干熱和濕熱工藝對(duì)大豆轉(zhuǎn)基因成分及調(diào)控元件影響的比較研究

王 林 韓 飛 李愛(ài)科 韓 偉 劉建學(xué)

干熱和濕熱工藝對(duì)大豆轉(zhuǎn)基因成分及調(diào)控元件影響的比較研究

王 林1，2韓 飛1李愛(ài)科1韓 偉1劉建學(xué)2

(國(guó)家糧食局科學(xué)研究院1，北京 100037)
(河南科技大學(xué)食品學(xué)院2，洛陽(yáng) 471003)

以轉(zhuǎn)基因大豆為試驗(yàn)材料，運(yùn)用定性PCR的方法研究了干熱和濕熱兩種制粒加工工藝對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆內(nèi)源基因Lectin、外源基因Cp4 epsps以及啟動(dòng)子和終止子的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大豆經(jīng)過(guò)130℃干熱處理3 min或100℃濕熱處理15 min后，內(nèi)源基因降解到407 bp以下;經(jīng)過(guò)120℃加熱9 min或100℃濕熱處理15 min后，外源基因降解到408 bp以下;干熱處理對(duì)啟動(dòng)子的片段長(zhǎng)度并沒(méi)有影響，而當(dāng)加工條件達(dá)到130℃干熱9 min時(shí)，終止子125 bp的片段開(kāi)始會(huì)產(chǎn)生降解;當(dāng)100℃、3 min濕熱處理后啟動(dòng)子和終止子都會(huì)產(chǎn)生降解。結(jié)果表明，不同干熱和濕熱制粒工藝對(duì)大豆轉(zhuǎn)基因成分及調(diào)控元件的降解均有不同程度的影響。

加工工藝 基因 啟動(dòng)子 終止子 PCR技術(shù)

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展，近年來(lái)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品開(kāi)發(fā)研究不斷深入，越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品商品化，相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)占有率也明顯增加。轉(zhuǎn)基因大豆及其制品日益增多，己經(jīng)直接或間接地影響到人們的生活。也正因如此，轉(zhuǎn)基因大豆及其制品對(duì)人體健康及生態(tài)環(huán)境的影響引起人們的廣泛關(guān)注。大豆加工過(guò)程中DNA的量及降解程度都因其加工工藝不同而不同，全面了解大豆加工過(guò)程中內(nèi)外源基因及調(diào)控元件的降解變化規(guī)律對(duì)規(guī)范大豆生產(chǎn)工藝、提高其相關(guān)產(chǎn)品的管理力度具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究參考主要原料大豆轉(zhuǎn)基因品系和外源基因種類，以大豆凝集素基因(Lectin)為內(nèi)標(biāo)基因［1－2］，設(shè)計(jì)了不同引物來(lái)檢測(cè)其外源基因Cp4 epsps、啟動(dòng)子CaMv35s和終止子Nos，從核酸定性分析水平上，利用PCR技術(shù)研究干熱和濕熱的制粒加工工藝對(duì)大豆中內(nèi)外源基因、啟動(dòng)子及終止子片段長(zhǎng)度的影響，建立定性PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的特異性檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

轉(zhuǎn)基因大豆:河北三河匯福糧油有限公司;液氮:北京城信順興氣體原料銷售有限公司;苯酚:上海源景化學(xué)品有限公司;氯仿、乙醇(分析純):北京化工廠;TE緩沖液:上海索萊寶生物科技有限公司;Taq酶、DNA Marker:大連寶生物工程有限公司;Goldenview核酸染料:北京天恩澤基因科技有限公司;瓊脂糖:北京拜爾迪生物公司。

1．2 儀器與設(shè)備

PL403－IC電子天平:梅特勒－托利多儀器有限公司;DK－8D電熱恒溫水槽、DGG－9140AD電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱:上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;溫育機(jī)(ThermoStat plus)、PCR 擴(kuò)增儀(Mastercycler 5333)、離心機(jī)(5424)、混勻器(Thermomixer comfort):德國(guó)艾本德公司;DYY－8C電泳儀:北京六一化工廠。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 引物的設(shè)計(jì)

