濃縮自體骨髓復合纖維蛋白膠修復兔橈骨陳舊性骨缺損

姚旺祥，馬 安，朱六龍，陸 凱，朱 敏，彭兆祥，邊振宇，何其芳

1杭州市第一人民醫(yī)院骨科，杭州310006

2浙江省醫(yī)學科學院寄生蟲病研究所診斷室，杭州310003

3上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院骨科，上海200011

全世界每年因創(chuàng)傷、腫瘤、感染等原因造成的骨缺損患者超過80萬例，其中大段骨缺損是目前骨科臨床治療的難點之一，自體骨移植是解決該問題最理想的方法，但其供給量非常有限，且供區(qū)存在發(fā)生感染和慢性疼痛等并發(fā)癥的風險，特別是對于大段骨缺損更顯得力不從心。同種異體骨和異種骨也可用于治療大段、大塊骨缺損，但存在傳播傳染性疾病和排斥反應的缺點，因此尋找安全、有效的生物骨替代材料一直是研究的熱點。近年來，隨著組織工程學技術的進步，通過體外組織工程技術制備骨替代材料修復臨床常見的陳舊性骨缺損、骨不連受到越來越多的關注。而組織工程用種子細胞的獲取及其與材料的復合仍是研究的主要內(nèi)容。如何獲得足夠、即刻使用的種子細胞及如何使用微創(chuàng)方法修復臨床常見的骨缺損都是急需解決的問題［1］。本研究通過濃縮自體骨髓獲取骨髓基質干細胞，采用臨床廣泛使用的纖維蛋白膠 (fibrin glue，F(xiàn)G)作為支架，通過注射這一微創(chuàng)方法修復陳舊性兔橈骨缺損，并初步探討其促進成骨的機制。

材料和方法

兔橈骨陳舊性骨缺損模型的構建與實驗分組6月齡新西蘭大白兔36只，雌雄不限，體重 (2100±300)g，購自上海市第九人民醫(yī)院實驗動物中心。采用速眠新、氯胺酮和阿托品復合肌注麻醉。左前肢中段內(nèi)側切口，長約3 cm。顯露橈骨，分開尺、橈骨間膜，在距肘關節(jié)2.5 cm處完整截除帶有骨膜的橈骨1.5 cm。兩骨斷端髓腔用骨蠟封閉，分層縫合切口。術后無外固定，分籠標準飼料喂養(yǎng)，術后每天肌注青霉素40萬U 1次，連續(xù)3 d。術后1個月拍X線片檢查構建模型效果并進行手術修復。

按體重編號，從隨機數(shù)字表產(chǎn)生36個隨機數(shù)，將隨機數(shù)從小到大排列后得序號R，并規(guī)定R=1～12者為單純纖維蛋白膠組 (A組)，R=13～24者為纖維蛋白膠復合自體骨髓組 (B組)，R=25～36者為纖維蛋白膠復合濃縮自體骨髓組 (C組)，每組12只。

濃縮骨髓復合纖維蛋白膠的制作及檢測麻醉動物后，自兔雙側髂棘消毒，鋪無菌巾。雙側髂骨抽取共約10 ml骨髓。采集的骨髓經(jīng)過濾，去除脂肪、骨屑等。通過Ficoll密度梯度離心法，采用血液成分分離機 (Eppendorf Centrifuge 5417R，德國Eppendorf公司)，4℃下3500 r/min(r=8.5 cm)離心8 min，去除紅細胞、多核細胞、血清和細胞碎片，收集到2～3 ml骨髓有核細胞懸液備用。

10只動物的濃縮骨髓1 ml，取0.5 ml行血細胞計數(shù)，評價濃縮前后的有核細胞數(shù)量變化。另外0.5 ml濃縮骨髓做體外培養(yǎng)，隔日半量換液去除不貼壁細胞，9 d后對細胞集落形成單位計數(shù)，并行堿性磷酸酶染色評價其活性。

所用纖維蛋白膠由哈爾濱瀚邦醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn) ［藥品注冊證號:國藥管械 (準)字2003第3650152號］。將濃縮骨髓無菌條件下與催化液混勻，使細胞終濃度為5×106/ml，分別將等量的主體膠溶液與含有濃縮骨髓的催化劑溶液加入雙腔注射器針管中。行骨髓注射前取少許濃縮骨髓纖維蛋白膠混合物行電鏡觀察，并行細菌學培養(yǎng)及長期培養(yǎng)細胞檢驗有無致瘤性。

濃縮骨髓復合纖維蛋白膠修復陳舊性骨缺損麻醉下用11號針頭穿入左側橈骨骨缺損區(qū)，針尖多點穿刺，并剝離瘢痕組織，使之松解，以利濃縮骨髓復合物均勻滲入，推動共用的推液器使兩種溶液在雙腔注射器針頭部等量均勻混合后注射入兔橈骨缺損中，注入約2.0～2.5 ml［(10～15)×106］為C組，退出時邊退邊做輕度的前后抽動，使穿刺通道被周圍組織填充。B組每只注射自體骨髓與纖維蛋白膠的復合物，A組單純注射纖維蛋白膠。術后無外固定，分籠標準飼料喂養(yǎng)，術后每天肌注青霉素40萬U 1次，連續(xù)3 d。

