還腦益聰方組分對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織炎癥因子和氧化應(yīng)激的影響*

官 杰， 李 浩， 劉劍剛△， 劉明芳， 蔡琳琳， 胡 佳， 魏 蕓

(1中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院， 北京 100091；2北京化工大學(xué)分析化學(xué)系， 北京 100029)

還腦益聰方組分對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織炎癥因子和氧化應(yīng)激的影響*

官 杰1#， 李 浩1， 劉劍剛1△， 劉明芳1， 蔡琳琳1， 胡 佳2， 魏 蕓2

(1中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院， 北京 100091；2北京化工大學(xué)分析化學(xué)系， 北京 100029)

目的研究中藥復(fù)方-還腦益聰方(HNYCF)組分對(duì)阿爾茨海默病(AD)動(dòng)物模型腦組織炎癥因子和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響，探討其治療AD的作用機(jī)制。方法選用3月齡APP695V717I轉(zhuǎn)基因小鼠AD模型，隨機(jī)分成4組：模型組、鹽酸多奈哌齊組、HNYCE組分大劑量組和HNYCF組分小劑量組。另設(shè)立正常對(duì)照組(相同遺傳背景的C57BL/6J小鼠)。各組小鼠按相應(yīng)處理連續(xù)灌胃6個(gè)月后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。采用Morris水迷宮和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)觀測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腦組織核因子κB(NF-κB)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的表達(dá)水平，放射免疫法測(cè)定腦組織皮層和海馬白細(xì)胞介素-6(IL-6)和高敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)的含量，比色法檢測(cè)血清超氧化物歧化酶(SOD)活性，硫代巴比妥酸法測(cè)定血清丙二醛(MDA)含量。結(jié)果HNYCF小鼠在Morris水迷宮中穿越平臺(tái)次數(shù)、第4象限游泳時(shí)間和路程均較模型組顯著增多(Plt;0.05或Plt;0.01)；HNYCF大劑量組小鼠在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中潛伏期較模型組顯著延長(zhǎng)(Plt;0.01)；HNYCF小鼠腦組織NF-κB表達(dá)下調(diào)，PPARγ表達(dá)上調(diào)，IL-6含量減少，與模型組比較有顯著差異(Plt;0.05或Plt;0.01)；HNYCF小鼠血清SOD活性較模型組顯著升高(Plt;0.05或Plt;0.01)。結(jié)論HNYCF可以改善APP轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制可能與抗炎、抗氧化作用有關(guān)。

阿爾茨海默病； 還腦益聰方； APP轉(zhuǎn)基因小鼠； 細(xì)胞因子類； 氧化性應(yīng)激

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種常見(jiàn)的以進(jìn)行性認(rèn)知功能減退為特征中樞神經(jīng)系統(tǒng)的變性疾病，其特征性組織病理學(xué)改變主要包括老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)、神經(jīng)細(xì)胞和突觸的丟失等。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)AD的研究已逾百年，提出了多種假說(shuō)，并針對(duì)其開(kāi)發(fā)出多類藥物，但迄今為止，其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚[1,2]，理想的治療手段和藥物仍然缺乏。近年來(lái)，隨著對(duì)β淀粉樣蛋白(beta amyloid protein，Aβ)級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)的深入研究，對(duì)免疫炎癥學(xué)說(shuō)和氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)的日益重視及對(duì)三者相互作用導(dǎo)致神經(jīng)毒性作用增強(qiáng)的認(rèn)識(shí)，開(kāi)發(fā)具有抗炎、抗氧化等多途徑作用特點(diǎn)的中藥復(fù)方，在防治AD方面將極具優(yōu)勢(shì)和前景。遵循中醫(yī)辨證理念組成的中藥復(fù)方還腦益聰方(Huannaoyicongfang,HNYCF)已取得較好的前期臨床效果[3]，現(xiàn)應(yīng)用現(xiàn)代工藝技術(shù)提取HNYCF的復(fù)方組分，觀察其對(duì)AD動(dòng)物模型β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織炎癥因子和氧化應(yīng)激的影響。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 清潔級(jí)(SPF)，3月齡APP695V717I轉(zhuǎn)基因小鼠60只，雌雄各半，體重17-23 g；SPF，同月齡相同遺傳背景C57BL/6J小鼠15只，體重17-23 g，均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，動(dòng)物許可證為SCXK(京)2005-0013。