針對(duì)Lectin基因設(shè)計(jì)了3對(duì)引物序列，擴(kuò)增片段大小分別為 1 060 bp、836 bp、407 bp，針對(duì) Cp4 epsps基因設(shè)計(jì)了3對(duì)引物序列，擴(kuò)增片段大小分別為1 512 bp、408 bp、190 bp，針對(duì)啟動(dòng)子 CaMV35 s和終止子各設(shè)計(jì)了一對(duì)引物序列，擴(kuò)增片段大小分別為165 bp和125 bp。

1．3．2 樣品的制備與處理

大豆的干熱加工處理:取一定量的轉(zhuǎn)基因大豆粉，放入離心管中，設(shè)置8個(gè)溫度梯度，分別為60、70、80、90、100、110、120、130 ℃，進(jìn)行干熱處理，處理時(shí)間分別為3、6、9 min。大豆的濕熱加工處理:將大豆置于高壓滅菌鍋內(nèi)70、80、90、100 ℃各放置3、9、15 min。

1．3．3 大豆DNA的提取

稱取100 mg試樣在液氮中充分研磨成粉狀至1．5 mL離心管中，加入1 mL、65℃預(yù)熱的CTAB抽提緩沖液，充分均勻混合后置恒溫箱中65℃溫育30 min，其間充分顛倒混勻2～3次。12 000 r/min室溫下離心10 min，取上清液至新的離心管中，用等體積苯酚/氯仿溶液(1∶1)抽提，充分混勻。12 000 r/min離心10 min，取上清液后再用等體積的氯仿抽提一次。12 000 r/min離心10 min。轉(zhuǎn)移上清于0．6倍體積經(jīng)－20℃預(yù)冷的異丙醇中，并在－20℃下靜置30 min，12 000 r/min離心20 min以沉淀 DNA。棄上清，加入1 mL－20℃預(yù)冷的70%乙醇清洗沉淀物，短時(shí)間離心后棄乙醇，重復(fù)洗滌過(guò)程一次。在吸水紙巾上風(fēng)干，直至乙醇揮發(fā)殆盡。干燥后加入100μL TE緩沖液，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．4 PCR 的擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系:5μL PCR反應(yīng)緩沖液，2 mmol Mg2+，1．25U Taq 酶，dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各0．2 mmol/L，0．4 μmol/L 引物，一定量的模板 DNA，滅菌超純水補(bǔ)齊至50μL。

Lectin基因PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性 30 s，62．1 ℃ (60．8、58．1℃)退火 90 s(60、60 s)，72 ℃延伸90 s(60、60 s)，40 cycles，72 ℃延伸5 min。

Cp4 epsps基因 PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性 30 s，60．3 ℃(57、60 ℃)退火 90 s(60、60 s)，72 ℃ 延伸 90 s，40 cycles，72 ℃ 延伸5 min。

CaMv基因PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性 30 s，54．5 ℃ 退火 60 s，72 ℃ 延伸 90 s，40 cycles，72 ℃延伸 5 min。

Nos基因PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，45．5 ℃ 退火 60 s，72 ℃ 延伸 90 s，40 cycles，72 ℃延伸 5 min。

1．3．5 PCR 產(chǎn)物檢測(cè)

引物 Lec3/Lec3．、引物 Cp2/Cp2．、引物 Cp3/Cp3．、引物 CaMv1/CaMv1．、引物 CaMv2/CaMv2．、引 物 CaMv3/CaMv3．、引 物 Nos1/Nos1．、Nos2/Nos2．在2．0%的瓊脂糖凝上 100 V恒壓，電泳35 min。

