微生物發(fā)酵法合成高分子聚合物γ－PGA的研究

梁金鐘， 王風(fēng)青

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院/黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150076)

微生物發(fā)酵法合成高分子聚合物γ－PGA的研究

梁金鐘， 王風(fēng)青

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院/黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150076)

以一株γ－聚谷氨酸高產(chǎn)菌枯草芽孢桿菌B－115為實驗菌株，分別考察碳源、氮源種類及濃度、前體物添加量、生長因子和發(fā)酵條件對γ－聚谷氨酸產(chǎn)率的影響.優(yōu)化結(jié)果顯示:碳源是6.5%的玉米糖化液，氮源是0.4%的普通蛋白胨，前體物谷氨酸鈉的添加量為4%，生長因子種類及添加量分別為0.15%硫酸鎂、0.006%硫酸錳、0.8%磷酸二氫鉀、1.0%氯化鈉、0.03%氯化鈣;發(fā)酵條件為初始pH值6.5，接種量2%，裝液量50 mL/250 mL，150 r/min，37℃培養(yǎng)84 h;γ－聚谷氨酸的產(chǎn)率可從57.85 g/L提高到68.30 g/L.

γ－聚谷氨酸;培養(yǎng)基;培養(yǎng)條件;高分子聚合物

γ－聚谷氨酸［poly γ-glutamic acid，γ-PGA］是由微生物代謝合成并分泌到細(xì)胞外的一種水溶性高分子物質(zhì)，這種陰離子物質(zhì)是由L－谷氨酸和D－谷氨酸單體之間通過酰胺鍵結(jié)合而成的同聚酰胺［1］.γ－PGA具有增稠、乳化、保濕、絮凝、粘合，極佳的成膜性、成纖維性、阻氧性、可塑性和可降解性等獨特的理化和生物學(xué)特性，因此可廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護等領(lǐng)域［2］，例如:藥物緩釋劑［3］、沙地的保水劑［4－5］、高吸水劑［6－7］、食品用水凝膠［8］、粘稠劑［9］以及高強纖維等［10］，特別是近年來隨著對γ－PGA的深入研究，γ－PGA作為一種高分子生物制品，愈來愈顯現(xiàn)出廣闊的研究價值和應(yīng)用前景.

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B－115(哈爾濱商業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程實驗室保藏).

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

蛋白胨10 g/L，牛肉膏 3 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，pH值7.2～7.4.將現(xiàn)有斜面菌種活化，37℃培養(yǎng)24 h.

1.2.2 種子培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基加2%葡萄糖，不加瓊脂.種子培養(yǎng):250 mL三角瓶裝液量50 mL，溫度37℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，置于搖床上培養(yǎng)18 h.

1.2.3 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基

還原糖 5.655%(玉米糖化液)，谷氨酸鈉5.800%，蛋白胨0.500%，KH2PO40.400%，MgSO40.125%，NaCl1.200%，MnSO40.008%，CaCl20.042%.搖瓶培養(yǎng):接種量2%，250 mL三角瓶裝液量為50 mL，轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度37℃，培養(yǎng)48 h.

1.3 玉米糖化液的制備

300 g市售玉米粉加水1 000 mL，加入1.05 g無水CaCl2煮沸，調(diào)節(jié)pH值為6.7～7.0，再加入α－耐高溫淀粉酶(120 U/g原料)，迅速降溫80～85℃，保溫15～20 min，繼續(xù)降溫至58～60℃，調(diào)節(jié)pH值為4.5，加糖化酶(150 U/g原料)，60℃保溫4 h后，再加熱煮沸10 min，過濾除渣，測定糖化液還原糖濃度，低溫保存?zhèn)溆?

1.4 分析方法

1.4.1 γ－PGA產(chǎn)率的測定

將發(fā)酵液稀釋后(發(fā)酵液∶水=1∶1)于9 000 r/min離心15 min除去菌體，取上清液10 mL，加入25 mL的無水乙醇，劇烈搖晃得到團狀物，將其轉(zhuǎn)入稱量瓶，置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中105～110℃下烘2～2.5 h，得到黃色塊狀粗樣品，并稱重.

1.4.2 pH值的測定

PHS－3C型pH計.

1.4.3 粘度的測定

采用DNJ－5S型數(shù)字式粘度計，25℃時二號轉(zhuǎn)子測定.

1.4.4 還原糖的測定

直接滴定法［11］.

1.4.5 谷氨酸及葡萄糖的測定

采用SBA－40D型生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所)測定.