1.2藥物 HNYCF由北京化工大學(xué)提取其組分。鹽酸多奈哌齊(商品名稱：安理申)，5 mg/片，由衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司提供(批號(hào)為081121A)。

1.3主要藥品與試劑 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)抗體，批號(hào)為100411；過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(streptavidin peroxidase，SP)免疫組化染色試劑盒，批號(hào)為100113；3,3-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(diaminobenzidine，DAB)染色試劑盒，批號(hào)為100119；由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。濃縮型多克隆(效價(jià)1∶100)核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor-κB p65，NF-κB p65)抗體，批號(hào)：100422；二步法免疫組化試劑盒(通用性Ⅱ抗-生物素標(biāo)記的羊抗兔)，批號(hào)為100410，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)和高敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)放射免疫試劑盒由北京北方生物科技有限公司提供。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(批號(hào)為100412)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(批號(hào)為100410)由南京建成生物工程研究所提供。

1.4主要儀器 DMS-2型Morris水迷宮系統(tǒng)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所生產(chǎn)；DTT-2型小鼠跳臺(tái)儀由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所生產(chǎn)；BH-2型生物顯微鏡(Olympus)；DpxView Pro型計(jì)算機(jī)彩色圖像處理系統(tǒng)(Delta Pix)；γ-911型全自動(dòng)放射免疫計(jì)數(shù)儀由中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司生產(chǎn)；Multiskan MK3型酶標(biāo)儀由雷勃生物醫(yī)學(xué)有限公司生產(chǎn)；7020型全自動(dòng)生化儀由日立公司生產(chǎn)。

2方法

2.1HNYCF組分的制備 HNYCF由何首烏、人參、川芎、石菖蒲和黃連組成，將5種藥材分別過(guò)篩后，按比例混合均勻，經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)取得最佳提取條件，采用高效液相色譜(HPLC)對(duì)提取液中的二苯乙烯苷、阿魏酸、鹽酸小檗堿3種成分進(jìn)行含量測(cè)定，分別為3.58%、0.32%、1.83%，同時(shí)測(cè)量濃縮干燥后每組實(shí)驗(yàn)浸膏得率。按最佳正交條件提取的藥液中，上述各藥材的有效成分經(jīng)測(cè)定轉(zhuǎn)移率均超過(guò)50%。采用紫外可見(jiàn)分光光度法(比色法)測(cè)定浸膏中組分的含量，分別為：總黃酮14.19%，總皂苷25.98%，總酚酸2.27%，總生物堿5.20%，多糖(沉淀部分)51.36%。

2.2分組與給藥 將APP695V717I轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為模型組、HNYCF組分大劑量組(2.8 g·kg-1·d-1)、HNYCF組分小劑量組(1.4 g·kg-1·d-1)和鹽酸多奈哌齊組(0.65 mg·kg-1·d-1)，每組15只；同月齡相同遺傳背景的C57BL/6J小鼠15只作為正常對(duì)照組。所試藥物稀釋相同體積灌胃給藥，正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，均每天1次。連續(xù)灌胃6個(gè)月，第6月前1周進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。灌胃過(guò)程中HNYCF組分小劑量組死亡1只；跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中鹽酸多奈哌齊組有1只觸電死亡。

2.3行為學(xué)測(cè)試

① Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 參照Morris實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)時(shí)將水池以4個(gè)等距離點(diǎn)均分為4個(gè)象限區(qū)，在第4象限位于池壁和圓心中間放置有機(jī)玻璃站臺(tái)。向水池中加水，水溫(25±1)℃，注入奶粉，混勻，使水成不透明的乳白色，并使計(jì)算機(jī)能成功跟蹤小鼠的活動(dòng)。從第2象限池壁選擇并標(biāo)記1個(gè)入水點(diǎn)，將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠從入水至尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間(即逃避潛伏期)以及游泳距離。如小鼠在3 min內(nèi)未找到平臺(tái)，將其引導(dǎo)至平臺(tái)停留10 s，逃避潛伏期記為180 s。每天進(jìn)行1次，連續(xù)訓(xùn)練5 d。第5 d下午撤去平臺(tái)，任選1個(gè)入水點(diǎn)，將小鼠面向池壁放入水池中，攝像系統(tǒng)自動(dòng)記錄小鼠3 min內(nèi)進(jìn)出原平臺(tái)區(qū)的次數(shù)及在原平臺(tái)所在第4象限游泳時(shí)間和路程作為評(píng)價(jià)小鼠學(xué)習(xí)記憶成績(jī)的指標(biāo)。