引物 Lec1/Lec1．、引物 Lec2/Lec2．、引物 Cp1/Cp1．、引物 EPSPS1/EPSPS1．、在 1．0% 瓊脂糖凝膠上100 V恒壓，電泳35 min。完畢后置凝膠成像儀中記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2．1 干熱處理對(duì)大豆內(nèi)源基因的影響

2．1．1 干熱處理對(duì)內(nèi)源基因Lectin的影響

圖1至圖3所示為不同的干熱處理?xiàng)l件(溫度梯度分別為 60、70、80、90、100、110、120、130 ℃ 各進(jìn)行干熱處理，處理時(shí)間分別為3、6、9 min)下，內(nèi)源基因Lectin 1 060 bp、Lectin 836 bp和Lectin 407 bp片段的降解情況。

圖1 大豆經(jīng)過(guò)干熱處理后Lectin 1 060 bp片段的PCR擴(kuò)增電泳圖

由圖1a可以看出，在1～16的干熱條件下Lectin 1 060 bp片段沒(méi)有產(chǎn)生降解;而在17～24(圖1b)中，內(nèi)源基因Lectin 1 060 bp片段已檢測(cè)不出。

圖2 大豆經(jīng)過(guò)干熱處理后Lectin 836 bp片段的PCR擴(kuò)增電泳圖

由圖2a可以看出，在1～18的干熱條件下Lectin 836 bp片段沒(méi)有產(chǎn)生降解;而在19～24(圖2b)中，內(nèi)源基因Lectin 836 bp片段已檢測(cè)不出。

圖3 大豆經(jīng)過(guò)干熱處理后Lectin 407 bp片段的PCR擴(kuò)增電泳圖

由圖3a可以看出，在1～12的干熱條件下Lectin 407 bp片段沒(méi)有產(chǎn)生降解情況;而在22～24(圖3b)中，內(nèi)源基因Lectin 407 bp片段已檢測(cè)不出。

圖1～圖3可知，從60℃一直加熱到100℃所測(cè)Lectin基因片段都未出現(xiàn)降解情況，但經(jīng)過(guò)110℃，6 min處理后，1 060 bp片段開(kāi)始被降解(圖1b)，不能再檢測(cè)到;當(dāng)溫度升高到120℃，時(shí)間到達(dá)3 min時(shí)，836 bp的DNA片段不能被檢測(cè)到(圖2b);隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，當(dāng)條件達(dá)到130℃，3 min時(shí)Lectin逐漸被降解到407 bp以下(圖3b)。

2．1．2 干熱處理對(duì)外源基因Cp4 epsps的影響

圖4至圖6所示為不同的干熱處理?xiàng)l件(溫度梯度分別為 60、70、80、90、100、110、120、130 ℃ 各進(jìn)行干熱處理，處理時(shí)間分別為3、6、9 min)下，外源基因 Cp4 epsps 1 512 bp、Cp4 epsps 408 bp和 Cp4 epsps 190 bp片段的降解情況。

圖4 大豆經(jīng)過(guò)干熱加工后Cp4 epsps1 512 bp片段的PCR擴(kuò)增電泳圖

由圖4a可知，在1～12的干熱條件下Cp4 epsps 1 512 bp片段并未產(chǎn)生降解情況;而在13～24(圖4b)中，外源基因Cp4 epsps 1 512 bp片段已檢測(cè)不出。

圖5 大豆經(jīng)過(guò)干熱處理后Cp4 epsps408 bp片段的PCR擴(kuò)增電泳圖

由圖5a可知，在1～12干熱條件下Cp4 epsps 408 bp片段沒(méi)有產(chǎn)生降解的情況;而在21～24(圖5b)中，外源基因Cp4 epsps 408 bp片段已檢測(cè)不出。

