肌注PHA對(duì)豬血清中補(bǔ)體C3、C4的影響

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肌注PHA對(duì)豬血清中補(bǔ)體C3、C4的影響

肖嘯①* 何克燦②沈?qū)W文②張榮華②楊東②(①云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 昆明 650201 ②云南省紅河州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 蒙自)

本試驗(yàn)對(duì)各豬只肌注PHA，通過測(cè)定不同時(shí)期血清中補(bǔ)體C3、C4的濃度，來判定PHA是否對(duì)補(bǔ)體有影響作用，并測(cè)定有顯著影響的PHA劑量。試驗(yàn)中，把PHA分成5個(gè)劑量組：低劑量組(0.4mg/kg)、中劑量組(0.8mg/kg)、高劑量組(1.2mg/kg)、超高劑量組(1.6 mg/kg)、對(duì)照組(0.8mg/kg生理鹽水)進(jìn)行肌肉注射。各試驗(yàn)豬均按正常管理、飼喂，并在注射后的第1、7、14d對(duì)各組豬只采血，測(cè)定其血清中補(bǔ)體的含量。結(jié)果顯示，不同劑量的PHA對(duì)豬只的補(bǔ)體系統(tǒng)刺激作用不同，其中中劑量組可以提高機(jī)體的補(bǔ)體水平，并保持一定時(shí)間的高水平，低劑量組的豬只補(bǔ)體水平稍有升高，而高劑量組和超高劑量組則使機(jī)體的補(bǔ)體水平有所降低。

豬 植物凝集素 補(bǔ)體C3、C4

植物凝集素(PHA)主要用于激活免疫細(xì)胞—淋巴細(xì)胞，是一種干擾素誘導(dǎo)劑，不僅可以刺激機(jī)體產(chǎn)生白介素-2和干擾素；還可以刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性抗體，激活機(jī)體的補(bǔ)體系統(tǒng)[9]。PHA的藥理作用[10-11]特別廣泛，其作用機(jī)理是機(jī)體免疫系統(tǒng)通過識(shí)別植物血凝素而識(shí)別病毒，并產(chǎn)生相應(yīng)的抗體和其它免疫反應(yīng)，從而清除體內(nèi)病毒。作用主要有：（1）PHA為廣譜抗病毒藥，可刺激T淋巴細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生大量效應(yīng)T細(xì)胞和細(xì)胞毒T細(xì)胞，效應(yīng)T細(xì)胞分泌產(chǎn)生大量細(xì)胞因子(如干擾素等)殺傷病毒，細(xì)胞毒T細(xì)胞可直接殺傷病毒。（2）PHA可同時(shí)刺激B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿母細(xì)胞后增殖分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞產(chǎn)生大量非特異性抗體來中和病毒。（3）PHA可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，提高骨髓造血機(jī)能，促進(jìn)機(jī)體白細(xì)胞及多核白細(xì)胞數(shù)量明顯增加；提高機(jī)體細(xì)胞誘生干擾素，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，促進(jìn)抗體形成，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病原微生物的吞噬作用。（4）PHA與黃芪多糖、左旋咪唑、阿糖腺苷配伍，有明顯的增效作用；與部分抗生素等配伍具有相加作用。（5）PHA在肌肉注射后約5~15min血藥濃度達(dá)高峰，口服約1h后血藥濃度達(dá)高峰，代謝產(chǎn)物主要從尿液排出。

目前，國內(nèi)還沒有人做過肌注PHA對(duì)豬血清補(bǔ)體C3、C4的影響的研究。所以本試驗(yàn)通過給豬只肌肉注射不同劑量的PHA，測(cè)定不同時(shí)期其體內(nèi)補(bǔ)體C3、C4的含量，并進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從而判定給豬只肌注PHA來增強(qiáng)機(jī)體免疫力的最適劑量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 本次試驗(yàn)所選用30頭豬都由瀘西縣藍(lán)天種豬場(chǎng)提供。所選豬只均為65日齡，體重為17~25kg。試驗(yàn)前對(duì)豬進(jìn)行預(yù)防接種疫苗，并確定所選豬均屬健康。試驗(yàn)前、后均按正常方式飼養(yǎng)，環(huán)境、飼料不變。