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 碳源及其濃度對γ－PGA產(chǎn)率的影響

圖1為碳源種類和濃度對γ－PGA產(chǎn)率的影響結(jié)果.分別以1%的蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、玉米糖化液、糊精、檸檬糖為碳源，在培養(yǎng)基的其他組分固定情況下進行單因素實驗，結(jié)果如圖1(a).由圖1(a)可知，碳源中以玉米糖化液的發(fā)酵效果最好，產(chǎn)率最高.玉米糖化液中除了葡萄糖，還有木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、乙酸及少量糠醛等物質(zhì)，它優(yōu)于其它單一的碳源，可能就是因為它除了含有菌種生長所必需的碳源外還有其他微量元素和生長因子，其有利于菌種生長或?qū)酃劝彼岷铣擅傅幕钚杂兴岣?

圖1 碳源種類和濃度對γ－PGA產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of carbon source on γ-PGA synthesis

以玉米糖化液為碳源發(fā)酵，如圖1(b)，由圖1(b)可知，玉米糖化液濃度為6.5%時γ－PGA的產(chǎn)率最高.

2.1.2 氮源及其濃度對γ－PGA產(chǎn)率的影響

氮源對微生物的生長和目標(biāo)產(chǎn)物的積累有重要的影響，因此合適的氮源對于γ－PGA的發(fā)酵生產(chǎn)具有重要作用.分別選取硫酸銨、氯化銨、酵母粉、牛肉粉及各種蛋白胨作為氮源，在其他條件不變情況下進行單因素實驗，結(jié)果如圖2.由圖2可知，以蛋白胨作為氮源發(fā)酵效果最好，產(chǎn)率最高，說明本菌種能很好地利用有機氮源蛋白胨作為優(yōu)化氮源.

以普通蛋白胨為氮源，選擇不同濃度的普通蛋白胨進行發(fā)酵，結(jié)果如圖3.由圖3可知，當(dāng)普通蛋白胨濃度為0.4%時產(chǎn)率最高，而且過多的氮源不利于聚谷氨酸的合成.此外，當(dāng)普通蛋白胨濃度為0時，也有產(chǎn)物合成，說明普通蛋白胨不是發(fā)酵過程中唯一所需的氮源，綜合考慮，選擇氮源的添加量是0.4%的普通蛋白胨.

圖2 氮源對γ－PGA產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on γ-PGA syntheis

圖3 普通蛋白胨濃度對γ－PGA產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of concentration of nitrogen source on γ-PGA synthesis

2.1.3 前體物對γ－PGA產(chǎn)率的影響

其他條件不變的情況下，令谷氨酸鈉濃度為:0%，2%，4%，6%，8%，10%，結(jié)果如圖4.由圖4可知，當(dāng)谷氨酸鈉濃度為4%時發(fā)酵液黏度最大，當(dāng)不添加前體物時沒有聚谷氨酸形成，說明谷氨酸鈉是此菌發(fā)酵合成聚谷氨酸的必須物質(zhì).隨著谷氨酸鈉濃度的增大，粘度有所降低，但產(chǎn)率隨之上升，說明過多的前體物使γ－PGA的分子量有所下降，要取得的高分子γ－PGA同時又比較經(jīng)濟，選擇添加4%的前體物.

圖4 前體物濃度對發(fā)酵效果的影響Fig.4 Effect of concentration of sodium glutamate on γ-PGA synthesis

2.1.4 鎂離子對γ－PGA產(chǎn)率的影響

鎂離子能促進碳源的分解，加速菌體能量代謝，有助于細(xì)胞有氧氧化，且適量的鎂離子有助于減少發(fā)酵后期產(chǎn)生的乳酸;同時鎂離子又是鈣離子和鉀離子進出細(xì)胞所必須的，又是許多重要酶的激活劑［12］.

其他條件不變的情況下，改變MgSO4濃度，結(jié)果如圖5.由圖5可知，硫酸鎂濃度為0.15%時γ－PGA產(chǎn)率最大，其濃度小于或大于0.15%時，γ－PGA產(chǎn)率都有所下降，前者可能是由于鎂離子對γ－PGA合成酶激活不充分而使產(chǎn)率較低，后者則可能是高濃度的鎂離子對γ－PGA合成酶起到一定程度的抑制作用致使產(chǎn)率下降，因此選擇0.15%為硫酸鎂的優(yōu)化添加濃度.