圖6 大豆經(jīng)過(guò)干熱處理后Cp4 epsps190 bp片段的PCR擴(kuò)增電泳圖

由圖6可知，在1～24(60℃加熱3 min到130℃加熱9 min)的加工條件下外源基因Cp4 epsps 190 bp片段始終未產(chǎn)生降解的情況。

由圖4～圖6可知，在60～90℃所測(cè)大豆Cp4 epsps基因都未出現(xiàn)降解情況，但大豆經(jīng)過(guò)100℃加熱3 min處理后1 512 bp片段就開(kāi)始被降解了，不能再檢測(cè)到(圖4b);當(dāng)溫度升高到120℃，9 min的時(shí)候，408 bp的DNA片段不能被檢測(cè)到(圖5b)，DNA逐漸被降解。

2．1．3 干熱處理對(duì)啟動(dòng)子CaMv 35S與終止子Nos的影響

圖7和圖8所示為不同的干熱處理?xiàng)l件(溫度梯度分別為 60、70、80、90、100、110、120、130 ℃各進(jìn)行干熱處理，處理時(shí)間分別為3、6、9 min)下，啟動(dòng)子CaMv35S165 bp片段與終止子Nos 125 bp片段的降解情況。

圖7 大豆經(jīng)過(guò)干熱處理后啟動(dòng)子CaMv 35S165 bp片段的PCR擴(kuò)增電泳圖

由圖7可以看出，在1～24(60℃加熱3 min到130℃加熱9 min)的加工過(guò)程中啟動(dòng)子CaMv35S 165 bp片段都未產(chǎn)生降解。

圖8 大豆經(jīng)過(guò)干熱處理后啟動(dòng)子終止子Nos 125 bp片段的PCR擴(kuò)增電泳圖

由圖8可知，當(dāng)干熱條件達(dá)到24(130℃加熱9 min)時(shí)，終止子Nos 125 bp片段已檢測(cè)不出。

從圖 7～圖 8可以看出，在 60℃加熱3 min到130℃加熱9 min加工范圍內(nèi)，干熱處理并未對(duì)啟動(dòng)子產(chǎn)生很大的影響(圖7);而當(dāng)加工條件達(dá)到130℃加熱9 min時(shí)，終止子125 bp的片段開(kāi)始產(chǎn)生降解(圖8b)。

2．2 濕熱處理對(duì)大豆基因及調(diào)控元件的影響

2．2．1 濕熱處理對(duì)內(nèi)源基因Lectin的影響

圖9表示的是濕熱處理對(duì)內(nèi)源基因Lectin的影響PCR電泳擴(kuò)增圖，濕熱處理即是將大豆置于蒸汽高壓鍋中，不同溫度各放置3、9、15 min，當(dāng)條件達(dá)到70℃，3 min時(shí)1 060 bp的片段就不能檢測(cè)到了(圖9a)，1 060 bp的片段只能在大豆原料中存在;當(dāng)條件達(dá)到100℃，9 min時(shí)Lectin的片段就降解到836 bp以下(圖9b);當(dāng)條件到達(dá)100℃，15 min時(shí)Lectin片段降解到407 bp以下(圖9c)。

圖9 大豆經(jīng)過(guò)濕熱處理后不同片段內(nèi)源基因Lectin的PCR擴(kuò)增電泳圖

2．2．2 濕熱處理對(duì)外源基因Cp4 epsps的影響

圖10為將大豆置于蒸汽高壓鍋中70、80、90、100℃，各放置3、9、15 min得到 Cp4 epsps基因不同片段的擴(kuò)增結(jié)果圖，1 512 bp這樣大一些片段在處理90℃濕熱9 min已經(jīng)不能檢測(cè)到了(圖10a);經(jīng)過(guò)100℃濕熱15 min處理后408 bp的片段不能被檢測(cè)到(圖10b)，190 bp的小片段在所有處理后仍能檢測(cè)到(圖10c)。

