普伐他汀對(duì)人內(nèi)皮祖細(xì)胞一氧化氮合成的影響

肖剛峰，張懷勤

(1.寧波市第二醫(yī)院血液科，浙江 寧波 315000； 2.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心臟中心，浙江 溫州 325000)

普伐他汀對(duì)人內(nèi)皮祖細(xì)胞一氧化氮合成的影響

肖剛峰1，張懷勤2

(1.寧波市第二醫(yī)院血液科，浙江 寧波 315000； 2.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心臟中心，浙江 溫州 325000)

目的觀察普伐他汀對(duì)人內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)一氧化氮(NO)合成的影響。方法密度梯度離心法獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞,培養(yǎng)7 d 后,收集貼壁細(xì)胞并分別加入普伐他汀，10 μmol/L及100 μmol/L 干預(yù)48 h , 免疫組化、熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀鑒定EPC , 用RT-PCR 方法測(cè)定對(duì)細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS) mRNA 表達(dá)的影響,并用硝酸還原酶法測(cè)定培養(yǎng)液中一氧化氮(NO)的水平。結(jié)果普伐他汀組的人內(nèi)皮祖細(xì)胞eNOS mRNA 的表達(dá)、NO 的合成明顯增加。結(jié)論普伐他汀可增加人內(nèi)皮祖細(xì)胞eNOS mRNA的表達(dá)和NO 的合成。

普伐他汀; 內(nèi)皮祖細(xì)胞; 一氧化氮; 一氧化氮合成酶

近年來研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥擁有獨(dú)立于降脂外的多項(xiàng)心血管保護(hù)作用，它能上調(diào)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的活性和NO的合成[1]。但對(duì)血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞—內(nèi)皮祖細(xì)胞的eNOS活性和NO合成有沒有影響呢？我們特對(duì)此做了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1材料 外周血取自成年健康男性，約70 ml。60 g/L羥乙基淀粉購(gòu)自Sigma公司，VEGF購(gòu)自PeproTech EC公司，纖維連接蛋白購(gòu)自Roche 公司， PE- 抗CD34單克隆抗體購(gòu)自CALTAG LABORATORIES， FITC-抗VE-Cadherin(鈣黏著蛋白)單克隆抗體購(gòu)自 Bender systemTM公司， PE-抗VEGFR-2(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2)單克隆抗體、FITC-抗CD133單克隆抗體購(gòu)自R&D1公司。胎牛血清、胰酶、Hank′s液、D-Hank′s液、PBS均購(gòu)自Gibco公司，培養(yǎng)基M199購(gòu)自Sigma公司。DiI-ac-LDL(熒光標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?購(gòu)自Molecular probe 公司，普伐他汀由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管病研究所惠贈(zèng)。胃癌細(xì)胞株(SGC7901)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。VIII因子相關(guān)抗原免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。一氧化氮測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。RT-PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。eNOS PCR引物購(gòu)自上海生物工程有限公司(eNOS 5-GGTCGCTTCGACGTGCT-3，5-TCCCCATTCCCAAATGTGCT-3，884bp)，GAPDH引物購(gòu)自PCR-Select cDNA Subtraction Kit(Clontech公司)。

1.2人外周血EPCs培養(yǎng) 取新鮮外周血70 ml，以密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，以3×106/ cm2密度接種于包被有纖維連接蛋白的24孔培養(yǎng)皿中，每皿加入1 ml包含有20%胎牛血清、VEGF(10 ng/ml)，青霉素(100 IU/ml)及鏈霉素(100 IU/ml)的M199，置37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后，洗去未貼壁細(xì)胞，添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3EPCs鑒定 在培養(yǎng)的第6天細(xì)胞以0.25%胰酶消化后，制成1×106/ml的單個(gè)細(xì)胞懸液，加入熒光標(biāo)記的抗CD34 、VE-Cadherin、VEGFR-2及CD133單克隆抗體各10 μl(1 mg/ml)，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞CD34 、VE-Cadherin、VEGFR-2及CD133的表達(dá)。為驗(yàn)證培養(yǎng)細(xì)胞吞噬DiI-ac-LDL，將DiI-ac-LDL以2.4 μg/ml的終濃度加入培養(yǎng)液，與細(xì)胞避光共孵育4 h，多聚甲醛固定10 min,加入FITC-UEA-1(10 μg/ml)孵育1 h。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞雙熒光。為驗(yàn)證細(xì)胞表達(dá)Ⅷ因子相關(guān)抗原，將培養(yǎng)細(xì)胞固定，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，加正常山羊血清封閉，1:1 000一抗4 ℃孵育過夜，加二抗及SABC液于37 ℃烤箱各孵育20 min，加A、B、C混合液顯色。空白對(duì)照不加一抗，陰性對(duì)照采用SGC7901。

