活血顆粒質量標準研究

張志勇，李艷麗，高翔宇，劉恩荔 (山西醫(yī)科大學藥學院中藥學教研室，太原 03000;山西生物應用職業(yè)技術學院生物制藥工程系)

活血顆粒是由柴胡、白芷、白芍、穿山甲、紅花等17味藥材組成。本品具有活血化瘀、軟堅散結的功效，是治療乳癖病的常用處方。原標準僅收錄了當歸的薄層色譜鑒別，為了有效地控制藥品內在質量，確保用藥安全有效，本文對其質量標準進行了提高。根據醫(yī)療機構制劑注冊批件的要求需增加藥味總數1/3以上的薄層色譜鑒別。本文增加了白芍、柴胡、白芷、穿山甲的薄層鑒別及芍藥苷的含量測定項，一定程度上提高完善活血顆粒的質量標準。

1 材料、試劑與儀器

1.1 對照品及對照藥材 當歸對照藥材(120927－200512)、芍藥苷對照品(含量測定用，110736－200628)、熊果酸對照品(鑒別用，0742－200010)、紅花對照藥材(120907－200609)、白芷對照藥材(110717－200204)、柴胡對照藥材(0992－200102)、皂角刺對照藥材(121210－200502)、郁金對照藥材(120949－200504)、穿山甲對照藥材(121027－200403)均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 試劑 硅膠G;所用試劑均為分析純。水為去離子水。

1.3 儀器 大連伊利特高效液相色譜儀;UV200Ⅱ型可見紫外分光光度計。

2 方法與結果

2.1 白芍的薄層鑒別 供試品溶液的制備:取本品內容物10 g，加乙醇30 ml，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水15 ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 ml，合并正丁醇提取液，置水浴上濃縮至1 ml，加適量中性氧化鋁，拌勻，干燥，加在中性氧化鋁柱(100目，5 g，內徑1 cm)上，用甲醇60 ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加乙醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。

對照品溶液的制備:另取芍藥苷對照品，加乙醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。

陰性溶液的制備:按比例稱取除白芍外的其他藥味，同法制成陰性溶液。

照薄層色譜法［1］(附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇(5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。

結果:供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點，陰性無干擾(見圖1)。

圖1 白芍的薄層鑒別Fig 1 Thin layer chromatogram of Radix Paeoniae Alba

2.2 穿山甲的薄層鑒別 供試品溶液的制備:取本品內容物10 g，加三氯甲烷30 ml，加熱回流4 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷1 ml使溶解，作為供試品溶液。

對照藥材溶液的制備:取穿山甲對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。

陰性溶液的制備:按比例稱取除穿山甲外的其他藥味，同法制成陰性溶液。

照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯－丙酮(20∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以醋酐－硫酸(9∶1)的混合液，在80℃加熱數分鐘，置日光下檢視。

供試品色譜中，在對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾(見圖2)。

圖2 穿山甲的薄層鑒別Fig 2 Thin layer chromatogram of Semen Vaccariae

2.3 柴胡的薄層鑒別 供試品溶液的制備:取本品內容物10 g，加甲醇35 ml，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加2%的氫氧化鈉溶液10 ml，加熱回流30 min，放冷，加正丁醇提取3次，每次20 ml，分取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，作為供試品溶液［2］。

對照藥材溶液的制備:取柴胡對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。

陰性溶液的制備:按比例稱取除柴胡外的其他藥味，同法制成陰性溶液。

照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述溶液各5 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水(15∶5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。日光下檢視。

供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，有相同顏色的斑點，陰性無干擾(見圖3)。

圖3 柴胡的薄層鑒別Fig 3 Thin layer chromatogram of Radix Bupleuri

2.4 白芷的薄層鑒別 供試品溶液的制備:取本品內容物10 g，加乙醚30 ml，低溫回流1 h，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1 ml使溶解，作為供試品溶液。

對照藥材溶液的制備:另取白芷對照藥材0.5 g同法制成對照藥材溶液。

陰性溶液的制備:按比例稱取除白芷外的其他藥味，同法制成陰性溶液。

照薄層色譜法(附錄Ⅵ B)試驗，吸取上述溶液各8 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30－60℃)－乙醚(3∶2)為展開劑，在25℃以下展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。

供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上出現(xiàn)對應斑點，陰性無干擾(見圖4)。

圖4 白芷的薄層鑒別Fig 4 Thin layer chromatogram of Radixngelicae Dahuricae

2.5 白芍中芍藥苷的含量測定

2.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱:采用迪馬Kromasil ODS C18(250 mm×4.6 mm)。能達基線分離;檢測波長:以對照品溶液進行紫外全程掃描，可知其在230 nm處有最大吸收，參考文獻，以230 nm作為檢測波長;流動相:以甲醇－水(29∶71)作為流動相，主峰保留時間適宜，主峰與其他色譜峰分離度大于1.5。理論塔板數按芍藥苷計不得少于3 000［3－6］。