圖5 鎂離子濃度對γ－PGA產(chǎn)率的影響Fig.5 Effect of concentration of Mg2+on γ-PGA synthesis

2.1.5 鈉離子對γ－PGA產(chǎn)率的影響

其他條件不變的情況下，改變NaCl濃度，結(jié)果如圖6.由圖6可知，當(dāng)氯化鈉濃度為1.0%時產(chǎn)率最大，隨著濃度的繼續(xù)增大或降低，產(chǎn)率都有不同幅度的降低，考慮到實際生產(chǎn)的費用問題，因此選擇1.0%的氯化鈉為培養(yǎng)基的優(yōu)化添加量.

圖6 鈉離子濃度對γ－PGA產(chǎn)率的影響Fig.6 Effect of concentration of Na+on γ-PGA synthesis

2.1.6 錳離子對γ－PGA產(chǎn)率的影響

微生物細(xì)胞內(nèi)的許多酶反應(yīng)中，二價錳離子都是激活劑，其激活作用可部分的替代鎂離子，錳離子和鎂離子共同促進激活酶的反應(yīng)，以彌補鎂離子的不足［13］.錳離子的濃度還控制著γ－PGA內(nèi)L－型谷氨酸和D－型谷氨酸的比例.錳離子濃度對γ－PGA產(chǎn)率的影響結(jié)果見圖7.由圖7可知，當(dāng)錳離子濃度為0.006%時，γ－PGA的產(chǎn)率最高，因此以0.006%的錳為優(yōu)選濃度.

2.1.7 鈣離子對γ－PGA產(chǎn)率的影響

Ca2+存在于細(xì)胞中控制細(xì)胞的生理狀態(tài)，調(diào)節(jié)質(zhì)膜的通透性，維持細(xì)胞體內(nèi)的滲透壓.Ca2+也是一些酶的激活劑和部分酶系構(gòu)成的必要因子，并對一些陽離子的毒性有拮抗作用［14］.Ca2+對聚谷氨酸產(chǎn)率的影響如圖8.由圖8可知，Ca2+濃度為0.03%時γ－PGA的產(chǎn)率最高.

圖7 錳離子濃度對γ－PGA產(chǎn)率的影響Fig.7 Effect of concentration of Mn2+on γ-PGA synthesis

圖8 鈣離子濃度對γ－PGA產(chǎn)率的影響Fig.8 Effect of concentration of Ca2+on γ-PGA synthesis

2.1.8 鉀離子對γ－PGA產(chǎn)率的影響

鉀離子濃度對γ－PGA產(chǎn)率的影響結(jié)果見圖9.由圖9可知，γ－PGA的產(chǎn)率隨著鉀離子濃度的上升而上升，但發(fā)酵液的粘度在鉀離子的濃度為0.8%時達到最大，隨著濃度的增加產(chǎn)量繼續(xù)上升，但是黏度有所下降，可能是高濃度的磷酸鹽抑制了聚谷氨酸合成酶的活性，影響了產(chǎn)物的聚合度，即表現(xiàn)為粘度下降，因此選擇磷酸鹽濃度為0.8%.

圖9 鉀離子濃度對γ－PGA產(chǎn)率的影響Fig.9 Effect of concentration of K+on γ-PGA synthesis

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1 初始pH值對γ－PGA產(chǎn)率的影響

考察初始 pH 值為 5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0和8.5時發(fā)酵產(chǎn)γ－PGA的情況，結(jié)果如圖10.培養(yǎng)基的PH值不同，將影響營養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，繼而影響微生物細(xì)胞的運輸機制，促進或妨礙一些營養(yǎng)物質(zhì)的吸收;另外，pH值過高或過低常常影響微生物細(xì)胞中諸多與代謝有關(guān)的酶的活性，進一步對微生物的生長和物質(zhì)代謝產(chǎn)生較大的影響.由圖10可知，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為6.5時，γ－PGA的產(chǎn)率最高，因此在發(fā)酵前調(diào)pH值到6.5有利于產(chǎn)物的合成.

圖10 初始pH對γ－PGA產(chǎn)率的影響Fig.10 Effect of initial pH on γ-PGA synthesis

2.2.2 接種量對γ－PGA合成的影響

培養(yǎng)了16～24 h的種子液，分別以1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%的接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵48 h后檢測γ－PGA的產(chǎn)量，結(jié)果如圖11所示:當(dāng)接種量為2%時，產(chǎn)量最高，隨著接種量的增加，產(chǎn)率隨之下降.不同接種量意味著不同的初始菌體濃度，它影響發(fā)酵結(jié)束的時間和γ－PGA的產(chǎn)量，它的大小影響細(xì)胞生長遲滯期的長短以及細(xì)胞倍增繁殖的速度.對發(fā)酵生產(chǎn)γ－PGA的過程來說，菌體只有在一定濃度范圍內(nèi)才能使γ－PGA維持比較滿意的產(chǎn)量，太低或太高的菌體濃度都不利于γ－PGA產(chǎn)量的提高.因此優(yōu)化接種量可認(rèn)定為2%.

