春甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)離體培養(yǎng)研究初報

付明星 (長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025；襄樊學(xué)院理工學(xué)院，湖北 襄陽 441003)

劉樂承，林小芳，孫 賀 (長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

春甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)離體培養(yǎng)研究初報

付明星 (長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025；襄樊學(xué)院理工學(xué)院，湖北 襄陽 441003)

劉樂承，林小芳，孫 賀 (長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

以春甘藍(lán)4個基因型為試材，采用NLN-13液體培養(yǎng)基，研究了小孢子發(fā)育階段、基因型、活性炭和植物生長調(diào)節(jié)劑等因素對春甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，春甘藍(lán)不同基因型間的小孢子胚誘導(dǎo)率相差很大；單核靠邊期和雙核期早期是誘導(dǎo)小孢子胚的有利時期，而雙核期早期小孢子胚誘導(dǎo)率最高；培養(yǎng)基中添加活性炭有利于提高小孢子胚誘導(dǎo)率，而且多數(shù)品種以添加0.2g/L的活性炭為宜；試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的6-BA能提高小孢子胚誘導(dǎo)率，而且0.10mg/L 6-BA效果最好，但試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的NAA均表現(xiàn)出抑制成胚的作用。

春甘藍(lán)；游離小孢子培養(yǎng)；小孢子胚誘導(dǎo)；發(fā)育階段；基因型；活性炭；植物生長調(diào)節(jié)劑

甘藍(lán)(Brassicaoleraceassp.capitata)屬十字花科蕓薹屬，起源于歐洲地中海沿岸，是世界上栽培歷史最長、面積最大的蔬菜之一[1]。甘藍(lán)在我國南北各地普遍栽培，在蔬菜栽培中占很重要的地位[2]。近年來，由于南方地區(qū)4～6月采收的春甘藍(lán)經(jīng)濟(jì)效益高，栽培面積逐漸轉(zhuǎn)為最大。然而，盡管結(jié)球甘藍(lán)生產(chǎn)上栽培品種已雜種化，但是雜交親本采用常規(guī)的自交分離方法要?dú)v6～8代，而且甘藍(lán)是綠體春化冬性較強(qiáng)的作物，不易加代，育種周期長，而我國的甘藍(lán)品種選育仍然以常規(guī)方法為主，因而品種選育及品種更新工作緩慢，春甘藍(lán)品種則更甚。采用單倍體育種技術(shù)，可在1～2a時間內(nèi)得到純合的雙單倍體(doubled haploid，DH)植株，大大地提高育種效率。在單倍體育種中，由于花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體植株的頻率低，能通過花藥培養(yǎng)獲得再生植株的基因型十分有限，而且花藥培養(yǎng)時花藥壁體細(xì)胞再生植株易與花粉細(xì)胞再生的植株混淆[3-4]。而游離小孢子培養(yǎng)(Isolated microspore culture)排除了花絲、藥壁和藥隔等母體組織體細(xì)胞的干擾，通過培養(yǎng)得到的植株100%來自小孢子群體[4]，由單倍體細(xì)胞發(fā)育而來，避免了嵌合體的發(fā)生，而且在單倍體育種效率上顯示出比花藥培養(yǎng)高得多的潛力，具有比花藥培養(yǎng)更多的優(yōu)越性。國內(nèi)外已將該技術(shù)應(yīng)用到油菜、甘藍(lán)類蔬菜和秋冬大白菜等的育種中[5-8]。雖然甘藍(lán)游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系已初步建立[9]，但在甘藍(lán)作物中受基因型的制約和環(huán)境的影響很大，重復(fù)性差、出胚率低，制約小孢子胚胎發(fā)生的關(guān)鍵因素還不十分清楚，不同研究者的報道在諸多方面甚至得出了相互矛盾的結(jié)論，培養(yǎng)技術(shù)還很不成熟。本研究以春甘藍(lán)4個基因型為材料，探討若干因素對其游離小孢子培養(yǎng)的影響，以期提高培養(yǎng)效率，為進(jìn)一步獲得不同基因型的DH群體及育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 植物材料

試驗(yàn)材料為‘京豐一號’、‘春豐甘藍(lán)’、‘商甘藍(lán)一號’和‘超級爭春’春甘藍(lán)4個基因型。在長江大學(xué)園藝園林學(xué)院教學(xué)基地提早到9月中旬播種，10月下旬定植，常規(guī)田間管理。

