高速逆流色譜對(duì)大黃蒽醌類成分的分離研究

袁 萍，周東斌，林順權(quán)，高俊飛，何 瀏，袁 曉*

1中國(guó)科學(xué)院武漢植物園，武漢430074;2牌牌科技有限公司，廣州510540

高速逆流色譜對(duì)大黃蒽醌類成分的分離研究

袁 萍1，周東斌2，林順權(quán)1，高俊飛1，何 瀏1，袁 曉1*

1中國(guó)科學(xué)院武漢植物園，武漢430074;2牌牌科技有限公司，廣州510540

利用高速逆流色譜對(duì)大黃中的5個(gè)蒽醌活性成分進(jìn)行了分離，當(dāng)兩相溶劑系統(tǒng)的組成是石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=8∶2∶8∶1時(shí)，分離出大黃素;當(dāng)兩相溶劑比為3∶4∶3∶2時(shí)，分離出大黃酸和蘆薈大黃素;當(dāng)溶劑比為12∶2∶12∶1時(shí)，分離出大黃酚和大黃素甲醚;經(jīng)高壓液相色譜檢測(cè)大黃素、大黃酸和蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量分別為98.81%、99.15%、98.51%、98.89%和98.16%。

高速逆流色譜;蘆薈大黃素;大黃酸;大黃素;大黃酚;大黃素甲醚;分離

大黃為蓼科植物掌葉大黃(Rheum palmatum L.)、藥用大黃(R.officinale Baill.)或唐古特大黃(R.tanguticum Maxim.ex Balf.)的根及根莖，是我國(guó)重要的傳統(tǒng)中藥之一，具有抗菌、抗病毒、消炎止血及降血脂等多種功效，在臨床上有重要作用。大黃也是我國(guó)重要的出口藥材，現(xiàn)在世界上許多國(guó)家將大黃收錄在藥典中，可以說大黃已經(jīng)成為世界性的藥物，各國(guó)的科學(xué)工作者對(duì)大黃所含的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行了許多深入研究，以求建立起簡(jiǎn)便快速分離大黃品種優(yōu)劣的方法。目前從大黃屬分離出成分160多種，主要包括蒽醌類、蒽酚酮及其酯衍生物、雙蒽酮類等。大黃藥用成分主要為大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚以及它們與糖苷生成的結(jié)合型蒽醌［3］.

1 材料和方法

1.1 材料

HPD-100大孔吸附樹酯由滄州寶恩吸附材料科技有限公司提供，大黃(Rheum palmatum L)干燥根莖由湖北省中藥材公司提供。

1.2 儀器與藥品

OptichromeTM-A半制備J型螺旋管行星式高速逆流色譜儀;江陰逆流科技有限公司生產(chǎn);檢測(cè)器為UV3000紫外檢測(cè)器。L-2000型高壓液相色譜;日本日立公司生產(chǎn)。5L/25型低溫冷卻循環(huán)泵，由鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn);試劑均為分析純，

1.3 方法和條件

1.3.1 游離蒽醌的提取

將10 kg大黃干燥莖塊切片，粉碎后過2號(hào)篩，分別裝入5000 mL三角瓶，加入量為三角瓶容量的1/5，分別倒入95%的乙醇。置入超聲儀中超聲30 min，過濾出溶液后，回收溶劑。將回收的溶劑再倒入三角瓶，繼續(xù)超聲，重復(fù)以上操作3次，得到乙醇提取干浸膏。將乙醇干浸膏與氯仿按重量比1∶5比例置入三角瓶里萃取超聲，抽濾、濃縮萃取液，再將回收的溶劑重新倒入裝乙醇浸膏的瓶里繼續(xù)超聲萃取、抽濾、濃縮，重復(fù)3次得到游離蒽醌的氯仿萃取物。繼續(xù)將氯仿萃取后的渣置入三角瓶中，用20%的硫酸和氯仿在水浴上回流4～5 h，稍放冷，過濾，分離出氯仿層，用水洗至中性，回收氯仿后，得到游離蒽醌，合并2次提取物，得到總的游離蒽醌［4，5］。