② 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 跳臺(tái)儀實(shí)驗(yàn)箱為有機(jī)玻璃箱，底面鋪有銅柵并與電源相連，電流控制在36 V。銅柵上靠箱內(nèi)一角置一絕緣臺(tái)作為動(dòng)物回避電擊的安全區(qū)。實(shí)驗(yàn)裝置與計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄系統(tǒng)相連。將小鼠放入跳臺(tái)儀實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，適應(yīng)環(huán)境5 min，之后將小鼠輕放于跳臺(tái)上，并將銅柵通電，當(dāng)小鼠從臺(tái)上跳下四肢接觸銅柵時(shí)會(huì)受到電擊，正?；乇芊磻?yīng)是跳上跳臺(tái)返回安全區(qū)逃避電擊，如此學(xué)習(xí)5 min。24 h后進(jìn)行記憶能力測(cè)試。記錄小鼠從停留在跳臺(tái)上至第1次跳下受電擊的時(shí)間即潛伏期和5 min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)(小鼠四肢同時(shí)接觸銅柵觸電的次數(shù))，以此作為記憶功能的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2.4腦組織樣品處理 小鼠于末次行為學(xué)測(cè)試后，禁食12 h，不禁水。第2 d，進(jìn)行腦組織及血清取材。各組小鼠麻醉后眼眶取血，分離血清(3 000 r/min離心，20 min)，置-80 ℃冰箱保存，備用于指標(biāo)檢測(cè)。其中，模型組有1只未能取血?？焖贁囝^取全腦，在低溫下取動(dòng)物腦組織，用濾紙吸干，稱重。每組隨機(jī)選取6只小鼠腦組織放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上(4 ℃)，之后換后固定液，待腦組織下沉后即可行石蠟包埋、切片，進(jìn)行免疫組化染色。其余小鼠分別迅速分離皮層和海馬(冰磚上進(jìn)行)，各加入2 mL生理鹽水勻漿，低溫高速離心機(jī)離心(3 000 r/min，20 min)，分離上清液，用于組織含量測(cè)定。

2.5免疫組化法測(cè)定NF-κB和PPARγ的表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)小鼠海馬CA1區(qū)NF-κB和PPARγ的表達(dá)。病理免疫組織化學(xué)染色根據(jù)二步法免疫組化試劑盒說(shuō)明書操作，每組隨機(jī)選取4只動(dòng)物的腦組織切片，常規(guī)脫蠟，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，10%正常山羊血清封閉。滴加Ⅰ抗，即抗NF-κBp65蛋白多克隆抗體，NF-κB的濃度為1∶50，4 ℃過(guò)夜；PPARγ的濃度為1∶30。37 ℃孵育1 h，PBS溶液沖洗；滴加Ⅱ抗生物素化山羊抗小鼠IgG，室溫20 min，PBS溶液沖洗；滴加SP復(fù)合物，室溫20 min，PBS溶液沖洗；DAB-H2O2顯色，蘇木素輕度復(fù)染；乙醇脫水、透明、中性膠封片，選取同批染色切片進(jìn)行顯微鏡觀察。免疫組化染色結(jié)果圖像分析：每組隨機(jī)選取4只小鼠，每只動(dòng)物取相同位置2張腦片，在40倍物鏡下，以胞漿染成棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞標(biāo)志，記數(shù)小鼠海馬CA1區(qū)內(nèi)NF-κB和PPARγ染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。

2.6腦組織IL-6和hs-CRP含量測(cè)定 采用放射免疫法檢測(cè)。

2.7氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定 血清SOD活性測(cè)定，采用比色法；血清MDA含量測(cè)定，采用硫代巴比妥酸(thibabituric acid, TBA)法。

2.8海馬、皮層總蛋白含量的測(cè)定 采用雙縮脲法。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1HNYCF組分對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

與正常組比較，模型組在Morris水迷宮中穿越原平臺(tái)位置次數(shù)、第4象限游泳時(shí)間和路程均顯著減少(Plt;0.05或Plt;0.01)。各給藥組治療后，在Morris水迷宮中穿越原平臺(tái)位置次數(shù)、第4象限游泳時(shí)間和路程均較模型組顯著增多(Plt;0.05或Plt;0.01),見(jiàn)表1。

