基于16S rDNA序列的2株氣單胞菌屬細(xì)菌的分子鑒定

譚鳳霞，葉 聰 (長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院， 湖北 荊州 434025)

基于16S rDNA序列的2株氣單胞菌屬細(xì)菌的分子鑒定

譚鳳霞，葉 聰 (長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院， 湖北 荊州 434025)

對分離自患病鯽魚的2株氣單胞菌的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測定其核酸序列，通過NCBI的BLAST查找同源序列，應(yīng)用MegAlign采用Jotun Hein、ClustalV以及ClustalW 3種方法分別進(jìn)行序列比對，并利用Mega4.0軟件采用鄰接法(N-J)、最小進(jìn)化法(ME)、最大簡約法(MP)、非加權(quán)組平均法(UPGMA)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。3種序列比對結(jié)果顯示，Aeromonassp.T1與Aeromonassp.T2序列具有較高的相似度，分別為97.5%(Jotun Hein)、96%(ClustalV)、96.4%(ClustalW)；Aeromonassp.T1與Genebank登錄號為HM778461.1序列相似度最高，分別為97.1%(Jotun Hein)、93.8%(ClustalV)、94.5%(ClustalW)；Aeromonassp.T2與同樣與Genebank登錄號為HM778461.1序列相似度最高，分別為97.7%(Jotun Hein)、95.3%(ClustalV)、96.8%(ClustalW)。4種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹基本一致，可初步確立2株菌株的分類地位：Aeromonassp.T1、Aeromonassp.T2與登錄號為HM127065.1的菌株的聚為一類，親緣關(guān)系最近。

氣單胞菌(Aeromonas)；16S rDNA；分子鑒定

氣單胞菌屬(Aeromonas)曾與弧菌屬(Vibrio)、原細(xì)菌屬(Protobacterium)和鄰單胞菌屬(Plesiomonas)被歸入弧菌科(Vibrionaseae)[1]。隨著現(xiàn)代分子遺傳學(xué)的發(fā)展，以往被歸類為弧菌科的氣單胞菌屬劃為一個獨(dú)立的科，即氣單胞菌科。到目前為止該項(xiàng)包括：嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)、維隆氣單胞菌(Aeromonasveronii)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)、中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)、嗜礦泉?dú)鈫伟?Aeromonaseucrenophila)、簡氏氣單胞菌(Aeromonasjandaei)、鰻魚氣單胞菌(Aeromonasichthiosmia)、舒氏氣單胞菌(Aermonasschubertii)、尺骨氣單胞菌(Aeromonastrota)、氣單胞菌群501、異常嗜糖氣單胞菌(Aeromonasallosaccharophila)和斑點(diǎn)氣單胞菌(Aeromonaspunctata)共14 個氣單胞菌表型種和16個基因種[1,2]。

細(xì)菌分類鑒定方法包括表型鑒定法和分子遺傳學(xué)鑒定法2大類，分成4個水平細(xì)菌形態(tài)和生理生化水平、細(xì)胞組分水平、蛋白質(zhì)水平和核酸水平。表型鑒定法是對前3個水平的鑒定，包括常規(guī)鑒定法、數(shù)值分類鑒定法和化學(xué)分類鑒定法[3]。分子遺傳學(xué)鑒定法是核酸水平的鑒定，對細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA進(jìn)行分析，包括G + C含量測定、核酸雜交、PCR 技術(shù)、16S rRNA 和16～23S rRNA序列分析、全基因組測序等。其中16S rRNA/rDNA 序列分析技術(shù)是分子生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù)，目前已被廣泛應(yīng)用于微生物的分類、鑒定以及微生物的群落研究，由于該技術(shù)具有方便、準(zhǔn)確、快捷等特點(diǎn)，在鑒定土壤樣品中的細(xì)菌[4]、動物內(nèi)臟及腸道中的菌落[5]、野生菌株的歸屬[6]、致病菌的快速鑒定[7]等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

本研究對分離自患出血病鯽魚的腸道和腹水中的2株氣單胞菌屬細(xì)菌Aeromonassp.T1和Aeromonassp.T2進(jìn)行16S rDNA基因的序列進(jìn)行序列同源性和聚類分析，以鑒定其分類地位，為進(jìn)一步應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株

氣單胞菌菌株Aeromonassp.T1和Aeromonassp.T2分離自患病鯽魚(Carassiusauratusgibelio)。

1.1.2 主要試劑

溴化乙錠(EB)、dNTP(10mmol/L)、溴酚藍(lán)、Tris堿、EDTA等購自Amresco公司；Taq酶購自Fermentas公司；DNA Mark、DNA 提取試劑盒購自TOYOBO公司；瓊脂糖購自Biowest公司；牛肉膏、胰蛋白胨、瓊脂粉、冰醋酸、NaCl等為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2方法