表1 主要培養(yǎng)基成分 mg/L

1.1.2 培養(yǎng)基

游離小孢子培養(yǎng)所需B5液體培養(yǎng)基、NLN-13液體培養(yǎng)基的組成如表1。

B5培養(yǎng)基121℃高壓滅菌15min，冷卻后置于4℃冰箱保存；NLN-13培養(yǎng)基在超凈工作臺上以針式過濾器抽濾滅菌，依次用0.45μm和0.22μm微孔醋酸纖維濾膜過濾后，分裝至小錐形瓶中，4℃冰箱保存。醋酸洋紅染色液、卡諾氏固定液、大量元素(10×)、微量元素(100×)、維生素(100×)、Fe-EDTA(100×)、0.05mg/ml的 6-芐基腺嘌呤(6-BA)、0.1mg/ml的α-萘乙酸(NAA)4℃保存。

1.2方法

1.2.1 小孢子發(fā)育時期的觀察

將花蕾分為1.5～l.99、2.0～2.49、2.5～2.99、3.0～3.49、3.5～3.99、4.0～4.49、4.5～4.99mm等7個組別。每組隨機(jī)取10個花蕾，置于卡諾氏固定液固定24h后，轉(zhuǎn)移到70%酒精中4℃冰箱保存。制片時，用鑷子從固定的花蕾中取出花藥置于載玻片上，輕輕擠出花粉涂抹到載玻片上，去除花藥壁等較大的組織碎片，加1滴1%的醋酸洋紅染色1～2min，蓋上蓋玻片，烤片、壓片制成臨時制片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.2 小孢子的分離純化

植株現(xiàn)蕾后，摘取健壯植株的花序，采用醋酸洋紅壓片后在光學(xué)顯微鏡下觀察。選取單核靠邊期至雙核早期小孢子所占比例較大的花蕾，30個1組，流水沖洗30min后瀝干水分，經(jīng)70%乙醇溶液表面消毒30s后，用0.1% HgCl溶液消毒8min，無菌水洗滌3次，每次5min。消毒后的花蕾放入無菌小燒杯，加少量B5液體洗滌培養(yǎng)基，用無菌研棒碾壓擠出小孢子，懸浮液用孔徑40μm的尼龍網(wǎng)過濾，收集濾液于10ml離心管中，1000r/min下離心3min，棄上清，重復(fù)3次，所得沉淀物即為純凈小孢子。

1.2.3 游離小孢子培養(yǎng)

將純化后的小孢子用NLN-13培養(yǎng)液稀釋，保持小孢子密度1×105～2×105個/ml，以每皿2.5ml小孢子懸浮液分裝入直徑為60mm的無菌玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，封口膜封口，33℃恒溫箱中熱激處理24h后，25℃下靜置暗培養(yǎng)。小孢子培養(yǎng)采用NLN-13液體培養(yǎng)基，pH5.8，蔗糖濃度13%，添加或不添加植物生長調(diào)節(jié)劑、活性炭，用孔徑0.45μm濾膜抽濾滅菌。3周后統(tǒng)計胚狀體數(shù)目，并以公式小孢子胚誘導(dǎo)率=胚狀體總數(shù)/30花蕾計算小孢子胚誘導(dǎo)率。

2 結(jié)果與分析

2.1花蕾大小與小孢子發(fā)育時期的關(guān)系

對4個基因型的花蕾染色后發(fā)現(xiàn)，一般在單核中早期，小孢子近似圓形；當(dāng)發(fā)育到單核靠邊期時，小孢子外壁逐漸形成3個明顯的花瓣；而到雙核期后，花瓣型逐漸向外擴(kuò)展變的模糊，進(jìn)而消失。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，花蕾大小lt;2.0mm時，單核靠邊期小孢子的數(shù)量lt;50%；花蕾在2.0～3.0mm之間時，單核靠邊期的小孢子則一般在50%～70%之間；花蕾大小為3.0～4.0mm之間時，10%～30%的小孢子發(fā)育到雙核期；花蕾大小gt;4.0mm以后，雙核期的小孢子一般gt;30%。結(jié)果表明，花蕾大小與發(fā)育時期存在一定的相關(guān)性，但不同的基因型間存在一定的差異，而且同一個花蕾中小孢子發(fā)育的時期也并非完全一致。