1.4分組 在培養(yǎng)的第6天用含3%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h，之后以0.25%胰酶將各孔細(xì)胞消化下來制成細(xì)胞懸液，以1×104/cm2的接種密度接種到24孔板，分為對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng)液)以及二個(gè)干預(yù)組(普伐他汀濃度分別為10 和100 μmol/L條件的培養(yǎng)液)，每組6孔，培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行eNOS表達(dá)和NO濃度的測(cè)定。

1.5eNOS表達(dá)和NO濃度的測(cè)定 按照RT-PCR試劑盒操作提取各組細(xì)胞RNA并進(jìn)行RT-PCR(n=6)，按照一氧化氮測(cè)試盒要求檢查各組各孔培養(yǎng)液中NO的濃度(n=6)。

1.6統(tǒng)計(jì)分析 所有結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，輸入SPSS13.0軟件包，采用單因素方差分析比較各組均數(shù)，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1EPCs鑒定 培養(yǎng)3 d洗去不貼壁細(xì)胞及碎片后，可見典型細(xì)胞集落：中間為大量的圓形細(xì)胞，層層疊疊，外周為紡錘形細(xì)胞，向外擴(kuò)散(圖1A)。培養(yǎng)第6天熒光顯微鏡檢顯示：細(xì)胞吞噬DiI-ac-LDL，顯微鏡下激發(fā)紅色熒光(圖1B)，空白對(duì)照及陰性對(duì)照均無熒光。Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化陽(yáng)性，胞漿呈棕色(圖1C)，空白對(duì)照及陰性對(duì)照不顯棕色。用流式細(xì)胞儀分析表明，表達(dá)CD34、CD133、VEGFR-2、VE-Cadherin的細(xì)胞分別為(51.21±3.53)%、(19.15±3.45)%、(39.24±3.61)%及(54.28±3.56)%。

圖1 EPCs的鑒定

2.2普伐他汀對(duì)EPC eNOS表達(dá)的影響 結(jié)果見圖2，經(jīng)半定量分析，與對(duì)照組相比，普伐他汀能明顯提高EPCs eNOS表達(dá)(0.85±0.39 ，0.91±0.45 對(duì)0.50±0.31，n=6，P<0.05)；兩不同濃度普伐他汀干預(yù)組之間無差別(P>0.05)。

2.3普伐他汀對(duì)NO合成的影響 與對(duì)照組相比，普伐他汀能明顯增加EPC NO合成(60.76±7.26，71.25±11.26對(duì)47.70±6.13，P<0.05)；兩不同濃度普伐他汀干預(yù)組之間無差別(P>0.05)。

3 討論

圖2 各組EPC eNOS RT-PCR電泳圖

血管內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化以及缺血性疾病的早期表現(xiàn)之一。內(nèi)皮功能障礙的一個(gè)重要特征是內(nèi)皮源性的NO 合成、釋放和活性受損。內(nèi)皮型NO 減少通過促進(jìn)血管收縮、血小板聚集、平滑肌細(xì)胞增殖和白細(xì)胞黏附而損傷血管內(nèi)皮功能。EPCs 是一群能增殖分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞但尚未表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型，并參與出生后新生血管形成及內(nèi)皮損傷修復(fù)的干/祖細(xì)胞。最近研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程除了相鄰成熟內(nèi)皮細(xì)胞延展修復(fù),還有一部分是通過外周血中的EPCs 分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞來完成[2,3]，表明EPCs在維持正常血管內(nèi)皮功能中扮演了重要角色。