1.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)

4℃斜面保存的菌株涂布于平板，28℃培養(yǎng)24h，用生理鹽水洗下菌苔制成菌懸液。

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取

按照DNA提取試劑盒的說明書提取基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。

1.2.3 16S rDNA基因片段的擴(kuò)增

采用16S rDNA細(xì)菌通用引物：8f: 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’；1492r: 5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)按以下次序，將各成分在0.5ml無菌PCR管內(nèi)混合，總體積25μl：PCR buffer(10×，2.5μl)、MgCl2(25mmol/L，1.5μl)、dNTPs(2mmol/L，2.0μl)、上游和下游引物(10μmol/L，各0.5μl)、模板DNA(0.3～0.4μg)、Taq-DNA (1U/μl，0.5μl)，最后補(bǔ)加滅菌ddH2O至25μl。 短暫離心(8000r/min，10s)混勻，每管加入30μl液體石蠟油覆蓋于反應(yīng)混和液上，將樣品置于PCR合成儀中按以下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)：94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃保溫8min。末輪循環(huán)后一直維持在4℃，擴(kuò)增產(chǎn)物置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠1mg/L)在5V/cm的電壓下電泳。電泳結(jié)束后，用凝膠成像系統(tǒng)照相，觀察到所需產(chǎn)物的擴(kuò)增帶后，送上海生工武漢測序部進(jìn)行產(chǎn)物純化和正反測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用ContigExpress軟件進(jìn)行序列拼接得到其16S rDNA基因全序列， BLAST相似序列，以MegAlign軟件比較這些序列的差異和相似度。用ClustalX軟件排列比對序列，用Mega4.0軟件分別進(jìn)行、鄰接法(N-J)、最小進(jìn)化法(ME)、最大簡約法(MP)、非加權(quán)組平均法(UPGMA)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中自舉檢驗(yàn)1000個副本。

2 結(jié)果與分析

2.1PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

按照1.2.2的方法提取得到各菌株的總DNA，電泳檢測無拖尾現(xiàn)象,表明質(zhì)量較高(圖1)，可直接用于PCR反應(yīng)。以16S rDNA的通用引物(8f，1492r)，擴(kuò)增得到的片段大小為1500bp左右，符合預(yù)期大小，擴(kuò)增特異性較高(圖2)。

圖1 DNA電泳圖 圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2目的基因測序結(jié)果

以通用引物作為測序引物，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序，所得測序峰圖中大多數(shù)堿基峰清晰，雜峰較少，測序起始后的前40個左右堿基峰型相對雜亂，通過ContigExpress軟件進(jìn)行雜峰修正和正反序列的拼接，得到2株氣單胞菌屬細(xì)菌的1500bp左右片段。Aeromonassp.T1和Aeromonassp.T2 DNA序列見表1。

2.3序列比對結(jié)果

以拼接后的各菌株16S rDNA序列在Genebank中進(jìn)行BLASTA比對，搜索同源較近的序列，從中挑選出4個序列： Uncultured bacterium clone aaa64h02 (DQ817645.1)、Uncultured bacterium clone SINI708 (HM127056.1)、Uncultured bacterium clone JFR0501_aaa05c04 (HM778461.1)和Uncultured bacterium clone JFR0501_aaa03e08 (HM778618.1)。Megalign軟件比較序列得到的同源性結(jié)果如圖3～圖5。3種序列比對結(jié)果顯示，Aeromonassp.T1與Aeromonassp.T2序列具有較高的同源性，分別為97.5%(Jotun Hein)、96%(ClustalV)、96.4%(ClustalW)；Aeromonassp.T1與Genebank登錄號為HM778461.1序列同源性最高，分別為97.1%(Jotun Hein)、93.8%(ClustalV)、94.5%(ClustalW)；Aeromonassp.T2同樣與Genebank登錄號為HM778461.1序列同源性最高，分別為97.7%(Jotun Hein)、95.3%(ClustalV)、96.8%(ClustalW)。

圖3 Jotun Hein法基因序列比較結(jié)果

圖4 ClustalV法基因序列比較結(jié)果

圖5 ClustalW法基因序列比較結(jié)果

圖6 N-J法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖7 ME法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖8 MP法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖9 UPGMA法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

以登錄號為X16895.1的鰻弧菌(Vibroanguiuarum)16S rDNA序列作為屬外序列，采用Mega4.0軟件以4種方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹基本相似(圖6～圖9)。初步確立兩株菌株的分類地位為，Aeromonassp.T1、Aeromonassp.T2與登錄號為HM127065.1的菌株的聚為一類，親緣關(guān)系最近。