2.2小孢子發(fā)育時期對小孢子胚胎發(fā)生的影響

以‘商甘藍(lán)一號’為材料，依據(jù)2.1的結(jié)果設(shè)置4種不同處理：單核靠邊期小孢子lt;50%、單核靠邊期小孢子50%～70%，雙核期小孢子10%～30%和雙核期小孢子gt;30%，采用不添加植物生長調(diào)節(jié)劑和活性炭的NLN-13液體培養(yǎng)基，研究小孢子發(fā)育時期對胚胎發(fā)生的影響，結(jié)果如表2。由表2可以看出，春甘藍(lán)在雙核期小孢子數(shù)量在10%～30%時，產(chǎn)生的胚狀體最多，顯著高于其他3種處理。結(jié)果表明，春甘藍(lán)‘商甘藍(lán)一號’在單核靠邊期和雙核期早期(小孢子數(shù)量在10%～30%)是誘導(dǎo)小孢子胚的有利時期，雙核期早期小孢子胚誘導(dǎo)率最高。

表2 小孢子發(fā)育時期對小孢子胚胎發(fā)生的影響

2.3不同基因型間小孢子胚胎發(fā)生結(jié)果比較

為探討不同基因型對小孢子胚發(fā)生的影響，采用不添加植物生長調(diào)節(jié)劑和活性炭的NLN-13培養(yǎng)基，取雙核期早期的花蕾進(jìn)行培養(yǎng)，統(tǒng)計結(jié)果見表3。由表3可以看出，供試的春甘藍(lán)4個基因型間小孢子胚誘導(dǎo)率均有極顯著差異，其中小孢子胚誘導(dǎo)率最高的基因型是‘超級爭春’，為3.23個/蕾；最低的基因型是‘春豐甘藍(lán)’，為0.23個/蕾。結(jié)果表明，不同的基因型間小孢子胚誘導(dǎo)率相差很大。

表3 基因型對小孢子胚胎發(fā)生的影響

2.4活性炭對小孢子胚胎發(fā)生的影響

在NLN-13培養(yǎng)基中分別添加濃度為0.2、0.4g/L的活性炭，以不添加活性炭的為對照(CK)，取春甘藍(lán)4個基因型雙核期早期的花蕾進(jìn)行培養(yǎng)，研究活性炭對胚胎發(fā)生的影響，小孢子胚誘導(dǎo)率結(jié)果見表4。由表4可以看出，添加活性炭后均能顯著或極顯著提高春甘藍(lán)4個基因型小孢子胚誘導(dǎo)率，而且‘超級爭春’在活性炭添加0.4g/L時的小孢子胚誘導(dǎo)率極顯著高于添加0.2g/L的，而另外3個基因型則活性炭添加0.2g/L時的極顯著高于添加0.4g/L的。結(jié)果表明，添加活性炭后有利于提高春甘藍(lán)小孢子的小孢子胚誘導(dǎo)率，而且多數(shù)品種以添加0.2g/L的活性炭為宜。

表4 活性炭對小孢子胚胎發(fā)生的影響

2.5植物生長調(diào)節(jié)劑對小孢子胚胎發(fā)生的影響

以‘超級爭春’雙核期早期的花蕾為材料，在NLN-13培養(yǎng)基中分別添加濃度為0.05、0.10、0.20mg/L的6-BA，0.2、0.5、1.0mg/L的NAA，以NLN-13培養(yǎng)基作為對照，研究植物生長調(diào)節(jié)劑對胚胎發(fā)生的影響，小孢子胚誘導(dǎo)率結(jié)果見表5。由表5可以看出，添加6-BA處理的小孢子胚誘導(dǎo)率都顯著或極顯著高于對照的，而且6-BA濃度為0.10mg/L時小孢子胚誘導(dǎo)率達(dá)到最高，5.20個/蕾，極顯著高于其他處理的；當(dāng)添加NAA時，小孢子胚誘導(dǎo)率都顯著或極顯著低于于對照的。結(jié)果表明，添加試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的6-BA能提高‘超級爭春’的小孢子胚誘導(dǎo)率，而且0.10mg/L 6-BA效果最好，然而試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的NAA均表現(xiàn)出抑制成胚的作用。