1.3.2 大黃素的分離

1.2 文字圖像二值化 經(jīng)過灰度處理的彩色圖像還須經(jīng)過二值化處理將文字與背景進(jìn)一步分離開。所謂二值化，就是將彩色值圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化成只有黑（0）和白（1）的二值圖像信號(hào)。二值化效果的好壞，會(huì)直接影響灰度文本圖像的識(shí)別率。二值化處理的具體經(jīng)驗(yàn)有很多〔11-12〕，方法大致可以分為局部閾值二值化和整體閾值二值化。本文參考基于k中心點(diǎn)聚類的圖像二值化方法〔13〕，采用局部閾值二值化，將方塊苗文圖像分割為互不相交的若干個(gè)w×w的小窗口，在每個(gè)窗口中求得所轄像素的灰度平均值，經(jīng)添加懲罰項(xiàng)后作為初步閾值進(jìn)行二值化處理，繼而對(duì)各小方塊進(jìn)行二值化變換，各個(gè)閾值的計(jì)算公式如下：

HSCCC兩相溶劑系統(tǒng)的組成是石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(體積比為8∶2∶8∶1)，混合前總體積為1L，充分搖勻后，在室溫下靜置過夜，使用前分離。上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，上相與下相的體積比約為2∶3。用甲醇清洗逆流的管柱，然后用空氣壓縮機(jī)將甲醇吹出，用泵把固定相以10 mL/min速度泵入管柱，待管子的另一側(cè)有固定相出來后停止泵入固定相，然后主機(jī)反轉(zhuǎn)1100 r/min，以3 mL/ min泵入流動(dòng)相，待流出來的液體與固定相的液體產(chǎn)生渾濁，繼續(xù)以3 mL/min泵入流動(dòng)相，直到工作站上的基線走平則柱子已平衡，取干燥后的游離蒽醌的氯仿萃取物約200 mg，用20 mL流動(dòng)相超聲溶解，超濾后(濾膜孔徑為0.45 μm)用注射器進(jìn)樣;流動(dòng)相的速度為3 mL/min;檢測(cè)器的波長(zhǎng)為220 nm［6］。儀器檢測(cè)出峰時(shí)開始收集流份，其監(jiān)測(cè)圖如圖1，根據(jù)圖1中的3個(gè)峰面積收集溶液，經(jīng)TLC檢測(cè)，相同的化合物分為3組合并。

圖1 用HSCCC分離大黃素的監(jiān)測(cè)圖Fig.1 Separation of emodin by HSCCC

1.3.3 蘆薈大黃素和大黃酸的分離

HSCCC兩相溶劑系統(tǒng)的組成是石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(體積比為3∶4∶3∶2)，對(duì)收集的第1組化合物繼續(xù)分離，HSCCC其他的操作條件和方法同1.3.2一樣。儀器檢測(cè)出峰時(shí)開始收集流份，其監(jiān)測(cè)圖如圖2，根據(jù)圖2中的2個(gè)峰面積收集溶液。

圖2 用HSCCC分離蘆薈大黃素和大黃酸的監(jiān)測(cè)圖Fig.2 Separation of aloe emodin and rhein by HSCCC

1.3.4 大黃酚和大黃素甲醚的分離

HSCCC兩相溶劑系統(tǒng)的組成是石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(體積比為12∶2∶12∶1)，對(duì)收集的第3組化合物繼續(xù)分離，HSCCC其他的操作方法同1.3.2一樣，儀器檢測(cè)出峰時(shí)開始收集流份。其監(jiān)測(cè)圖如圖3根據(jù)圖3中的2個(gè)峰面積收集溶液，對(duì)收集的2個(gè)化合物重結(jié)晶，大黃酚用適量的乙酸乙酯在96℃下熱熔，過濾，室溫靜置析出黃色片晶，大黃素甲醚用適量丙酮在96℃下熱熔，過濾，室溫靜置析出金黃色針晶，2個(gè)晶體用石油醚洗晶。

圖3 用HSCCC分離大黃酚和大黃素甲醚的監(jiān)測(cè)圖Fig.3 Separation of chrysophanol and rheochrysidin by HSCCC