1.2.2 試驗(yàn)藥物 植物凝集素(1mg/ml)，由云南師范大學(xué)生命科學(xué)院提取。

1.2.3 試驗(yàn)器材及試劑 檸檬酸鈉真空采血管，江西格蘭斯醫(yī)療器械有限公司，生產(chǎn)批號(hào)081009；半自動(dòng)生化分析儀，華儀器 L-3280，V1.06.0808，儀器序列號(hào)：SHB10604044；離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn)型號(hào)LD4-2A。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組 選擇的健康豬只30頭，按年齡體重相近似原則對(duì)其分組，分成5個(gè)組，每組為6頭并將其編號(hào)。對(duì)照組為01~06號(hào)肌注0.8mg/kg的生理鹽水、低劑量組為07~12號(hào)肌注PHA的劑量為0.4mg/kg、中劑量組為13~18號(hào)肌注PHA的劑量為0.8mg/kg、高劑量組為19~24號(hào)肌注PHA的劑量為1.2mg/kg、超高劑量組為25~30號(hào)肌注PHA的劑量為1.6mg/kg。肌注部位為：豬耳后3~5cm處。各試驗(yàn)豬均按正常管理。間隔1周和2周對(duì)各組豬只采血分析。

1.2.2 血樣的采集和處理 試驗(yàn)期為2周，在注射后的第1、7、14d分別采血取樣。用注射器從各豬只的耳靜脈抽取3ml全血，放入檸檬酸鈉真空采血管中保存，于離心機(jī)中離心，以4000r/min離心30min，分離血清，取上層血清移入各試劑杯中。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo) 待測(cè)血清做生化指標(biāo)檢測(cè)。用半自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)待測(cè)血清，主要檢測(cè)補(bǔ)體C3、C4濃度。

1.2.4 檢測(cè)方法 采用免疫比濁測(cè)定法。其基本原理是：抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)反應(yīng)液中保持抗體過量時(shí)，形成的復(fù)合物隨抗原量增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增加，與一系列的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，即可計(jì)算出受檢物的含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件。全部數(shù)據(jù)采用平均值對(duì)比(圖表比較)和F檢驗(yàn)與q檢驗(yàn)(結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。標(biāo)準(zhǔn)差用α表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)得每頭豬的補(bǔ)體C3、C4水平的數(shù)據(jù)見表1。由表1資料總結(jié)出表2和表3并作出折線圖1。從表3中明顯可見中劑量組的PHA對(duì)豬只免疫增強(qiáng)有非常好的效果，補(bǔ)體C3、C4水平達(dá)到了高峰，第14天與第1、7天相比補(bǔ)體C3、C4有顯著提高(P<0.05)。

表1 不同時(shí)期補(bǔ)體C3、C4的含量 (mg/L)

從表1可見，每1頭豬所在不同時(shí)期測(cè)出的補(bǔ)體C3、C4的量有所不同。

表2 不同時(shí)期補(bǔ)體C3、C4平均數(shù)比較 (mg/L)

對(duì)照組 低劑量組 中劑量組 高劑量組 超高劑量組

由表1、2、3可知，與對(duì)照組相比，在給豬只注射了4個(gè)劑量組的PHA，在經(jīng)過1周時(shí)間之后，每頭豬的補(bǔ)體C3、C4都有了不同程度的提高或降低，主要原因是由不同劑量的PHA和豬個(gè)體差異所引起的。但是中劑量組呈明顯提高的趨勢(shì)，達(dá)到9.90%(C3)和9.53%(C4)的提高率，低劑量組為2.29%(C3)和2.38%(C4)，高劑量組為-1.82%(C3)和-2.81%(C4)，超高劑量組為-5.18%(C3)和-5.47%(C4)。然而在2周之后測(cè)量時(shí)，中劑量組仍保持在較高的水平，為原來的5.11%(C3)和9.11%(C4)，低劑量組有所提高為1.74%(C3)和2.43%(C4)，高劑量組和超高劑量組卻低于原來的水平，分別為-1.78%(C3)，-2.88%(C4)和-4.81(C3)和-2.76(C4)。另外，對(duì)照組補(bǔ)體C3、C4的含量也有一定的變化，但相對(duì)其它4個(gè)試驗(yàn)組，變化不明顯。

表3 補(bǔ)體C3、C4數(shù)目分析，結(jié)果用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差) (mg/L)