表1 HNYCF組分對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2HNYCF組分對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠一次性回避反應(yīng)記憶功能的影響

各組小鼠在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中的錯(cuò)誤次數(shù)組間比較無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)，但模型組呈現(xiàn)錯(cuò)誤次數(shù)增高的趨勢(shì)。與正常組比較，模型組的潛伏期明顯縮短(Plt;0.01)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組潛伏期明顯延長(zhǎng)(Plt;0.05)，HNYCF組分大劑量組潛伏期顯著延長(zhǎng)(Plt;0.01)，小劑量組潛伏期亦有延長(zhǎng)趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異(Pgt;0.05),見(jiàn)表2。

表2 HNYCF組分對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠一次性回避反應(yīng)記憶功能的影響

3HNYCF組分對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA1區(qū)NF-κB和PPARγ表達(dá)的影響

APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA1區(qū)均可見(jiàn)棕褐色陽(yáng)性表達(dá)，主要分布于神經(jīng)元胞漿和胞膜，其中PPARγ在胞核上亦有少許表達(dá)。與正常組比較，模型組NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增多(Plt;0.01)，PPARγ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異(Pgt;0.05)。各給藥組治療后，NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組顯著減少(Plt;0.05或Plt;0.01)，PPARγ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較模型組顯著增多(Plt;0.05),見(jiàn)表3、圖1、2。

表3 HNYCF組分對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬CA1區(qū)NF-κB和PPARγ表達(dá)的影響

Figure 1. The expression of NF-κB in hippocampus CA1 region of mice in each group was detected by immunohistochemistry with image analysis (×400).A: normal group; B: model group; C: donepezil group; D: HNYCF high-dose group; E: HNYCF low-dose group; F: negative control.

Figure 2. The expression of PPARγ in hippocampus CA1 region of mice in each group was detected by immunohistochemistry with image analysis (×400) . A: normal group; B: model group; C: donepezil group; D: HNYCF high-dose group; E: HNYCF low-dose group; F: negative control.

4HNYCF組分對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬和皮層IL-6含量的影響

與正常組比較，模型組海馬和皮層的IL-6含量均顯著增多(Plt;0.01)；與模型組海馬IL-6含量比較，鹽酸多奈哌齊組和HNYCF組分小劑量組均顯著減少(Plt;0.01或Plt;0.05)，HNYCF組分大劑量組較模型組亦有所減少，但無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)；與模型組皮層IL-6含量比較，HNYCF組分大、小劑量組均顯著減少(Plt;0.01或Plt;0.05)，鹽酸多奈哌齊組較模型組亦有所減少，但無(wú)顯著差異(Pgt;0.05),見(jiàn)表4。

表4 HNYCF組分對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬和皮層IL-6含量的影響

5HNYCF組分對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬和皮層hs-CRP含量的影響

與正常組比較，模型組海馬和皮層的hs-CRP含量均呈增多趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)；與模型組海馬hs-CRP含量比較，各給藥組均呈減少趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)；與模型組皮層hs-CRP含量比較，正常組和各給藥組亦均呈減少趨勢(shì)，但無(wú)顯著差異(Pgt;0.05),見(jiàn)表5。

表5 HNYCF組分對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠海馬和皮層hs-CRP含量的影響

6HNYCF組分對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠血清SOD活性和MDA含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清SOD活性和MDA含量均無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)；與模型組血清SOD活性比較，HNYCF組分大、小劑量組均有顯著升高(Plt;0.05或Plt;0.01)，鹽酸多奈哌齊組無(wú)顯著差異(Pgt;0.05)；與模型組血清MDA含量比較，各給藥組均無(wú)顯著差異(Pgt;0.05),見(jiàn)表6。

表6 HNYCF組分對(duì)APP轉(zhuǎn)基因小鼠血清SOD活性和MDA含量的影響

討 論

“Aβ級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)”認(rèn)為Aβ是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[4,5]，其中，APP基因突變?cè)黾恿薃β42的產(chǎn)生和聚集，Aβ42寡聚體沉積形成斑塊，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)、氧化損傷、NFTs、軸突損傷和突觸丟失等級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和癡呆。APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦部表達(dá)人APP基因，并通過(guò)APP蛋白在大腦中過(guò)量表達(dá)，Aβ產(chǎn)生增加，導(dǎo)致神經(jīng)毒害作用，損傷小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并聚集和沉積形成老年斑。