表5 植物生長調(diào)節(jié)劑對小孢子胚胎發(fā)生的影響

3 討論

3.1花蕾與小孢子發(fā)育時期的關(guān)系及其小孢子胚胎發(fā)生的影響

在蕓薹屬蔬菜小孢子培養(yǎng)中，以單核靠邊期和雙核早期的花粉培養(yǎng)效果最佳[4-5，7，10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)春甘藍(lán)的適宜培養(yǎng)時期為單核靠邊期和雙核早期，與前人研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)閱魏丝窟吰诘男℃咦诱幱诿媾R不同分裂方式和發(fā)育途徑的敏感時期，所以容易誘導(dǎo)成功。而單核早期的小孢子則需要比較苛刻的條件才能啟動雄核發(fā)育，因此難以誘導(dǎo)成胚。關(guān)于小孢子為何處在一定時期才能誘導(dǎo)成苗有2種解釋。一種解釋是，小孢子發(fā)育成胚狀體有一個臨界期，超過了這一時期胚狀體就不能形成；另一種解釋是，在小孢子發(fā)育過程中，花粉內(nèi)源植物生長調(diào)節(jié)劑水平在不斷改變，由于花粉的成熟使植物生長調(diào)節(jié)劑平衡變得不合適，或?yàn)榛ǚ郯l(fā)育所必需的其他一些成分已經(jīng)耗盡，從而影響了誘導(dǎo)率[12]。

3.2基因型對小孢子胚胎發(fā)生的影響

供體植株的基因型是影響小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，不同基因型的植株對培養(yǎng)的反應(yīng)不同，表現(xiàn)為是否誘導(dǎo)胚狀體的生成、生成胚狀體的多少，以及由胚再生成植株的能力大小。本研究春甘藍(lán)4個基因型中，不同的基因型間小孢子胚誘導(dǎo)率相差很大。這與前人在甘藍(lán)類作物中的研究結(jié)果一致[13-15]。目前關(guān)于基因型影響小孢子培養(yǎng)的作用機(jī)理還處于起步階段，還需進(jìn)一步的研究。

3.3活性炭對小孢子胚胎發(fā)生的影響

多數(shù)研究表明，活性炭的添加對于甘藍(lán)類作物提高胚狀體誘導(dǎo)率是有益的[16-17]。本研究的結(jié)果也顯示，添加活性炭能夠提高春甘藍(lán)胚狀體誘導(dǎo)率，但超過一定范圍反而會抑制出胚。添加活性炭懸浮液可以顯著提高產(chǎn)胚量，還可以促進(jìn)胚向植株的分化；添加活性炭不僅不會對小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生毒害作用，而且還可以吸附培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)和生長抑制物質(zhì)，如酚類物質(zhì)[18]。但是，可能因?yàn)榛钚蕴坎粌H可以吸附培養(yǎng)基中的有毒物質(zhì)，而且可以吸附一些必要元素和植物植物生長調(diào)節(jié)劑，如NAA、KT、鐵鹽鰲合物等，因此，活性炭濃度不宜太高，否則會起負(fù)作用。

3.4植物生長調(diào)節(jié)劑對小孢子胚胎發(fā)生的影響

關(guān)于外源植物生長調(diào)節(jié)劑對蕓薹屬植物小孢子胚胎發(fā)生和植株再生的影響還未取得一致認(rèn)識。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)外源植物生長調(diào)節(jié)劑有利于小白菜游離小孢子胚胎發(fā)生[19]，而另外有學(xué)者卻提出，植物生長調(diào)節(jié)劑可能不是他們所研究的蕓薹屬作物形成小孢子胚的必要條件[20-21]。在本研究中，春甘藍(lán)在添加0.10mg/L 6-BA時小孢子胚誘導(dǎo)率提高，而NAA在濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)一定的抑制成胚作用?？赡懿煌蛐鸵蟮闹参锷L調(diào)節(jié)劑組合和濃度不盡相同[22]。

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10.3969/j.issn.1673-1409.2011.07.117

Q813.7

A

1673-1409(2011)07-0252-05

2011-04-08

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2007ABA386)；湖北省荊州市科技發(fā)展計劃項(xiàng)目(20081P033)。

付明星，女，碩士，主要從事園藝植物生物技術(shù)研究。

劉樂承，E-mail: lchliu18@yangtzeu.edu.cn。