白地霉分批發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶動(dòng)力學(xué)模型的建立

王 揮 袁 強(qiáng)，2 張 敏 黎繼烈 李忠海

白地霉分批發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶動(dòng)力學(xué)模型的建立

王 揮1袁 強(qiáng)1，2張 敏1黎繼烈1李忠海1

(中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院1，長(zhǎng)沙 41004)
(湖南未名創(chuàng)林生物能源有限公司2，長(zhǎng)沙 410004)

對(duì)脂肪酶產(chǎn)生菌白地霉PP1315在5 L自控發(fā)酵罐中的分批發(fā)酵進(jìn)行了動(dòng)力學(xué)分析。探討了PP1315在5 L罐分批發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、脂肪酶合成及基質(zhì)消耗的變化規(guī)律，結(jié)果表明，菌體生長(zhǎng)呈典型S型曲線(xiàn)，酶的合成與菌體生長(zhǎng)趨勢(shì)呈現(xiàn)部分相關(guān)性，屬于部分偶聯(lián)型?；谶@些過(guò)程曲線(xiàn)的變化規(guī)律，結(jié)合Logistic方程和Luedeking－Piret方程，建立了脂肪酶產(chǎn)生菌PP1315分批發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力學(xué)模型，并通過(guò)數(shù)學(xué)推導(dǎo)和非線(xiàn)性擬合獲得了模型中各參數(shù)的最佳取值，脂肪酶合成動(dòng)力學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)為R2=0．925，確定了能夠較好表征PP1315分批發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物脂肪酶合成以及基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)方程。

脂肪酶 分批發(fā)酵 動(dòng)力學(xué)模型 非線(xiàn)性擬合

脂肪酶(Lipase，EC3．1．1．3)是一類(lèi)重要的甘油酯鍵水解酶，可以在油水界面上催化三酰甘油水解生成脂肪酸和甘油，以及中間產(chǎn)物甘油一酯和甘油二酯［1］。脂肪酶的產(chǎn)業(yè)化主要來(lái)源于微生物發(fā)酵［2］，目前工業(yè)上采用微生物發(fā)酵制備和提取脂肪酶應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、洗滌、皮革、造紙等行業(yè)［3］。近年來(lái)因其可催化各類(lèi)化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性、立體結(jié)構(gòu)選擇性轉(zhuǎn)化反應(yīng)等特點(diǎn)，促使脂肪酶在有機(jī)合成中得到廣泛應(yīng)用［4－5］。隨著礦化石油資源日益枯竭和人們生態(tài)環(huán)境保護(hù)意識(shí)的提高，使得脂肪酶催化合成生物柴油作為可再生替代環(huán)保燃料為世人矚目［6－8］。

采用微生物發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的過(guò)程具有多樣性、耦合性、時(shí)變性和非線(xiàn)性等特點(diǎn)，既包括了細(xì)胞內(nèi)各種各樣的生化反應(yīng)，也涉及細(xì)胞間各種物質(zhì)交換的復(fù)雜體系［9］，由此可見(jiàn)對(duì)微生物發(fā)酵規(guī)模放大過(guò)程規(guī)律的研究，是發(fā)酵產(chǎn)品能否實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵［10］。根據(jù)張敏［11］對(duì)白地霉 PP1315 搖瓶發(fā)酵的研究可知，白地霉PP1315發(fā)酵是一個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程，因此深入探討白地霉PP1315在發(fā)酵罐中的分批發(fā)酵條件和動(dòng)力學(xué)特征，對(duì)于促進(jìn)脂肪酶的規(guī)?；a(chǎn)很有必要。本研究通過(guò)建立白地霉PP1315分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型，旨在實(shí)現(xiàn)白地霉PP1315產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化控制，降低生產(chǎn)成本，為進(jìn)一步放大試驗(yàn)和連續(xù)發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料、試劑與儀器

白地霉(Geotrichum candidum)PP1315:由本課題組經(jīng)多次誘變選育并保藏于發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室。

斜面培養(yǎng)基:麥芽糖40 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂粉15 g/L。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖2．0 g/L，蛋白胨 2．5 g/L，K2HPO40．1 g/L，橄欖油1．0 mL/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉15 g/L，豆餅粉10 g/L，橄欖油 10 ml/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 1．5 g/L。

B型SL 5 L全自動(dòng)控制發(fā)酵罐:上海保興生物設(shè)備工程有限公司;Avanti J－E高速冷凍離心機(jī):美國(guó)貝克曼公司。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 種子制備

500 mL搖瓶裝種子培養(yǎng)基100 mL，接斜面活化好的菌種兩環(huán)，在28℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)24 h，備用。

