在線樣品預處理限進色譜測定人血清中多奈哌齊濃度

馬 駿，樊鵬程，任 俊，賈正平

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730050)

·藥物不良反應及個案報告·

在線樣品預處理限進色譜測定人血清中多奈哌齊濃度

馬 駿，樊鵬程，任 俊，賈正平

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730050)

目的通過在線樣品預處理限進色譜柱切換技術建立一種測定人體血清中多奈哌齊血藥濃度的高效液相色譜法。方法樣品預處理采用LiChroCART (25 mm × 4 mm，25 μm) 限進預柱，分析柱為Microsorb-MV C18柱 (150 mm × 4.6 mm，4 μm )，以水-乙腈 (99:1, v/v) 為血漿蛋白沖洗流動相，流速2 ml/min，0.02 M 磷酸緩沖液-乙腈-三乙胺 (65:35:0.1， v/v/v) 為分析流動相，流速1 ml/min，檢測波長315 nm。結果本方法線性范圍為0.02～1.0 μg/ml，r=0.999 5，日內、日間精密度RSD小于7%，回收率為87.9%～91.1%。結論該方法準確、穩(wěn)定；靈敏度高，適用于多奈哌齊藥物動力學及生物利用度的研究。

限進填料；在線樣品預處理；多奈哌齊；柱切換

多奈哌齊(donepezil)為中樞選擇性膽堿酯酶抑制劑。對于阿茨海默病人認知損傷及記憶力衰退治療均有效，其抑制平臺的血漿藥物濃度超過0.05 μg/ml，因此多奈哌齊血藥濃度可作為提示其治療阿茨海默病人療效的參考指標[1]。已有血漿中多奈哌齊測定的報道，但其多數使用了液液萃取技術[2～4]，血樣預處理及待測物濃縮往往包含了冗長繁雜的過程。

在線樣品預處理柱切換系統(tǒng)被認為是對于傳統(tǒng)的樣品預處理技術的改進，它避免了繁瑣的手工處理過程，縮短了樣品預處理時間從而縮短了分析時間，提高了回收率。該過程可以通過柱切換技術實現(xiàn)?；诖四康?，限進填料(restricted access material，RAM)色譜預柱近年來常常被用于生物樣品基質中化合物快速分析領域[5～14]。該填料能夠簡化樣品處理過程，加快樣品處理步驟，實現(xiàn)樣品處理自動化。

RAM柱填料有著親水性外表面以及疏水性內表面。生物基質中的大分子，主要是蛋白質，由于其親水性而被流動相很快沖出，不被固定相保留。小分子化合物則能夠同疏水內表面發(fā)生相互作用而被保留。其后用強度高的流動相將小分子化合物沖至分析柱進行分離分析[11]。烷基二醇(alkyl-diol-silica，ADS)填料已成為目前最為流行的RAM填料。ADS填料孔徑為6 nm，其性質由其內表面鍵合的不同基團(C4, C8or C18等)決定[5]。ADS預柱的總進樣壽命為血漿體積80～100 ml[12]。

本實驗建立了一種簡便、快速在線樣品預處理HPLC柱切換系統(tǒng)測定血清中多奈哌齊的方法，該系統(tǒng)串聯(lián)了ADS預柱和C18分析柱，本方法分析時間短，為治療藥物監(jiān)測和藥動學實驗提供分析方法。

1 材料和方法

1.1儀器與試藥 在線樣品預處理系統(tǒng)由島津LC-6A泵作為蛋白質沖洗泵，串聯(lián)Waters 600泵，后者為分析泵，Waters 996 PDA 紫外可見光檢測器；TGL-16G高速臺式離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠)；PHS-3C型酸度計(上海雷磁儀器廠)；AS5150超聲發(fā)生器(上海醫(yī)用分析儀器廠)。

多奈哌齊對照品由南京澤眾藥業(yè)有限公司提供；正常人血清由蘭州總醫(yī)院血液中心提供；色譜級乙腈由禹王藥業(yè) (山東)提供；其他化學試劑均為分析醇；水為二次蒸餾水。

1.2色譜條件 LiChroCART (25 mm×4 mm, 5 μm) 預柱由Lichrospher ADS色譜硅膠填料填充(25 μm)，連接Rheodyne 7000 六通高壓切換閥；分析柱為Microsorb-MV C18柱(150 mm×4.6 mm, 4 μm)[7]；Rheodyne 7725 進樣閥；Catati 100 μl進樣環(huán)。

蛋白洗脫流動相為水-乙腈(99:1，v/v)，分析流動相由0.02 M磷酸鹽緩沖液(pH 4.6)-乙腈-三乙胺(65:35:0.1,v/v/v)組成。流動相均通過0.45 μm尼龍微孔濾膜，氦氣在線脫氣，柱溫為室溫，分析流動相流速為1.0 ml/min，分析周期為16 min。在該色譜條件下，多奈哌齊的保留時間為11.3 min。進樣體積為100 μl，為了降低血清雜質的影響檢測波長設為315 nm。