NF-κB是介導(dǎo)許多免疫和炎癥反應(yīng)的中心物質(zhì)，與AD的免疫炎性機(jī)制密切相關(guān)[6]，它主要是通過(guò)調(diào)節(jié)一系列參與免疫、炎癥反應(yīng)及凋亡的基因轉(zhuǎn)錄來(lái)發(fā)揮作用。在AD大腦中，Aβ通過(guò)激活NF-κB[7]介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，增加的NF-κB在AD腦中彌漫的Aβ斑塊附近的神經(jīng)元細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。PPARγ與NF-κB控制的炎癥基因轉(zhuǎn)錄關(guān)系密切，也是AD免疫炎癥相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子[6]， PPARγ激活后可以抑制NF-κB的表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平抑制某些促炎介質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄從而抑制炎癥因子的釋放，發(fā)揮抗炎作用，參與調(diào)節(jié)AD神經(jīng)炎癥反應(yīng)；PPARγ并能調(diào)節(jié)細(xì)胞APP水平和Aβ的產(chǎn)生，減少淀粉樣斑塊形成，改善認(rèn)知和記憶功能障礙等[8,9]。IL-6基因可由NF-κB調(diào)控表達(dá)，IL-6在腦內(nèi)主要由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞活化后生成[10]，是一種炎癥性細(xì)胞因子，可以介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，可誘導(dǎo)急性相反應(yīng)蛋白在神經(jīng)炎性斑塊中聚集，也可激活補(bǔ)體損傷神經(jīng)細(xì)胞，并對(duì)APP的表達(dá)具有直接調(diào)控作用，可以促進(jìn)APP產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致Aβ沉積。hs-CRP是一種敏感的非特異性炎癥標(biāo)志物，在心腦血管疾病診斷與治療中發(fā)揮著重要作用，但目前就其在AD中的含量變化尚存不同看法[11,12]。研究結(jié)果表明，9月齡APP695V717I轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織NF-κB的表達(dá)明顯升高，皮層和海馬的IL-6含量顯著增多、hs-CRP含量呈增高趨勢(shì)，表明其腦內(nèi)存在炎癥反應(yīng)，這可能與其腦內(nèi)Aβ生成增多誘發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。HNYCF具有顯著上調(diào)APP轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織PPARγ的表達(dá)，降低NF-κB的表達(dá)，減少腦組織皮層和海馬IL-6含量的作用，提示抗炎是HNYCF改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制之一。

氧化應(yīng)激發(fā)生于AD疾病進(jìn)程的早期，顯著早于NFTs和SP病理特點(diǎn)的形成[13]，氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)在AD的發(fā)生發(fā)展中起舉足輕重的作用。SOD是一類生物體內(nèi)天然存在的氧自由基清除劑，其活性的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要降解產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，其含量的多少間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。有研究[14]報(bào)道用放射免疫法測(cè)定9月齡APP695V717I轉(zhuǎn)基因小鼠腦皮質(zhì)SOD活性較正常對(duì)照組顯著降低(Plt;0.05)，腦皮質(zhì)MDA含量顯著升高(Plt;0.05)，提示9月齡該模型小鼠腦內(nèi)存在一定程度的氧化應(yīng)激損傷。本研究中模型組小鼠血清SOD活性和MDA含量與正常組相比均無(wú)顯著差異，這可能是因?yàn)槠銼OD活性和MDA含量在腦組織和血清中可能存在不一致性，腦內(nèi)的氧化應(yīng)激在血清中可能反應(yīng)不明顯，或者9月齡該模型小鼠尚未衰老及病變至強(qiáng)烈氧化應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)。HNYCF能夠明顯提高APP轉(zhuǎn)基因小鼠機(jī)體清除氧自由基的能力，可以通過(guò)抗氧化應(yīng)激改善模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，這可能是其防治AD的作用機(jī)制之一。