注：表中列數(shù)字右肩字母不同者，表示差異顯著(P<0.05)

由表3可知，對(duì)照組的C3、C4的差異不顯著(P>0.05)。相對(duì)于其它劑量組，中劑量組的PHA差異顯著(P<0.05)，而低劑量組、高劑量組和超高劑量組的差異不顯著(>0.05)。

3 討論

3.1 PHA的生物學(xué)功效 植物凝集素是利用國際先進(jìn)的超低溫冷凍技術(shù)從紅蕓豆中提取的一種物質(zhì)，由D－甘露糖、氨基酸葡萄糖酸衍生物所構(gòu)成的低聚糖輔基與蛋白質(zhì)復(fù)合物。植物凝集素對(duì)機(jī)體毒副作用小，具有刺激細(xì)胞增殖、活化，增強(qiáng)免疫低下患者的免疫功能，抑制腫瘤生長等生物學(xué)功效[1]。植物中，不僅種子中存在凝集素，根、莖、葉、皮、果實(shí)中也發(fā)現(xiàn)有凝集素。1888年俄國Dorpt大學(xué)的Stillmark首次發(fā)現(xiàn)了蓖麻凝集素。1936年Summer and Howell發(fā)現(xiàn)凝集素專一性結(jié)合糖的性質(zhì)。1960年Nowell報(bào)道了植物細(xì)胞凝集素有促進(jìn)有絲分裂的作用。1975年Becker等研究了刀豆凝集素分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)，揭開了研究植物凝集素分子空間結(jié)構(gòu)和功能的序幕[2]。植物凝集素的定義也已幾經(jīng)修正，1995年Willy J．Peumans和Els J．M．Van Damme認(rèn)為確定蛋白質(zhì)為凝集素的唯一前提條件是至少應(yīng)有一非結(jié)構(gòu)域，且其能可逆地結(jié)合到特異碳水化合物上[3]。

PHA無種屬特異性，具有協(xié)同作用或相加作用，具有明顯提高原有產(chǎn)品療效的作用，同時(shí)不干擾原產(chǎn)品的檢測(cè)，使用方便，分布廣泛，避免由于加強(qiáng)免疫引起的抗體水平過高及疫苗應(yīng)激反應(yīng)。在抗病毒方面具有廣譜、毒性小、安全范圍大等特點(diǎn)。在免疫學(xué)領(lǐng)域，植物凝集素是免疫學(xué)研究中極其重要的試劑，有著巨大的應(yīng)用前景。目前，國內(nèi)外的好多專家學(xué)者都對(duì)植物凝集素的功能做了深入的研究，認(rèn)為植物凝集素是自然界廣泛存在的一類能凝集細(xì)胞、多糖或糖復(fù)合物的非源于免疫反應(yīng)的糖蛋白，是一種有絲分裂原，主要用于激活免疫細(xì)胞即淋巴細(xì)胞。他們發(fā)現(xiàn)PHA聚酯有至少125種不同的單體結(jié)構(gòu)，并且新的單體被不斷地發(fā)現(xiàn)出來。由微生物合成的PHA有一些特殊的性能，包括生物可降解性、生物相容性、壓電性和光學(xué)活性等。另外，根據(jù)單體結(jié)構(gòu)或含量的不同，PHA的性能可從堅(jiān)硬到柔軟到彈性變化[4]。