圖10 大豆經(jīng)過(guò)濕熱處理后外源基因Cp4 epsps的PCR擴(kuò)增電泳圖

2．2．3 濕熱處理對(duì)啟動(dòng)子CaMv35S與Nos終止子的影響

當(dāng)加工條件達(dá)到100℃濕熱3 min時(shí)，啟動(dòng)子CaMv35S165 bp片段就再也檢測(cè)不到了(圖11a)。當(dāng)試驗(yàn)條件達(dá)到100℃濕熱3 min時(shí)，終止子Nos 125 bp的片段已經(jīng)降解(圖11b)，相比干熱處理，濕熱加工更能對(duì)啟動(dòng)子和終止子產(chǎn)生降解。

圖11 大豆經(jīng)過(guò)濕熱處理后啟動(dòng)子CaMv35S與Nos終止子的PCR擴(kuò)增電泳圖

3 討論與結(jié)論

目前市場(chǎng)上大多數(shù)的大豆為轉(zhuǎn)基因大豆，從理論上來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品經(jīng)過(guò)若干的加工程序，例如物理、化學(xué)或者酶因子都會(huì)使DNA被破壞［3］。Gawienowski MC等［4］研究表明，經(jīng)浸泡、濕磨等加工過(guò)程能使玉米基因和質(zhì)粒DNA降解，135℃加熱2 h后，DNA幾乎完全降解。Rogan等［5］認(rèn)為，浸泡后又經(jīng)過(guò)物理破碎處理而做成的豆奶、豆腐和熱加工做成的玉米糊和馬鈴薯，沒(méi)有檢測(cè)出大于1．1 kb的DNA片段。Chiter等［6］對(duì)飼料中的一些植物性原料，如油菜籽、小麥粉、亞麻籽、大豆、新鮮的玉米粉和玉米粒、甜菜及甜菜漿中DNA的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，對(duì)作物原料至少進(jìn)行5 min不低于95℃的熱處理是降解DNA所必需的，但對(duì)作物葉片和種子采用如研磨、粉碎等物理方法處理不能有效地降解其DNA。陳穎等［7］研究了大豆在加工為豆腐、豆奶和豆粉過(guò)程中各項(xiàng)加工工藝對(duì)CaMv啟動(dòng)子和Nos終止子調(diào)控元件的影響，發(fā)現(xiàn)調(diào)控元件在食品加工過(guò)程中的降解變化與其所處位置有較大關(guān)系，大豆基因組DNA序列片段受加工過(guò)程的影響較小，在3種豆制品的加工過(guò)程中均能測(cè)到，原料經(jīng)過(guò)加工后片段大小降解至200 bp以下;Nos終止子受食品加工工藝影響較小，在被檢測(cè)的每個(gè)食品加工過(guò)程中均能檢測(cè)到。此次試驗(yàn)的目的在于如何利用加工環(huán)節(jié)破壞轉(zhuǎn)基因成分，降低轉(zhuǎn)基因糧食的食用和使用安全風(fēng)險(xiǎn)，以轉(zhuǎn)基因大豆為原料對(duì)其內(nèi)外源基因及調(diào)控元件進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)大豆在經(jīng)過(guò)干熱和濕熱的制粒工藝后，其內(nèi)源基因Lectin、外源基因Cp4 epsps、啟動(dòng)子CaMv、終止子Nos都會(huì)引起不同程度的降解。研究表明，大豆經(jīng)過(guò)130℃干熱處理3 min或100℃濕熱處理15 min后，內(nèi)源基因降解到407 bp以下;經(jīng)過(guò)120℃加熱9 min或100℃濕熱處理15 min后，外源基因降解到408 bp以下;干熱處理對(duì)啟動(dòng)子的片段長(zhǎng)度并沒(méi)有影響，而當(dāng)加工條件達(dá)到130℃干熱9 min時(shí)，終止子125 bp的片段開(kāi)始會(huì)產(chǎn)生降解;當(dāng)100℃，3 min濕熱處理后啟動(dòng)子和終止子都會(huì)產(chǎn)生降解，不同干熱和濕熱制粒工藝對(duì)大豆轉(zhuǎn)基因成分及調(diào)控元件的降解均有不同程度的影響。值得提出的是加工后的食品中含有多種添加劑，與普通原料相比，成分更為復(fù)雜，加工工藝更為繁瑣，對(duì)其中基因的影響可能是多方面的［8－9］，因此對(duì)加工后產(chǎn)品中基因的降解變化還需要進(jìn)行深入的研究［10］，以進(jìn)一步明確外源基因以及調(diào)控元件造成的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

