎn)染后在細(xì)胞內(nèi)的降解等。

3 大腸癌基因治療展望

大腸癌與其他惡性腫瘤一樣，是在內(nèi)外多因素影響下發(fā)生的多基因表達(dá)調(diào)控失調(diào)的一種個(gè)體化的疾病，設(shè)計(jì)出合理治療方案極為重要?；蛑委煹暮诵膯?wèn)題是靶向性，隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的發(fā)展及相關(guān)學(xué)科的相互滲透，針對(duì)大腸癌的基因治療已有多種方法，如胞苷脫氨酶/氟胞嘧啶、單純皰疹病毒-胸苷激酶/丙氧鳥苷體系的病毒介導(dǎo)的酶前藥物治療方案、wt-p53抑癌基因治療以及某些免疫

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