1.3樣品在線處理與切換閥切換時間及樣品分析過程 見表1。

表1 柱切換系統(tǒng)分析過程

注： A-水-乙腈 (99:1, v/v)； B-0.02 M 磷酸緩沖液-乙腈-三乙胺 (65:35:0.1, v/v/v)；C- 水-乙腈 (90:10, v/v)。

1.4空白血清預處理 空白人血清-40℃凍存。使用之前，血清樣品于37℃水浴復溶，室溫下離心(8 000×g)10 min。

2 結果

2.1方法專屬性 在上述柱切換系統(tǒng)色譜條件下，對空白血清、空白血清加入對照品的色譜圖進行比較。多奈哌齊的保留時間為11.5 min，選擇315 nm作為檢測波長，血清內源性物質及其他雜質不會干擾樣品的分離測定，色譜圖如圖1-A、B、C。

圖1空白血清(A)、0.02μg/ml多奈哌齊(B)和0.1μg/ml多奈哌齊血清色譜圖(C)

2.2標準曲線制備及檢測限 精密稱量多奈哌齊10 mg，甲醇配制成1 mg/ml 儲備液，-40℃凍存。多奈哌齊在酸性環(huán)境中穩(wěn)定[15,16]，儲備液由0.001 M 鹽酸配制成1.5 μg/ml工作液4℃保存[2]。工作液由空白血清稀釋至多奈哌齊終濃度為0.02、0.03、0.06、0.10及1.0 μg/ml，制作標準曲線。按“1.3”項下方法進行HPLC分析，以多奈哌齊濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得回歸方程：Y=74.732C-191.833，Y代表峰面積，C代表濃度，r=0.999 5。結果表明血清中多奈哌齊在0.02～1.0 μg/ml 濃度范圍內有良好的線性關系。LOQ為20 ng/ml。

2.3回收率及精密度實驗 取空白血清，配制多奈哌齊濃度分別為0.02、0.10、1.0 μg/ml的對照品血清數份，按“1.3”項下方法進行HPLC分析，分別計算日內、日間精密度，結果見表2。將測得結果與相應濃度對照品甲醇溶液未經預柱萃取測得結果相比較計算回收率，結果見表2。

表2 多奈哌齊精密度及回收率(n=5)

3 討論

根據文獻[2]向流動相中適當加入一定比例的有機溶劑能使血清蛋白結合的藥物由結合位點釋放出來。為增加待測物的回收率，實驗中流動相A中加入了1%乙睛，并適當延長了萃取時間及轉移時間(1.5 min)。對于集成了RAM預柱的柱切換系統(tǒng)，較小比例的一定量的有機溶劑，如乙腈作為調節(jié)溶劑加入流動相中，可改善RAM預柱的萃取能力，使得待分析物質由蛋白結合位點釋放，以達到較高的回收率[7]。沖洗流動相中乙腈比例的增加可減少多奈哌齊由預柱洗脫至分析柱的時間。實驗中發(fā)現(xiàn)當乙腈的比例小于5%時未發(fā)現(xiàn)多奈哌齊回收率有顯著變化，故沖洗流動相A中乙腈的比例最終選擇為1%(v/v)，以得到最大回收率。

實驗考察了不同流速對血清蛋白沖洗時間的影響，以便選擇最佳流速及柱切換時間。隨著流速的增加，血清蛋白洗脫時間縮短，但2 ml/min與3 ml/min的差別并不顯著，故選擇了2 ml/min作為蛋白沖洗流速，以減少分析時間且維持萃取效率。對于柱切換閥切換時間的選擇，在流速為2 ml/min 條件下，5.5 min即可完全沖洗完全血清中的蛋白雜質，多奈哌齊在20 min內不會被洗脫，而在切換流動相洗脫時1 min內可被洗脫至分析柱。故選擇5.5 min作為切換時間。

本實驗通過限進色譜填料預柱在線樣品預處理系統(tǒng)，建立了一種簡單、快速、高選擇性的基于柱切換系統(tǒng)的在線人血清多奈哌齊測定方法。由于血清中多奈哌齊濃度較低故柱切換在線萃取富集技術非常適用。此外，由于限進色譜填料的應用，樣品預處理過程具有高度選擇性，多奈哌齊在長波長范圍(315 nm)得到了較好測定。同已有的生物樣品中多奈哌齊測定方法相比，本實驗顯著降低了萃取及分離的時間，且回收率較高，線性關系良好，精密度、準確度符合要求。已報道的多奈哌齊分析條件較為苛刻，需要調節(jié)pH至2，并加入高氯酸，可能對色譜柱產生負面影響[2]。本實驗分析條件易于實現(xiàn)，對分析柱無影響，簡化了已報道的柱切換系統(tǒng)[16]。該方法有較好的線性關系，精密度及回收率，可用于生物樣品中多奈哌齊的常規(guī)分析及生物等效性研究。

[1] Rogers SL, Farlow MR, Doody RS,etal. A 24-week, double-blind, placebo-controlled trial of donepezll in patients with Alzheimer 's disease[J]. Neurology, 1998, 50: 136.