放射學評價各組分別于術后4、8、12周攝X線片觀察骨缺損區(qū)新骨形成情況。(投照距離1 m，投照條件46 kV，50 mA，曝光時間0.14 s)，觀察骨缺損愈合情況。所有照片依據(jù)Yang等［2］的評分標準進行放射學評分。

組織學評價嚴密觀察新西蘭大白兔的一般情況。術后4、8、12周處死動物取標本行硬組織切片，苦味酸-品紅染色及脫鈣后石臘包埋切片，HE染色觀察成骨情況，并觀察有無異物排斥反應。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以±s表示，B、C兩組在8、12周2個時間點的評分差異用2×2析因設計方差分析，各組各時間點的差異以LSD法行多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

濃縮后細胞數(shù)量的變化濃縮后，骨髓中有核細胞數(shù)量由 (4.5±1.0)×106/ml提高至 (29.0±2.3)×106/ml，細胞集落形成單位由 (178±98)/ml濃縮至 (424±145)/ml，堿性磷酸酶染色顯示為強陽性 (圖1)。

細菌學培養(yǎng)結果及長期培養(yǎng)結果所有混合物細菌學培養(yǎng)均為陰性。長期培養(yǎng)，傳5代后均未見細胞形態(tài)、生物學性狀改變。

復合物的電鏡觀察單純纖維蛋白膠固化后在電鏡下觀察見孔隙均勻，孔孔相通，有利于細胞的營養(yǎng)交換 (圖2)。濃縮骨髓與纖維蛋白膠混合后，光鏡下見有核細胞與膠混合較均勻 (圖3);電鏡下見復合物表面布滿小孔，細胞黏附于其上 (圖4);4 h后電鏡觀察見細胞伸出偽足，與膠相容性良好 (圖5)。

圖2 纖維蛋白膠凝膠掃描 (×8500)Fig 2 Electron microscopy of the fabrin glue gelatination(×8500)

圖3 濃縮骨髓與纖維蛋白膠混合物 (×200)Fig 3 Compounds of enriched bone marrow and fibrin glue(×200)

圖4 濃縮骨髓與纖維蛋白膠混合物掃描 (×500)Fig 4 Electron microscopy of the compounds of enriched bone marrow and fibrin glue(×500)

圖5 骨髓有核細胞伸出偽足 (×2000)Fig 5 Pedes spurii of the bone marrow nucleated cells(×2000)

X線觀察術后4周，3組均未見骨缺損的修復。術后8周，C組見缺損區(qū)內(nèi)少許高密度影，兩斷端稍模糊，橈骨外部骨痂較多，缺損處內(nèi)側尺骨皮質密度增高;B組見兩斷段有新生骨向骨缺損區(qū)生長，缺損區(qū)內(nèi)側尺骨皮質旁密度稍增高。術后12周，C組骨缺損處呈均勻一致高密度影，雙側骨皮質連續(xù)，與斷端分界不清，骨缺損已塑型改造，髓腔貫通;B組亦見骨缺損的修復，骨痂較成熟，髓腔貫通不明顯。A組在觀察時間點內(nèi)均未見骨缺損的修復 (圖6)。

圖6 術后各組X線片，因骨髓、纖維蛋白膠均不顯影，故3組均表現(xiàn)為骨缺損Fig 6 X-ray of each group after operation，bone defects were equally found in three groups due to the nonvisulization of both bone marrow and fibrin glue

術后8、12周，C組的 Yang氏評分分別為(9.348±0.364)和 (12.664±0.388)分，明顯高于B組的 (7.984±0.229)分 (F=40.167，P=0.001)和 (10.584±0.836)分 (F=20.3647，P=0.004)。B組(F=36.004，P=0.001)和C組(F=155.141，P=0.000)術后12周的Yang氏評分均明顯高于術后8周。時間點與濃縮與否之間存在的交互效應差異也有統(tǒng)計學意義 (F=1.978，P=0.185)。

硬組織切片觀察術后4周，因取標本見無肉眼可見成骨，標本被軟組織及纖維蛋白膠包裹，故未行硬組織切片。HE染色在C組見部分幼稚的骨組織與大量軟骨樣組織，較多纖維蛋白膠未降解 (圖7)(纖維蛋白膠由于在制片時流失，故表現(xiàn)為組織間的空白部分);B組見少許幼稚的骨組織與部分軟骨樣組織 (圖8)。8周時硬組織切片在C組可見橈骨斷端有部分成骨，為較幼稚的骨組織，可見新生血管 (圖9);B組亦見少量較幼稚的成骨 (圖10)。12周時見C組成骨較成熟 (圖11)，骨細胞排列較整齊，髓腔及新骨中仍有少許未降解的纖維蛋白膠參雜于其中，新骨在塑型中;而B組見斷端有較多成骨 (圖12)，仍有未降解纖維蛋白膠，成骨多為黃綠色的未礦化的類骨質。A組各時間點均未見明顯成骨。