2.5.2 溶液的制備 取重量差異項下的本品，研細，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇25 ml，稱定重量，超聲處理(功率240 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用75%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

對照品溶液的制備:取芍藥苷按供試品溶液的制備方法制成對照品溶液。

陰性溶液的制備:取處方除白芍的全部藥味，按成品工藝及供試品溶液的制備方法制備空白對照品溶液。

測定法:分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各20 μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.5.3 專屬性試驗 按上述方法將供試品、對照品、陰性對照品進行測定。結果:在芍藥苷處無干擾(見圖5)。

圖5 芍藥苷HPLC圖譜Fig 5 High performance liquid chromatogram of peoniflorin

2.5.4 線性關系及線性范圍考察 精密稱取芍藥苷對照品適量，加甲醇制成61.75 μg/ml的溶液，分別精密量取1，2，3，3，5 ml至 10 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，分別進樣20 μl，測定。以峰面積積分值為縱坐標(y)，以芍藥苷進樣量為橫坐標(x)，繪制標準曲線，得芍藥苷含量測定線性關系圖?；貧w方程為y=540.7x+25.933，相關系數r=0.999 9。結果表明，芍藥苷對照品進樣量在 0.123 5－0.617 5 μg范圍內與峰面積值呈現(xiàn)良好線性關系。

2.5.5 精密度考察 取同一批號(110736－200628)的供試品，按供試品處理方法，制得供試品溶液。精密吸取20 μl，注入液相色譜儀，依法連續(xù)進樣6次，RSD=1.36%。結果表明，精密度良好。

2.5.6 重復性試驗 取同一批號的供試品，按供試品處理方法，共6份，制得供試品溶液，依法測定，計算各樣品中芍藥苷的含量。結果表明:該方法的重復性良好。

2.5.7 回收率試驗 取已知芍藥苷含量的供試品，研細，混勻，取約2.5 g，精密稱定，共6份，分別精密加入芍藥苷對照品，按照供試品溶液的制備方法制備，依法測定，并計算各樣品中芍藥苷的含量，并計算回收率，見表1。結果表明:該法具有良好的回收率。

表1 回收率測定結果Tab 1 Results of recovery test

2.5.8 白芍藥材的測定 取本品粉末約0.4 g，精密稱定，分別按照供試品溶液制備方法制備，依法測定，并計算各樣品中芍藥苷的含量，結果見表2。

表2 白芍藥材中芍藥苷含量測定結果Tab 2 Content of peoniflorin of Radix Paeoniae Alba

2.5.9 樣品測定 按正文擬定含量測定方法，分別采用3批樣品進行測定，結果見表3。

表3 3批樣品測定結果 (n=3)Tab 3 Content of peoniflorin of the samples (n=3)

參照3批樣品的含量測定結果，求得平均含量為0.65 mg/袋。以平均含量的80%作為樣品含量測定的限度，即本品含白芍按芍藥苷計，每袋不得少于 0.52 mg。

3 討論

3.1 本品中白芍、柴胡、白芷、穿山甲等均為主要藥味，方法學研究結果表明，采用薄層色譜法對白芍、柴胡、白芷、穿山甲等進行定性鑒別，薄層色譜斑點清晰、專屬性強。在進行TLC鑒別研究時，增加了相應藥材的供試品溶液，以求保證本品質量的同時，監(jiān)控投料藥材的質量，可作為中成藥TLC鑒別的一種思路，從源頭控制產品質量。

3.2 用HPLC法測定芍藥苷含量，試驗比較了多種比例的流動相，以甲醇－水(29∶71)為流動相，分離效果較佳，保留時間適宜，分離度大于1.5。該方法簡便可靠，精密度高，分離度好，可用于活血顆粒的質量控制。

［1］ 中化人民共和國藥典委員會.中國藥典(一部)［S］.2010版，北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄Ⅵ.

［2］ 賴克道，劉元，文志云，等.薄層色譜法定性鑒別小柴胡顆粒中的柴胡、甘草［J］.廣西醫(yī)學，2009，31(6):886－887.

［3］ 張海龍，崔永霞，王淑美，等.高效液相色譜法測定腦心通膠囊中芍藥苷的含量［J］.中醫(yī)學報，2010，25(1):118－119.

［4］ 李春實，韓映晨，汝秋明.益腦復健膠囊的質量標準［J］.中國藥師，2010，4(12):1738－1740.

［5］ 陳磊垚.夏菊滴鼻液質量標準的研究［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2009，18(11):1288－1289.

［6］ 康阿龍，張?zhí)K蘅，張嫻.乳癖克膠囊質量標準的研究［J］.解放軍藥學學報，2011，27(1):47－49.