圖11 接種量對γ－PGA產(chǎn)率的影響Fig.11 Effect of inoculation amount on γ-PGA synthesis

2.2.3 溫度對γ－PGA合成的影響

培養(yǎng)溫度直接影響菌體的生長速率和代謝途徑，以及菌種內(nèi)合成聚合物的酶活性，從而影響產(chǎn)物的合成.在轉(zhuǎn)速為150 r/min，發(fā)酵時間為48 h，裝液量50 mL的條件下，通過控制不同的培養(yǎng)溫度:31，33，35，37，39 ℃，γ－PGA 的產(chǎn)量隨溫度的變化如圖12所示:γ－PGA產(chǎn)率在37℃最大.

圖12 溫度對發(fā)酵效果的影響Fig.12 Effect of temperature on γ-PGA synthesis

2.2.4 溶氧對γ－PGA合成的影響

溶氧在好氧微生物發(fā)酵過程中是一個重要因素，產(chǎn)γ－PGA的枯草芽孢桿菌是好氧菌，而在γ－PGA這種高黏度發(fā)酵體系中尤為突出.聚谷氨酸在發(fā)酵的初始階段，體系的黏度很低，表現(xiàn)為低黏度牛頓體系，隨著聚合物的不斷積累，發(fā)酵體系的黏度不斷增加，特別在發(fā)酵后期，發(fā)酵體系成為高黏度非牛頓體系，影響了氧的傳遞和料液的氧密度，從而影響了菌體產(chǎn)γ－PGA的量.分別以搖瓶裝液量和搖床轉(zhuǎn)速來考察溶氧對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ－PGA的影響.用 250 mL的三角瓶，分別以 30，50，70，90，110 mL的裝液量進行發(fā)酵，結(jié)果如圖13所示:當(dāng)裝液量為50 mL/250 mL時發(fā)酵產(chǎn)率最高.

圖13 裝液量對γ－PGA產(chǎn)率的影響Fig.13 Effect of volume on γ-PGA synthesis

再以 50 mL 的裝液量，以 100，150，200，250 r/min的不同轉(zhuǎn)速進行發(fā)酵，結(jié)果如圖14所示:當(dāng)轉(zhuǎn)速在150 r/min較好，因其他轉(zhuǎn)速下發(fā)酵產(chǎn)率相對較低，但其發(fā)酵液粘度最高且提取產(chǎn)物彈性較好，在較低耗能下獲得較高分子量產(chǎn)物，因此綜合考慮選150 r/min為佳.

2.2.5 時間對γ－PGA合成的影響

γ－PGA是非生長偶聯(lián)型產(chǎn)物，并不隨菌體量同步增加，而是在細(xì)胞進入穩(wěn)定期后聚合物才大量合成.圖15為發(fā)酵時間對γ－PGA產(chǎn)率影響結(jié)果.由圖15可知，隨著發(fā)酵時間的增加，γ－PGA的產(chǎn)量也隨之增加，特別是當(dāng)發(fā)酵時間由84 h延長到96 h時，其產(chǎn)量也增加很多，但同時發(fā)酵液的顏色也加深很多，可能是菌體自溶產(chǎn)生某些物質(zhì)造成的，這樣不利于γ－PGA的提取純化，經(jīng)綜合考慮，發(fā)酵時間以選取84 h為宜.

圖14 轉(zhuǎn)速對γ－PGA產(chǎn)率的影響Fig.14 Effect of rotational speed on γ-PGA synthesis

圖15 發(fā)酵時間對γ－PGA產(chǎn)率的影響Fig.15 Effect of fermentation time on γ-PGA synthesis

2.3 優(yōu)化前后發(fā)酵規(guī)律曲線

圖16為優(yōu)化前后γ－PGA產(chǎn)率對比結(jié)果.由圖16可知，優(yōu)化后γ－PGA的產(chǎn)率可高達68.30 g/L，比優(yōu)化前提高了10.45 g/L.