討 論

組織工程技術采用種子細胞復合支架材料，可構建即時使用的骨修復材料，為骨缺損的修復提供全新的手段，具有廣泛的應用前景［3］。Connolly等［4］采用自體骨髓注射成功治療20例脛骨骨不連，證實了自體骨髓的成骨作用。骨髓是唯一含有豐富定向性和誘導性骨祖細胞的組織，其所含有的骨髓基質干細胞誘導性或成骨活性最強［5］。Hernigou等［6］將自體骨髓通過細胞分離器濃縮后注射入脛骨萎縮性骨不連患者，證明其有效性與移植骨髓中基質細胞的數(shù)量有關，不經(jīng)濃縮處理，其基質細胞數(shù)量并不能達到治療骨不連的理想數(shù)目。

目前組織工程用種子細胞多采用體外采集培養(yǎng)擴增方法，在臨床應用時要使患者等待一段時間才能使用;且體外培養(yǎng)必須避免各種微生物的污染，對環(huán)境及實驗條件要求較高［7］。而采用濃縮自體骨髓技術獲取骨髓有核細胞，對于臨床應用而言，最大的優(yōu)勢在于即時、微創(chuàng)、有效性提高。

FG本身也是一種優(yōu)良的骨修復材料，Pei等［8］提取自體膝關節(jié)滑膜細胞與FG復合后旋轉培養(yǎng)1個月，見細胞保持原有形態(tài)，將其與材料復合后成功修復了兔股骨髁的骨軟骨缺損。Abiraman等［9］將FG包被羥基磷灰石顆粒、生物活性玻璃陶瓷和磷酸鈣硅酸鈣系統(tǒng)分別植入鼠股四頭肌，以未包被材料作為對照，結果表明FG可能有骨誘導作用。FG可以促進形成新的毛細血管及膠原沉積，這也將有利于骨形成［10］。

本研究通過使用可注射的纖維蛋白，在復合物混合均勻時即成凝膠，4h后電鏡觀察見細胞大量附著，伸出偽足，證實纖維蛋白膠與骨髓有核細胞相容性良好，為細胞提供了附著及生長所必需的支架，避免了單純骨髓注射時有核細胞濃度下降。本研究利用纖維蛋白膠形成凝膠前兩種成分 (纖維蛋白原和凝血酶)均為流體的特點，將濃縮的骨髓有核細胞作為種子細胞先加入纖維蛋白原溶液中，這使種子細胞的復合變得簡單易行，且細胞負載率高。

關于凝膠的降解問題，文獻報道一般在1周開始降解，1個月內(nèi)降解完畢，但這都是在血運豐富的組織中得到的數(shù)據(jù)［11］。本研究觀察到，1個月時見大量纖維蛋白膠未降解，被新生骨組織包繞，在2個月時仍可見未降解的纖維蛋白膠，這可能與混合物被種植于硬的骨組織之間，延緩了降解有關。纖維蛋白膠的延緩降解有利于復合的細胞及細胞因子的釋放，從而與成骨同步起來［12］。

利用Yang評分代表局部骨缺損新骨形成的量，從而達到量化，可以進行更準確的比較。本研究通過放射學方法證明，對兔橈骨骨缺損8、12周時的成骨能力而言，濃縮骨髓復合纖維蛋白膠移植組的成骨能力＞單純骨髓復合纖維蛋白膠組＞單純纖維蛋白膠組。因為組織工程骨的成骨一般需要經(jīng)過軟骨內(nèi)化骨的過程，在1個月時骨的成熟不明顯，故在4周內(nèi)3組的區(qū)別不明顯。

綜上，本研究結果證實，濃縮自體骨髓復合纖維蛋白膠可修復兔橈骨骨缺損，且具有可注射使用、體內(nèi)成形、生物相容性好等優(yōu)點，隨著研究的不斷深入，有望在骨不連、骨缺損修復領域發(fā)揮重要作用。

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圖1 堿性磷酸酶染色 (×40)Fig 1 Alkaline phosphatase staining(×40)

圖7 C組4周 (HE，×200)Fig 7 Four weeks in group C(HE， ×200)

圖8 B組4周 (HE，×200)Fig 8 Four weeks in group B(HE，×200)

圖9 C組8周 (Van Gieson，×1)Fig 9 Eight weeks in group C(van Gieson， ×1)

圖10 B組8周 (Van Gieson，×1)Fig 10 Eight weeks in group B(van Gieson， ×1)

圖11 C組12周 (Van Gieson，×1)Fig 11 Twelve weeks in group C(van Gieson， ×1)

圖12 B組12周 (Van Gieson，×1)Fig 12 Twelve weeks in group B(van Gieson， ×1)