［1］鄭文杰，劉火亙，劉偉等．轉(zhuǎn)基因大豆加工產(chǎn)品的定性PCR 檢測(cè)［J］．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2003，11(5):467－471

［2］朱元招，尹靖東，李德發(fā)等．抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆PCR定量檢測(cè)研究［J］．中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，10(3):5－29

［3］Hagen M．Detection of genetically modified soy(Roundup －Ready)in processed food products［J］．Berl Munch Tierarztl Wochenschr，2000，113(11 －12):454 －458

［4］Gawienowski MC，Eckhoff SR，Ping Y，et al．Fate of maize DNA during steeping wet milling and processing［J］．Cereal Chem，1999，76(3):371 －374

［5］Rogan GJ，Dudin YA，Lee TC，et al．Immunodiagnostic methods for detection of enolpyruvyl shikimate phosphate synthase in Roundup Ready or soybeans［J］．Food Control，1999，10:407－414

［6］Chiter A，Michael J，F(xiàn)orbes M，et al．DNA stability in plant tissues:implications for the possible transfer of genes from genetically modified food［J］．FEBSLetters，2000，481:164 －168

［7］陳穎，王媛，徐寶梁，等．Roundup Ready大豆外源基因在食品加工過(guò)程中的降解變化［J］．中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，2005，27(2):10 －14

［8］王媛．轉(zhuǎn)基因大豆內(nèi)、外源基因在食品加工過(guò)程中變化規(guī)律的研究［D］．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005

［9］朱元招．抗草甘膦大豆轉(zhuǎn)基因PCR檢測(cè)及其飼用安全研究［D］．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004

［10］梁杉，梁寧，蔣繼志，等．轉(zhuǎn)基因豆粕調(diào)控元件在飼料加工中降解變化的初步研究［J］．華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，2:201－205．

Comparative Study on Degradation of Transgenic Ingredients and Non－target Gene Components of Generally Modified Soybean with Dry－h(huán)eating and Sticky－h(huán)eating Processing

Wang Lin1，2Han Fei1Li Aike1Liu Jianxue2Wang Yingyao1
(Academy of State Administration of Grain1，Beijing 100037)
(Institute of Food，Henan University of Science and Tech－nology2，Luoyang 471003)

Based on generally modified soybeans for materials，the qualitative research methods of PCR were adopted to study the effects to Lectin gene and exogenous gene of Cp4 epsps and promoter and terminator by dryheating and sticky－ heating processing．Researches showed that endogenous gene degraded below to 407bp through processing after 130℃ dry－h(huán)eating for 3min or 100℃ sticky－h(huán)eating for 15 min．Exogenous gene degraded below to 408bp after 120℃ dry－h(huán)eating for 9 min or 100℃ sticky－h(huán)eating for 15 min．The DNA fragment of 125bp terminator turned to degrade after 130 ℃ dry－h(huán)eating for 9min，while it made no difference to promoter．Promoter and terminator turned to degrade after 100℃ sticky－h(huán)eating for 3 min．The results also indicated that gene sections had all degraded to some extent by dry－h(huán)eating and sticky－h(huán)eating palletizing processing．

processing，gene，promoter，terminator，PCR Tech－nology

Q7

A

1003－0174(2011)10－0044－07

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)(2009ZX08012－012B)

2010－10－22

王林，男，1985年出生，碩士，生物技術(shù)

韓飛，女，1973年出生，副研究員，博士，食品營(yíng)養(yǎng)與安全