1．2．2 分批發(fā)酵

在5 L全自動(dòng)發(fā)酵罐中裝發(fā)酵培養(yǎng)基3 L，并加入0．05%的泡敵，在0．1 MPa、121℃的的條件下滅菌20 min，冷卻后接種 5%(體積比)，發(fā)酵溫度28 ℃，pH 6．0，直到發(fā)酵結(jié)束。

用復(fù)膜氧電極和pH電極在線(xiàn)測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中的溶氧和pH變化，發(fā)酵過(guò)程中流加6 mol/L NaOH以控制pH，通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量約1．0 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速200～500 r/min，控制溶氧水平在20%以上，并在有必要時(shí)及時(shí)流加泡敵。每6 h取一次樣，測(cè)定總糖、菌體生物量和脂肪酶酶活，每次做3個(gè)平行試驗(yàn)，取其平均值(相對(duì)誤差小于5%)。

1．2．3 分析方法

總糖的測(cè)定采用3，5－二硝基水楊酸(DNS)法［12］。

脂肪酶的活力測(cè)定采用堿滴定法［13］。

菌體生物量的測(cè)定采用干重法，取5 mL發(fā)酵液離心后，用蒸餾水洗2次，再離心，60℃烘箱內(nèi)烘干至恒重后稱(chēng)重。

1．2．4 數(shù)據(jù)處理

模型參數(shù)的優(yōu)化及動(dòng)力學(xué)參數(shù)的獲取均運(yùn)用Origin 7．5對(duì)動(dòng)力學(xué)方程非線(xiàn)性擬合獲得。

2 結(jié)果與分析

2．1 脂肪酶發(fā)酵過(guò)程代謝變化特征

在分批發(fā)酵過(guò)程中，白地霉PP1315脂肪酶發(fā)酵過(guò)程代謝變化如圖1所示。在0～18 h，菌體生長(zhǎng)延遲期

，

該段時(shí)間內(nèi)菌體碳源消耗少，菌體生物量增加較慢，脂肪酶產(chǎn)量為0，18 h后菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)期，菌體耗糖量明顯上升，脂肪酶產(chǎn)量隨著菌體的生長(zhǎng)迅速增加，60 h進(jìn)入穩(wěn)定期后，菌體生物量幾乎不增加，耗糖量減少，但是脂肪酶產(chǎn)量繼續(xù)上升，96 h是活力達(dá)到最高240．15 U/mL，因此該脂肪酶的合成屬于生長(zhǎng)部分耦聯(lián)型。96 h后脂肪酶合成速率也開(kāi)始下降，108 h停止發(fā)酵。

圖1 白地霉PP1315脂肪酶發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)

2．2 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)模型，由于在分批發(fā)酵過(guò)程中底物及菌體濃度對(duì)生長(zhǎng)的限制作用不容忽略，故不宜采用Monod方程來(lái)描敘分批發(fā)酵菌體模型，目前多采用非結(jié)構(gòu)模型來(lái)描述，Logistic方程能很好地反映分批發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)的一般規(guī)律，是目前應(yīng)用較為普遍的方程之一，常用于細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的描述。同時(shí)，由于白地霉PP1315細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)為S形，因此，將其應(yīng)用于白地霉PP1315液體發(fā)酵中，可得白地霉PP1315生長(zhǎng)的Logistic方程，其可積分為代數(shù)方程:

Logistic方程可積分為代數(shù)方程:

式(2)中:μm為菌體最大生長(zhǎng)速率;X為菌體生物量/g/L;X0為初始菌體生物/g/L;Xm為最大菌體生物量/g/L;t為時(shí)間/h。

運(yùn)用Origin 7．5對(duì)菌體生長(zhǎng)試驗(yàn)值按照公式(2)進(jìn)行非線(xiàn)性擬合，結(jié)果如圖2。

圖2 菌體生長(zhǎng)的試驗(yàn)值與模型計(jì)算值的比較

菌體干質(zhì)量(X)隨發(fā)酵時(shí)間變化的函數(shù)為:

式中:X0=0．008 96 g/L，Xm=23．587 g/L，μm=0．210 83。從圖2可知，式(3)的計(jì)算值可以較好的與試驗(yàn)數(shù)據(jù)相吻合R2=0．988，該方程能夠作為白地霉PP1315脂肪酶合成優(yōu)化控制的參考依據(jù)，發(fā)酵結(jié)束前期菌體自溶，導(dǎo)致試驗(yàn)值與擬合值在發(fā)酵后期有較大的偏差。

2．3 脂肪酶合成動(dòng)力學(xué)