近年來研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥擁有獨(dú)立于降脂外的多項(xiàng)心血管保護(hù)作用，它能改善血管內(nèi)皮功能，能促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員增殖減少凋亡，并能增加其遷移黏附等活性[4～6]。此類作用的機(jī)制被認(rèn)為跟他汀類藥能上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的活性有關(guān)。它能通過多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑影響eNOS的活性，如它通過調(diào)節(jié)RhoGTPase穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)eNOS水平，能通過蛋白激酶Akt途徑增強(qiáng)eNOS活性來調(diào)節(jié)VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的遷移[7，8]。但過去此類研究多關(guān)注的是他汀類對(duì)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的活性以及NO合成和分泌的影響。有研究證明內(nèi)皮祖細(xì)胞有與成熟內(nèi)皮細(xì)胞相似的特性，表達(dá)eNOS能合成分泌NO[9]，而且內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員與內(nèi)皮型NO的分泌密切相關(guān)[10]。故我們猜測(cè)他汀類藥物同樣對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞eNOS表達(dá)以及NO的合成和分泌有影響，內(nèi)皮祖細(xì)胞作為血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞，他汀類對(duì)其功能的改善可能是其對(duì)整個(gè)血管內(nèi)皮功能改善的重要組成部分。

在實(shí)驗(yàn)中，筆者觀察到加入普伐他汀的內(nèi)皮祖細(xì)胞eNOS表達(dá)增強(qiáng)，NO的合成分泌增加。這表明他汀類藥物促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員增殖和增強(qiáng)其遷移黏附等能力的機(jī)制可能部分是通過上調(diào)其eNOS的活性和NO的合成，其具體信號(hào)傳導(dǎo)途徑還需要進(jìn)一步研究,有研究提示通過PI3K/Akt途徑[11]。本實(shí)驗(yàn)提示了上調(diào)內(nèi)皮祖細(xì)胞eNOS的活性和NO的合成是他汀類藥物獨(dú)立于降脂外的心血管保護(hù)作用之一，是他汀類藥物治療心血管疾病和其他缺血性疾病新的證據(jù)。鑒于內(nèi)皮祖細(xì)胞特點(diǎn)及與新生血管的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)也同時(shí)表明增加eNOS表達(dá)、NO合成的藥物可能可以用來有效治療動(dòng)脈粥樣硬化以及缺血性疾病。

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2010-08-01

[修回日期] 2010-12-12

Effectsofpravastatinonnitricoxideproductioninendothelialprogenitorcells

XIAO Gang-feng1, ZHANG Huai-qin2

(1. The Second Hospital of Ningbo , Ningbo 315000,China; 2. The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000,China)

ObjectiveTo investigate the effects of pravastatin on nitric oxide production in endothelial progenitor cells.MethodsTotal mononuclear cells(MNCs) were isolated from peripheral blood by Ficoll density gradient centrifugation,and cultured in vitro. After 7 days of culture, attached cells were stimulated with pravastatin (10 and 100 μmol/L) for 48 h. The cells were identified by immuno-histochemistry and flow cytometry and tested the ability to intake the acLDL. The content of NO and the level of endothelial nitric oxide synthase ( eNOS) mRNA were tested.ResultsCompared with control group, the content of NO and the level of eNOS of pravastatin group increased obviously (P<0. 05).ConclusionsPravastatin could increase the production of nitric oxide and the expression of eNOS mRNA in EPCs, which could improve blood vessel endothelium function.

pravastatin; endothelial progenitor cells; nitric oxide; endothelial nitric oxide synthesis

肖剛峰(1981-)，男，碩士，主治醫(yī)師.Tel：13867855268，E-mail:ducan11@163.com.

R972;R96

A

1006-0111(2011)02-0111-03