3.2 補(bǔ)體系統(tǒng)的生物學(xué)意義 補(bǔ)體(complement,C)是存在于人和動(dòng)物新鮮血清中具有酶活性的免疫球蛋白，約占血清球蛋白總量的10%。動(dòng)物血清中的補(bǔ)體系統(tǒng)既是天然免疫的重要組成部分，又在獲得性免疫過程中發(fā)揮重要作用。19世紀(jì)末，在研究免疫溶菌和免疫溶血反應(yīng)中，認(rèn)為這種球蛋白是對(duì)抗體的溶細(xì)胞有輔助作用的物質(zhì)，因而得名補(bǔ)體。補(bǔ)體由9種成分組成，分別命名為C1、C2、C3、…、C9。其中C1又3個(gè)亞單位即C1q、C1r和C1s亞單位組成，統(tǒng)稱為補(bǔ)體系統(tǒng)。當(dāng)存在抗原抗體復(fù)合物或其它激活因子時(shí)，補(bǔ)體可以被激活。補(bǔ)體活化后在靶細(xì)胞膜上形成膜攻擊復(fù)合物，導(dǎo)致靶細(xì)胞的溶解，這一功能在動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中起重要的防御和免疫監(jiān)視作用，在抗體產(chǎn)生前可抵抗病原微生物的感染，在抗體產(chǎn)生后，起主要的殺滅微生物的作用[5]。補(bǔ)體在體內(nèi)作用很廣泛，補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的膜攻擊作用可使某些細(xì)菌溶解破壞，喪失致病力。補(bǔ)體反應(yīng)序列中所產(chǎn)生的各種中間產(chǎn)物有促進(jìn)炎癥反應(yīng)、增強(qiáng)吞噬功能，中和病毒和免疫吸附的作用。另外，補(bǔ)體還與血液凝固及蛋白質(zhì)溶解系統(tǒng)有關(guān)[6]。補(bǔ)體極不穩(wěn)定，大部分對(duì)熱敏感，56℃30min即失去活性。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，細(xì)菌性疫苗產(chǎn)生抗體后，當(dāng)同類病原體再次侵入動(dòng)物機(jī)體時(shí)，不僅動(dòng)物體內(nèi)的抗體能夠及時(shí)地對(duì)病原體進(jìn)行黏附，病原體本身和抗原抗體復(fù)合物同時(shí)激活補(bǔ)體，對(duì)侵入機(jī)體的細(xì)菌進(jìn)行殺滅清除，哺乳動(dòng)物體內(nèi)補(bǔ)體的活性和數(shù)量較高，能夠較大強(qiáng)度地殺滅細(xì)菌予以清除，保護(hù)動(dòng)物健康[7]。

補(bǔ)體系統(tǒng)參與機(jī)體的特異性和非特異性免疫機(jī)制，表現(xiàn)為抗微生物防御反應(yīng)，免疫調(diào)節(jié)及介導(dǎo)免疫病理的損傷性反應(yīng)，是機(jī)體內(nèi)一個(gè)具有重要生物學(xué)意義的效應(yīng)系統(tǒng)和效應(yīng)放大系統(tǒng)，而補(bǔ)體C3是補(bǔ)體系統(tǒng)中含量最高的成分。補(bǔ)體系統(tǒng)中補(bǔ)體C3、C4為補(bǔ)體系統(tǒng)中固有的成分，存在于體液中，補(bǔ)體C3 是補(bǔ)體激活過程中起關(guān)鍵性作用的一種成分，不論是經(jīng)典激活途徑還是替代激活途徑，均需在C3 被激活之后，才能推進(jìn)后續(xù)補(bǔ)體成分的連鎖反應(yīng)。補(bǔ)體C4 則在經(jīng)典途徑的活化階段起著重要作用[8]。補(bǔ)體C3、C4是體內(nèi)一組具有酶原活性的球蛋白，它們?cè)跈C(jī)體防御過程中可通過免疫復(fù)合作用、調(diào)理吞噬細(xì)胞等機(jī)制對(duì)病原微生物進(jìn)行清除及活化炎性細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。

3.3 PHA可提高機(jī)體免疫力 由表2和表3可知，該試驗(yàn)結(jié)果與河南農(nóng)大的郭爽等人[12]利用植物凝集素在小白鼠上所做的結(jié)果有相似之處。在本試驗(yàn)中給豬肌肉注射不同計(jì)量的PHA后，其不同程度的刺激豬機(jī)體免疫，使機(jī)體補(bǔ)體C3、C4的含量都有不同程度的變化。其中，與對(duì)照組相比，在給豬只注射了4個(gè)劑量組的PHA，在經(jīng)過1周時(shí)間之后，補(bǔ)體C3、C4都有了不同程度的提高或降低，其中中劑量組提高的最高，低劑量組稍有提高，高劑量組和超高劑量組卻有所降低。在2周之后測(cè)量時(shí)，中劑量組仍保持在較高的水平，低劑量組也保持在相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，高劑量組和超高劑量組還是低于原來的水平。試驗(yàn)結(jié)果說明，給豬只注射不同劑量的PHA之后，在一定時(shí)期內(nèi)能夠提高機(jī)體的免疫力，從而保護(hù)動(dòng)物的健康，但不同劑量PHA在對(duì)機(jī)體作用時(shí)有不同的效果，并且在注射后的不同時(shí)間，效果也不相同。