在微生物的分批發(fā)酵過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的生物合成途徑十分復(fù)雜，其代謝調(diào)節(jié)機(jī)制特點(diǎn)各異。Gaden［14］根據(jù)產(chǎn)物生成速率與細(xì)胞生長(zhǎng)速率之間的關(guān)系，將產(chǎn)物的形成與微生物細(xì)胞生長(zhǎng)關(guān)系的動(dòng)力學(xué)模式分為三類(lèi):Ⅰ產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)偶聯(lián)型;Ⅱ產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)部分偶聯(lián)型;Ⅲ產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)非偶聯(lián)型。Luedeking和 Piret［14］對(duì)此進(jìn)行了總結(jié)，提出了著名的Luedeking－Piret方程用來(lái)描述產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系。

Luedeking－Piret方程:

式中:α≠0、β=0表示第Ⅰ類(lèi)發(fā)酵;α≠0、β≠0表示第Ⅱ類(lèi)發(fā)酵;α=0、β≠0表示第Ⅲ類(lèi)發(fā)酵。從白地霉PP1315分批發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果可以判斷，白地霉PP1315產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵過(guò)程屬于產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)呈部分偶聯(lián)型，結(jié)合式(2)和式(4)，Luedeking－Piret方程可積分為代數(shù)方程:

式中:P為脂肪酶酶活/U/mL;P0為初始脂肪酶酶活/U/mL;α為生長(zhǎng)耦聯(lián)系數(shù);β為非生長(zhǎng)耦聯(lián)系數(shù)。

由于0 h時(shí)，P0=0，X0對(duì)產(chǎn)物的影響可以忽略不計(jì)，方程5可以簡(jiǎn)化為:

運(yùn)用Origin 7．5對(duì)白地霉PP1315脂肪酶合成發(fā)酵試驗(yàn)值按照式(6)進(jìn)行非線(xiàn)性擬合，結(jié)果如圖3所示，得到脂肪酶合成量(P)隨發(fā)酵時(shí)間變化的函數(shù):

其中 α =4．346 36，β =0．104 36，在圖 3 可知式(7)能夠較好的擬合所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)(R2=0．925)，較好的描敘了發(fā)酵過(guò)程中脂肪酶的合成情況，脂肪酶在合成后期，發(fā)酵液中蛋白酶以及其他限制性因素的積累，脂肪酶緩慢變性導(dǎo)致失活，故在發(fā)酵后期試驗(yàn)值與擬合值有所偏差。

圖3 脂肪酶活的試驗(yàn)值與模型計(jì)算值的比較

2．4 基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)

在白地霉PP1315脂肪酶發(fā)酵過(guò)程中，碳源的消耗主要有3個(gè)方面:一是用于細(xì)胞生長(zhǎng)，二是細(xì)胞維持基本生命活動(dòng)消耗，三是用于合成產(chǎn)物?；|(zhì)消耗可以用與Luedeking－Piret相似的方程表示。

在分批發(fā)酵過(guò)程中，碳源的消耗可用如下動(dòng)力學(xué)模型表示:

結(jié)合方程式(4)、(5)和(8)積分可得:

式中:S為總糖濃度/g/L;YX/S為碳源用于菌體生長(zhǎng)的得率常數(shù)，λ=1/YX/S;γ為碳源用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)/h－1;

按照式(9)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中總糖值進(jìn)行非線(xiàn)性擬合，結(jié)果如圖4所示，得到基質(zhì)消耗量隨發(fā)酵時(shí)間變化的方程:

式中:S0=19．584 g/L，λ =0．664 07，γ =－0．000 54。式(10)能夠較好的描敘脂肪酶合成過(guò)程中底物消耗的情況(R2=0．975)，由圖4可以看出發(fā)酵后期由于少量菌體自溶導(dǎo)致發(fā)酵后期試驗(yàn)值與擬合值有一定偏差。

圖4 基質(zhì)消耗的試驗(yàn)值與模型計(jì)算值的比較

2．5 模型的驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷恼`差，在相同試驗(yàn)條件下進(jìn)行3次發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)取平均值，實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)計(jì)算值進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表1。模型預(yù)測(cè)計(jì)算值與實(shí)測(cè)值誤差在發(fā)酵開(kāi)始期及其發(fā)酵后期較大，在發(fā)酵過(guò)程中誤差較小，總體來(lái)說(shuō)絕大部分誤差低于10%，模型計(jì)算值能夠較好的反映實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中的試驗(yàn)值，因此該發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型能夠較好地描敘白地霉PP1315產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、基質(zhì)消耗和產(chǎn)物合成的變化規(guī)律。

表1 試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)計(jì)算值的比較

3 結(jié)論

本研究分別利用 Logistic方程和 Luedekingpiret方程描述了白地霉PP1315產(chǎn)脂肪酶的分批發(fā)酵過(guò)程，建立了菌體生長(zhǎng)、脂肪酶合成和基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)模型。分別為:

(1)菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型(2)脂肪酶合成動(dòng)力學(xué)模型

(3)基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型

試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)值能夠與模型預(yù)測(cè)值較好擬合，菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)為 R2=0．988，基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)為 R =0．975，由于在發(fā)酵后期脂肪酶的緩慢失活，脂肪酶實(shí)際活力與模型理論值存在一定差異，脂肪酶合成動(dòng)力學(xué)模型的相關(guān)系數(shù)為R2=0．925，但是總體上而言該模型的建立可以解釋白地霉PP1315脂肪酶動(dòng)力學(xué)規(guī)律，可為實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成及基質(zhì)消耗的預(yù)測(cè)與控制提供參考。

［1］Norin M，Olsen，Svendsen A．Theoretical studies of Rhizomucor miehei lipase activation［J］．Protein Engineering，1993，6(8):855－863

［2］Elibol M，Ozer D．Influence of oxygen transfer on lipase production by Rhizopus arrhizus［J］．Process Biochemistry，2000，36:325 －329

［3］Rohit S，Uttam C B．Production，purification，characterization，and applications of lipases［J］．Biotechnol Ogy Advances，2001，19:627 －662

［4］Jaeger K E，Eggert T．Lipases for bioTech－nology［J］．Current Opinion in BioTech－nology，2002，3(4):390 －397

［5］Kazlauskas R J，Bornscheuer U T．Biotransformations with lipases［J］．BioTech－nology，1998，8:37 －50

［6］Glória P M，Mudge SM．Cleaning oiled shores:laboratory experiments testing thepotential use of vegetable oil biodiesels［J］．Chemosphere，2004，54:297 －304

［7］Wardle D A．Global sale of green air travel supported using biodiesel［J］．Renewable and Sustainable Energy Reviews，2003，7:1 －64

［8］Iso M，Chen B，Eguchi M．Production of biodiesel fuel from triglyceride andalcohol using i－ mmobilized lipase［J］．Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic，2001，16:53 －58

［9］劉朝輝，陳云，齊崴，等．中性－甘露聚糖酶分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究［J］．化學(xué)工程，2008，36(10):66 －71

［10］張建國(guó)，陳曉明，賀新生．靈芝胞外多糖分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型［J］．生物工程學(xué)報(bào)，2007，23(6):1065 －1070

［11］張敏．產(chǎn)脂肪酶菌株的選育、發(fā)酵條件優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)研究［D］．長(zhǎng)沙:中南林業(yè)科技大學(xué)，2010

［12］Huang JX，Yang JS，Wei Y．Dynamic models for polyhydroxybutyrate fermentation process［J］．Chemical engineering，2005，33(1):44 －47

［13］江慧芳，王雅琴，劉春國(guó)．三種脂肪酶活力測(cè)定方法的比較及改進(jìn)［J］．化學(xué)與生物工程．2007，8(24):72－74

［14］戚以政，汪叔雄．生化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)與反應(yīng)器［M］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，1999:140－147．

Establishment of Batch Fermentation Kinetics of Lipase Producing Strain Geotrichum Candidum

Wang Hui1Yuan Qiang1，2Zhang Ming1Li Jilie1Li Zhonghai1
(College of Life Science and Tech－nology，Central South University of Forestry and Tech－nology1，Changsha 410004)
(Hunan Weiming Chuanglin Bio － energy Co，．Ltd2，Changsha 410004)

The kinetics of lipase batch fermentation process was studied by Geotrichum candidum(PP1315)in a 5L stirred bioreactor．Firstly cell growth，product formation and substrate consumption throughout the lipase fermentation were investigated．The result showed that cell growth of PP1315 was characterized as an S － type curve，which presented a partial correlation with lipase synthesis．So，the partial coupling model was concluded．Based on variations of these process curves，the kinetics models for cell growth，lipase synthesis and substrate consumption were established according to the Logistic equation and Luedeking－Piret equation．Through the nonlinear regression and mathematical derivation，the optimal parameters in the above models were obtained．Finally，the kinetics equations of cell growth，lipase synthesis and substrate consumption，which was characterized in the batch fermentation process of PP1315，were obtained．

lipase，batch fermentation，kinetics model，nonlinear regression

Q814

A

1003－0174(2011)10－0061－05

國(guó)家林業(yè)局948計(jì)劃(2010－4－22)，國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2009BADB1B10)

2010－12－23

王揮，男，1974年出生，博士，食品生物技術(shù)

黎繼烈，女，1959年出生，教授，食品生物技術(shù)