3 討論

16S rDNA序列保守區(qū)和多變區(qū)間隔排列，選擇合適的區(qū)域作為分子標(biāo)記，可以用于區(qū)分不同的分類等級。以多少相似性程度作為各分類等級的劃分標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)根據(jù)特定的研究對象來確定[8]。本研究中菌株16S rDNA的擴(kuò)增、測序采用的是8f和1492r細(xì)菌通用引物，而其它菌株在擴(kuò)增和測序時所采用的引物可能不盡相同，造成相應(yīng)序列長度的差異。本研究數(shù)據(jù)分析中采用的是原始序列長度，未進(jìn)行序列的人工切除，可能影響到序列比對的結(jié)果，在比對的序列中同源性100%的2對序列較少。另外本研究采用3種方法對分離株與BLAST序列進(jìn)行了序列相似性的比對，結(jié)果分離株與其相似度最高的序列是一致的。而這3種序列排列方法有所不同，Jotun Hein法是根據(jù)已有的系統(tǒng)調(diào)整相關(guān)的序列進(jìn)行比對，而其他2種方法不需要這個假設(shè)，ClustalW較ClustalV更進(jìn)步，提供更準(zhǔn)確的高度分化序列比對。因此，在本研究中應(yīng)用Jotun Hein法得出的序列相似性較其他2種方法稍高。

對DNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析的3個主要步驟是比對、建立取代模型和進(jìn)化樹以及進(jìn)化樹評估。目前建樹方法主要有3類，分別是距離法(包括最小進(jìn)化法和鄰接法等)、最大簡約法(maximum parsimon，MP)和最大似然法(maximum likelihood，ML)。距離建樹法考察數(shù)據(jù)組中所有序列的兩兩比對結(jié)果，通過序列兩兩之間的差異決定進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和樹枝長度；最大簡約法考察數(shù)據(jù)組中序列的多重比對結(jié)果，優(yōu)化出的進(jìn)化樹能夠利用最少的離散步驟去解釋多重比對中的堿基差異；最大似然法考察數(shù)據(jù)組中序列的多重比對結(jié)果，優(yōu)化出擁有一定拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和樹枝長度的進(jìn)化樹，這個進(jìn)化樹能夠以最大的概率導(dǎo)致考察的多重比對結(jié)果。這3種建樹方法由于各自的局限性均可能導(dǎo)致系統(tǒng)誤差的產(chǎn)生[9]，為了盡量避免誤差的影響，本研究同時采用了3類方法，通過比較它們所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，來綜合分析系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系?？梢?種方法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹基本一致，本研究所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹是可信的，各分離菌株的最近親緣關(guān)系菌株也是可信的。

本研究中BLAST查找同源性較高的條序列均為不可培養(yǎng)細(xì)菌克隆的序列，不可培養(yǎng)微生物的概念是1982年Colwell 實(shí)驗(yàn)室提出的概念，他們發(fā)現(xiàn)將霍亂弧菌和大腸埃希菌(簡稱大腸桿菌)轉(zhuǎn)到不含營養(yǎng)物質(zhì)的鹽水中，經(jīng)常長時間的低溫保存，細(xì)菌會進(jìn)入一種數(shù)量不減、有代謝活力、但在正常試驗(yàn)室培養(yǎng)條件下不能生長產(chǎn)生菌落的狀態(tài)，稱為活的但不能培養(yǎng)(viable but nonculturable，VBNC)狀態(tài)。其后對多種屬細(xì)菌進(jìn)行試驗(yàn)證明，這種不可培養(yǎng)狀態(tài)是普遍存在的。自然界中也廣泛存在著這種活的但不可培養(yǎng)微生物，在各種生境中僅有小部分的微生物可用實(shí)驗(yàn)室方法分離培養(yǎng)，而未被培養(yǎng)的種類卻代表了巨大的多樣性[10]。本研究中的2株氣單胞菌與GenBank中登錄號為HM127065.1的菌株的聚為一類，親緣關(guān)系最近。而HM127065.1的菌株為西藏湖泊中的1株不可培養(yǎng)細(xì)菌克隆(Uncultured bacterium clone SINI708)，由此可見，細(xì)菌未被培養(yǎng)的種類可在特定的環(huán)境中被分離培養(yǎng)。

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10.3969/j.issn.1673-1409.2011.07.118

Q939

A

1673-1409(2011)07-0257-06

2011-07-01

長江大學(xué)博士啟動基金(801200010110)。

譚鳳霞，女，博士，講師，主要從事微生物學(xué)研究。