1.3.5 高壓液相色譜檢測(cè)條件

色譜柱為Fortis C18(250*4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相A為甲醇∶乙酸乙酯(4∶1)加0.3%的甲酸;流動(dòng)相B為0.3%甲酸;流速為1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為430 nm［7，8］進(jìn)樣量為30 μL，用A和B梯度洗脫的條件為;當(dāng)A的濃度為80%～95%時(shí)，洗脫時(shí)間為30 min，當(dāng)A的濃度為95～100時(shí)，洗脫時(shí)間為15 min。

2 結(jié)果

當(dāng)溶劑系統(tǒng)體積比為石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=8∶2∶8∶1時(shí)(圖1)，收集到的第一個(gè)峰的溶液，經(jīng)TLC檢測(cè)為2個(gè)化合物，為蘆薈大黃素和大黃酸，第2個(gè)峰為大黃素，第3個(gè)峰為2個(gè)化合物，為大黃酚和大黃素甲醚。收集的第2個(gè)峰(大黃素)的液體放置12 h后自然結(jié)晶。當(dāng)溶劑系統(tǒng)體積比為石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=3∶4∶3∶2時(shí)(圖2)，對(duì)收集第1個(gè)峰重新分離，重新分離后，收集到的第一個(gè)峰為蘆薈大黃素，第2個(gè)峰為大黃酸。當(dāng)溶劑系統(tǒng)用石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水體積比為12∶2∶12∶1時(shí)(圖3)，對(duì)第3個(gè)峰重新分離，重新分離后，收集到的第一個(gè)峰為大黃酚，第2個(gè)峰為大黃素甲醚。

200 mg氯仿萃取物經(jīng)過HSCCC分離得到大黃酸37.8 mg，得率為18.90%;大黃素32.1 mg，得率為16.05%;蘆薈大黃素11.7 mg，得率為5.85%;大黃酚40.9 mg，得率為20.45%;大黃素甲醚19.0 mg，得率為9.50%。

經(jīng)高壓液相色譜用外標(biāo)法檢測(cè)，大黃素單體純度為98.81%;大黃酸為99.15%;蘆薈大黃素98.51%;重結(jié)晶后大黃酚為98.89%;大黃素甲醚為98.16%。

蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的HPLC測(cè)試譜圖如圖4～8。

3 討論

用高速逆流分離游離蒽醌類化合物，選擇溶劑系統(tǒng)是關(guān)鍵［7］，如本試驗(yàn)第一個(gè)溶劑系統(tǒng)選擇石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶水(體積比為8∶2∶8∶1)時(shí)，能從游離蒽醌中把大黃素分離為單體，而且單體不做重結(jié)晶，高壓液相色譜驗(yàn)證純度在98%以上。對(duì)其它的化合物，也能做到初步分離，所有的溶劑系統(tǒng)只用了石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水這4種溶劑，分離時(shí)間短。經(jīng)過初步分離后的化合物，只需改變系統(tǒng)溶劑比例，能達(dá)到化合物完全分離［8］。

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Separation of Anthraquinone from Rhubarb by High Speed Countercurrent Chromatography

YUAN Ping1，ZHOU Dong-bin2，LIN Shun-quan1，GAO Jun-fei1，HE Liu1，YUAN Xiao1*1Wuhan Botanical Garden，Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430074，China;2PI＆PI Technologies Inc.，Guangzhou 510540，China

Five anthraquinones from Rhubarb were separated by high speed countercurrent chromatography.When twophase solvent system composition was petroleum ether:ethyl acetate:methanol:water(8∶2∶8∶1)，emodin was obtained.Rhein and aloe emodin were separated when the proportion of solvents was 3∶4∶3∶2，while chrysophanol and rheochrysidin were separated at the proportion of solvents 12∶2∶12∶1.The purities of emodin，rhein，aloe emodin，chrysophanol and rheochrysidin are 98.81%，99.15%，98.51%，98.89%and 98.16%respectively by HPLC.

high speed countercurrent chromatography;aloe emodin;rhein;emodin;chrysophanol;rheochrysidin;separation

1001-6880(2011)04-0739-04

2010-03-08 接受日期:2010-06-17

國(guó)家科技基礎(chǔ)專項(xiàng)項(xiàng)目(2008FY230400)

*通訊作者 Tel:86-013871483413;E-mail:yuanxiao@yahoo.com

R284.2;Q946.91

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