圖16 優(yōu)化前后γ－PGA代謝合成曲線Fig.16 Metabolism synthesis curve of γ-PGA optimize and optimized

3 結(jié)論

通過實驗，確定了枯草芽孢桿菌發(fā)酵合成γ－PGA的優(yōu)化培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件:6.5%玉米糖化液、0.4%的普通蛋白胨、4%的前體物谷氨酸鈉、0.15%的硫酸鎂、0.006%硫酸錳、0.8%的磷酸二氫鉀、1.0%的氯化鈉、0.03%氯化鈣、初始pH值6.5、接種量2%、裝液量50 mL/250 mL、150 r/min、37 ℃培養(yǎng)84 h;優(yōu)化后γ－PGA的產(chǎn)率從57.85 g/L升高到68.30 g/L.

［1］Shih I L，Van Y T .The production of poly(γ-GlutamicAcid)from microorganism and its various applications［J］.Bioresource Technology，2001，79:207-225.

［2］施慶珊.γ－聚谷氨酸的微生物合成與應(yīng)用［J］.精細(xì)與專用化學(xué)品，2004，12(11):20-23.

［3］Kim K S，Kim T K，Graham N B .Contrilled releasebefabior of prodrugs based on the biodegradable poly(γglutamic acid)microspheres ［J］.Polymer Journal，1999，31:813-816.

［4］Choi H J，Kunioka M.Preparation conditions and swellinge-quilibria of hydrogel prepared by(γ-irradiation frommicrobial poly γ-glutamic acid) ［J］.Radiat Phys Chem，1995，46(2):175-179.

［5］Li C，Ke S，Wn Q P.Tumor irradiation enhances the tumor-specific distribution of poly(L-glutamic acid)-conjuga-tionpaclitaxel and its antitumor efficacy［J］.Clin Cancer Res，2000，16(7):2829-2834.

［6］Chio H J，Yang R，Kunioka M.Preparation conditions andswelling equilibria of hydrogel prepared by-irradiation from microbial poly(glutamic acid) ［J］.J Appl Polym Sci，1995，58:807-814.

［7］Kunioka M，F(xiàn)urusawa K.Poly(γ-glutamic acid)hydrog prepared from microbial poly(γ-glutamic acid) acd alkaced amine with water-soluble carnodiimide［J］.J Appl Polym Sci，1997，65:1889-1896 .

［8］Yasuyoshi A，Yuji F，Shuichi K.Health food with poly(γ-glutamic acid) as the chief ingredient:日 本，5095767A2［P］.1993-04-20.

［9］Konno A，Taguchi T，Yamaguchi T.Bakery products an noodles containing polyglutamic acid:US ，4888193［P］.1989.

［10］Yahata K，Sadanobu J，Endo T.Preparation of polybenz-γ-glutamic acid fiber［J］.Polym Prepr Jpn，1992，42:77.

［11］叢峰松.生物化學(xué)實驗［M］.上海:上海交通大學(xué)出版社，2005.

［12］陳三鳳，劉德虎.現(xiàn)代微生物遺傳學(xué)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2003:312.

［13］Ing-Lung Shih，Yi-TsongVan.The production of poly(γ-glutamic acid)from microorganisms and its various［J］.Bioresource Technology，2001，79(3):207-225.

［14］周德慶.微生物學(xué)教程［M］.北京:高等教育出版社，1996:104-106.

(責(zé)任編輯:葉紅波)

Biosynthesis of Macromolecular Polymers γ-PGA by Fermentation

LIANG Jin-zhong，WANG Feng-qing
(School of Food Engineering/Key Laboratory of Food Science and Engineering，Harbin University of Commerce，150076，China)

The fermentation media and culture conditions of Bacillus subtilis B-115 were optimized for producing poly γ-glutamic acid.The optimal fermentation conditions for poly γ-glutamic acid production were as follows:corn saccharification liquid 6.5%，peptone 0.4%，L-glutamate 4%，MgSO40.15%，MnSO40.006%，KH2PO40.8%，CaCl20.003%，NaCl 1%，inoculums level 2%，flask content 50 mL/250 mL，pH 6.5，temperatuer 37 ℃，rotation speed 150r·min－1，and fermentation time 84 h.Under the optimal conditions，the yield of γ-PGA was increased from 57.85 g/L to 68.3 g/L.

poly-γ-glutamic acid;media;culture conditions;macromolecular polymers

TS201.3

A

1671-1513(2011)01-0024-06

2010-09-23

黑龍江省“十一五”重大科技攻關(guān)項目(GA06B401－2).

梁金鐘，男，教授，主要從事微生物發(fā)酵方面的研究.