[2] Norio YF, Furuya R, Takahata T,etal. Determination of donepezil, an acetylcholinesterase inhibitor, in human plasma by high-performance liquid chromatography with ultraviolet absorbance detection[J]. J Chromatogr B, 2002, 768: 261.

[3] Radwan MA, Abdine HH, Al-Quadeb BT,etal. Stereoselective HPLC assay of donepezil enantiomers with UV detection and its application to pharmacokinetics in rats[J]. J Chromatogr B, 2006, 830: 114.

[4] Nakashima K, Itoh K, Kono M,etal. Determination of donepezil hydrochloride in human and rat plasma, blood and brain microdialysates by HPLC with a short C30 column[J]. J Pharm Biomed Anal, 2006, 41:201.

[5] Souverain S, Rudaz S, Veuthey JL,etal. Restricted access materials and large particle supports for on-line sample preparation: an attractive approach for biological fluids analysis[J]. J Chromatogr B, 2004, 801:141.

[6] Chiap P, Piette M, Evrard B,etal. Automated method for the determination of a new matrix metalloproteinase inhibitor in ovine plasma and serum by coupling of restricted access material for on-line sample clean-up to liquid chromatography[J]. J Chromatogr B, 2005, 817:109.

[7] Rbeida O, Chiap P, Lubda D,etal. Development and validation of a fully automated LC method for the determination of cloxacillin in human plasma using anion exchange restricted access material for sample clean-up[J]. J Pharm Biomed Anal, 2005, 36: 961.

[8] Vintiloiu A, Mullett WM, Papp R,etal. Combining restricted access material (RAM) and turbulent flow for the rapid on-line extraction of the cyclooxygenase-2 inhibitor rofecoxib in plasma samples[J]. J Chromatogr A, 2005, 1082:150.

[9] Musteata FM, Walles M, Pawliszyn J. Fast assay of angiotensin 1 from whole blood by cation-exchange restricted-access solid-phase microextraction[J]. Anal Chim Acta, 2005, 537: 231.

[10] Lambert JP, Mullett WM, Kwong E,etal. Stir bar sorptive extraction based on restricted access material for the direct extraction of caffeine and metabolites in biological fluids[J]. J Chromatogr A, 2005, 1075: 43.

[11] Neto AJ, Rodrigues JC, Fernandes C,etal. Automated microcolumn-switching system for drug analysis by direct injection of human plasma[J]. J Chromatogr A, 2006, 1105:71.

[12] Ortelli D, Rudaz S, Souverain S,etal. Restricted access materials for fast analysis of methadone in serum with liquid chromatography-mass spectrometry[J]. J Sep Sci, 2002, 25:222.

[13] 樊鵬程, 馬 駿, 賈正平, 等. 在線柱切換RP-HPLC測定人血清中卡馬西平濃度[J].藥物分析雜志, 2008, 28(12): 2033.

[14] Yamamoto E, Igarashi H, Sato Y,etal. Reliable on-line sample preparation of basic compounds from plasma using a reversed phase restricted access media in column-switching LC[J]. J Pharm Biomed Anal, 2006, 42:587.

[15] Pappa H, Farru R, Vilanova PO,etal. A new HPLC method to determine Donepezil hydrochloride in tablets[J]. J Pharm Biomed Anal, 2002, 27:177.

[16] Asakawa Y, Ozawa C, Osada K,etal. Reduction of carry-over in column-switching HPLC/MS system with automated system washing procedure for highly sensitive direct analysis of donepezil in dog plasma[J]. J Pharm Biomed Anal, 2007, 43:683.

2009-12-10

[修回日期] 2010-10-02

Detectionofdonepezilfromserumbyon-linesamplepreparationRAM-HPLC

MA Jun, FAN Peng-cheng, REN Jun, JIA Zheng-ping

(Department of Pharmacy, General Hospital of Lanzhou Command, Lanzhou 730050，China)

ObjectiveTo establish a sample preparation restricted access material (RAM) HPLC method for the quantification of donepezil in human serum.MethodThe sample was prepocessed by LiChrospher?ADS C18(25 mm × 4 mm，25 μm) as pre-column and analyzed by Microsorb-MV C18(150 mm × 4.6 mm，4 μm ) as analytical column. Acetonitrile to water (99:1, v/v) was flushing mobile phase with flow rate of 2 ml/min. The mixture of phosphate buffer (pH 4.6, 0.02 M), acetonitril and triethylamine (65:35:0.1, v/v/v) was analytical mobile phase with flow rate of 1 ml/min. The detection wave was 315 nm.ResultsThe linear range was from 0.02 to 1.0 μg/ml (r=0.999 5). The RSDs of intra-day and inter-day were less than 7%, the recoveries were between 87.9%～91.1%.ConclusionThe method is accurate, stable and sensitive which could be used to study the pharmacodynamics and bioavailabilty of donepezil.

restricted access material; on-line sample preparation; donepezil; column-switching

馬 駿(1962-)，男，主任藥師.Tel: (0931) 8994656.

賈正平.Tel：(0931) 8994652.

R92;R94

A

1006-0111(2011)02-0122-03