HNYCF是以AD虛損為主，兼顧痰濁、瘀毒的復(fù)雜中醫(yī)病機(jī)特點(diǎn)而組成的中藥復(fù)方，在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，經(jīng)現(xiàn)代工藝提取該方的復(fù)方組分，探討其對(duì)AD動(dòng)物模型腦組織炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響。HNYCF由何首烏、人參、川芎、石菖蒲、黃連組成。其中，首烏具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)、強(qiáng)筋骨功能，其有效成分二苯乙烯苷具有抗癡呆藥理作用，其多糖也具有抗氧化、抗癡呆及提高學(xué)習(xí)記憶能力的作用。人參是傳統(tǒng)滋補(bǔ)藥，人參皂苷是其主要成分，可直接或間接抑制炎性因子的分泌達(dá)到抗炎功效，并具有清除自由基，抗氧化作用等。川芎具有活血行氣之功，有效成分川芎嗪可通過(guò)提高SOD活性、降低MDA含量、降低乙酰膽堿酯酶活性、降低腦組織中Aβ、NF-κB的表達(dá)等途徑提高AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[15]。石菖蒲是中醫(yī)益智方中的常用藥，其水提取液及其揮發(fā)油具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、開(kāi)竅醒神、促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶等藥效。黃連性寒、味苦，有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)[16]，黃連的作用主要與其根莖所含的生物堿(約占根莖的4%-8%)有關(guān)，具有廣泛的藥理活性，可通過(guò)作用于某些炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)發(fā)揮抗炎作用，并具有免疫調(diào)節(jié)作用和抗氧化作用。

所提取HNYCF組分由總黃酮、總皂苷和總酚酸等組成，最大限度保留了中藥的有效組分。研究結(jié)果表明，該復(fù)方組分可以通過(guò)抗炎癥反應(yīng)和抗氧化作用改善APP轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，表明抑制炎癥反應(yīng)和抗氧化應(yīng)激作用是HNYCF治療AD的有效途徑之一。

(致謝：實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)部分承首都醫(yī)科大學(xué)北京宣武醫(yī)院張麗老師指導(dǎo)，謹(jǐn)致謝忱！)

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EffectsofChineseherbalcompoundHuannaoyicongfangoninflammatorycytokinesandoxidativestressinbrainofAPPtransgenicmice

GUAN Jie1, LI Hao1, LIU Jian-gang1, LIU Ming-fang1, CAI Lin-lin1, HU Jia2, WEI Yun2

(1XiyuanHospitalofChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100091,China;2FacultyofSciences,BeijingUniversityofChemicalTechnology,Beijing100029,China.E-mail:liujiangang2002@sina.com)

AIM: To study the effects of Chinese herbal compound Huannaoyicongfang (HNYCF) on inflammatory reaction and oxidative stress in the brain of Alzheimer’s disease (AD) animal model, and to explore its role in treating AD.METHODSAPP695V717I transgenic mice (3 months old),as an AD model in this study, were randomly divided into model group, donepezil group, HNYCF high-dose group and HNYCF low-dose group. C57BL/6J mice, which were of the same age and genetic background as the transgenic mice, were used as controls. The animals were administered intragastrically with the drug or water from 3 months old to 9 months old. Morris water maze test was performed to measure the spatial learning and memory ability. Step-down test was performed to observe the learning and memory ability of single passive avoidance response. The expression of nuclear factor kappa B (NF-κB) and peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) in hippocampus CA1 region was detected by immunohistochemistry with image analysis. The levels of interleukin-6 (IL-6) and high sensitivity C-reactive protein (hs-CRP) in the brain cortex and hippocampus homogenate were measured by radioimmunoassay. The activity of superoxide dismutase (SOD) in serum was detected by colorimetry. The content of malondialdehyde (MDA) in serum was detected by thibabituric acid method.RESULTSMorris water maze test showed that the times of crossing platform, and the swimming time and distance in the fourth quadrant in HNYCF groups were much more than those in model group. The step-down test manifested that the escape latency in HNYCF high-dose group was significantly longer than that in model group. Compared with model group, the expression of NF-κB obviously decreased, the expression of PPARγ significantly increased and the content of IL-6 was lower in HNYCF groups. The activity of serum SOD in HNYCF groups was significantly higher than that in model group.CONCLUSIONHNYCF evidently ameliorates the learning and memory ability in APP transgenic mice, which may be related to the anti-inflammatory and anti-oxidation effects of HNYCF.

Alzheimer disease; Huannaoyicongfang; APP transgenic mice; Cytokines; Oxidative stress

1000-4718(2011)04-0711-07

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.017

2010-10-18

2011-01-17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30873338)；國(guó)家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)課題資助項(xiàng)目(No.2009ZX09103-391)

△ 通訊作者 Tel: 010-62835630; E-mail: liujiangang2002@sina.com

# 現(xiàn)工作單位：山東省青島市海慈醫(yī)療集團(tuán)內(nèi)分泌科，山東 青島 266033