PHA可以用于激活免疫細(xì)胞，刺激機(jī)體產(chǎn)生白介素-2和干擾素，還可以刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異性抗體，激活機(jī)體的補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體是人或動(dòng)物體液中正常存在的一組與免疫有關(guān)的、具有酶原活性的球蛋白。補(bǔ)體系統(tǒng)廣泛參與機(jī)體抗微生物防御反應(yīng)以及免疫調(diào)節(jié)，也可介導(dǎo)免疫病理的損傷性反應(yīng)，是機(jī)體內(nèi)具有重要生物學(xué)意義的效應(yīng)系統(tǒng)和效應(yīng)放大系統(tǒng)。而C3、C4為補(bǔ)體系統(tǒng)中固有的成分，存在于體液中。補(bǔ)體系統(tǒng)被活化后，具有溶菌、溶細(xì)胞現(xiàn)象，并可促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬作用，還可使肥大細(xì)胞脫顆粒、釋放組織胺等。導(dǎo)致血管通透性增高、產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。有利于將殺菌因素和吞噬細(xì)胞集中到炎癥部位，將免疫復(fù)合物清除。

3.4 不同劑量的PHA免疫效果不同 給豬只注射不同劑量的PHA，在不同時(shí)期內(nèi)，機(jī)體的補(bǔ)體水平不相同，中劑量組使機(jī)體的C3、C4水平提高較高，并在2周后仍保持在相當(dāng)高的水平。低劑量組的PHA對(duì)補(bǔ)體C3、C4水平稍有升高，可能是由于PHA含量較少，雖有對(duì)機(jī)體刺激使補(bǔ)體C3、C4水平有所提高，但效果不是最明顯的。高劑量組中補(bǔ)體C3、C4下降并低于原來的水平，可能是產(chǎn)生了免疫抑制現(xiàn)象，即抑制非特異性免疫，使體液中補(bǔ)體減少，降低機(jī)體抵抗力；抑制特異性免疫，造成淋巴器官萎縮、周圍淋巴細(xì)胞減少及功能抑制、抗體形成抑制；抑制免疫監(jiān)視功能。超高劑量組中的補(bǔ)體C3、C4水平也下降了，這也可能是PHA的過量注射而產(chǎn)生了免疫抑制。其中，上述各組均有個(gè)別豬只的補(bǔ)體C3、C4在注射PHA后高于或低于原來的水平，這可能是因?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物不是標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、豬只個(gè)體水平的差異、飼養(yǎng)環(huán)境、飼料等因素所導(dǎo)致的。另外，對(duì)照組補(bǔ)體C3、C4的含量也有一定的波動(dòng)，也可能與試驗(yàn)豬個(gè)體特質(zhì)有關(guān)系，由于受外界條件因素的影響，其體內(nèi)的補(bǔ)體含量本來就不穩(wěn)定，但相對(duì)于試驗(yàn)組，其變化很明顯。

4 結(jié)論

通過該試驗(yàn)，說明對(duì)豬使用PHA可以激活機(jī)體的補(bǔ)體系統(tǒng)，尤其是刺激機(jī)體產(chǎn)生補(bǔ)體C3、C4；5個(gè)組補(bǔ)體C3、C4的量不同，說明不同劑量的PHA對(duì)豬只的補(bǔ)體系統(tǒng)刺激作用強(qiáng)度不同，其中中劑量組(0.8mg/kg)的PHA可以極大地提高機(jī)體的補(bǔ)體水平，并保持一定時(shí)間的高水平，低劑量組也有升高，而高劑量組和超高劑量組使機(jī)體的補(bǔ)體水平有所下降。在應(yīng)用PHA時(shí)，應(yīng)注意PHA的質(zhì)量，謹(jǐn)慎使用，并嚴(yán)格注意其用量，以免發(fā)生抑制免疫起不到理想的免疫效果。

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云南省高端科技人才引進(jìn)計(jì)劃項(xiàng)目子項(xiàng)目。項(xiàng)目編號(hào)：2009C1125-6。

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A

1007-1733(2011)01-0001-04

（2010–10–31）