鴨肝丁酰膽堿酯酶的純化與酶學性質(zhì)研究

朱 鴻，李想韻，鄧 玉，王 松，付偉麗，唐靚婷，誥趙偉，唐云明

（西南大學生命科學學院，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶市甘薯工程研究中心，重慶400715）

鴨肝丁酰膽堿酯酶的純化與酶學性質(zhì)研究

朱 鴻，李想韻，鄧 玉，王 松，付偉麗，唐靚婷，誥趙偉，唐云明*

（西南大學生命科學學院，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶市甘薯工程研究中心，重慶400715）

目的：獲得鴨肝丁酰膽堿酯酶純品并對其酶學性質(zhì)進行研究。方法：采用丙酮脫脂、酸沉淀、硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Sephacryl S-200凝膠層析方法，分離純化鴨肝丁酰膽堿酯酶；采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行純度鑒定和酶相對分子量測定。結(jié)果：從鴨肝中分離純化獲得電泳純的丁酰膽堿酯酶，純化倍數(shù)為156.45倍，酶活回收率為23.60%，比活達17.21U/mg。酶相對分子量為388.85kDa，亞基相對分子量為64.70kDa。推測該酶由六個相同亞基構(gòu)成。該酶最大紫外吸收為278nm。酶催化碘化硫代丁酰膽堿水解的最適pH為8.0，最適溫度為35℃。該酶在pH 3.0～10.0區(qū)域較穩(wěn)定；在40℃以下處理1h，酶活力保持穩(wěn)定。Zn2+、Mn2+和Cu2+對該酶具有顯著的抑制作用。以碘化丁酰硫代膽堿為底物，測定該酶的表觀Km為71.15μmol/L，沒有過量底物抑制現(xiàn)象。結(jié)論：成功分離純化獲得丁酰膽堿酯酶，該酶具有較好的酸堿耐受性。

鴨肝，丁酰膽堿酯酶，分離純化，性質(zhì)

膽堿酯酶（cholinestease，ChE）是生物體內(nèi)一種重要水解酶，一般可分為乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）和 丁 酰 膽 堿 酯 酶（butyrylcholinesterase，BChE）［1］。丁酰膽堿酯酶能與有機磷毒劑和殺蟲劑結(jié)合，并且具有比乙酰膽堿酯酶靈敏度更高的優(yōu)點，是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的重要作用靶標，它還具有能水解許多酯類、肽類及酰胺類化合物，參與某些藥物的代謝過程和促進細胞生長的特點［2-4］。Greig等人對丁酰膽堿酯酶抑制研究表明，抑制丁酰膽堿酯酶可成為治療阿爾茨海默病的新手段［5-7］。該酶在化學分析、食品安全、農(nóng)業(yè)化工、醫(yī)藥衛(wèi)生和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用。丁酰膽堿酯酶廣泛存在于動植物組織中［8］。我們發(fā)現(xiàn)，鴨肝中丁酰膽堿酯酶含量較為豐富。因此，本文以來源廣泛的鴨肝為原料，對丁酰膽堿酯酶進行分離純化和酶學性質(zhì)研究，為丁酰膽堿酯酶的進一步研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

家鴨（Anas platyrhynchos）肝臟 取自健康活鴨，殺死后立即取肝臟于-20℃冰箱中冰凍保存?zhèn)溆?；牛血清白蛋白、碘化硫代丁酰膽堿、碘化硫代乙酰膽堿、二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB） Sigma公司；DEAE-Sepharose、Sephacryl S-200、分子量標準品GE公司；三羥甲基氨基甲烷 Farco公司；蛋白質(zhì)SDS-PAGE標準品 genscript公司；考馬斯亮藍R250、丙烯酰胺、甲叉-雙丙烯酰胺 Fluka公司；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 丙酮干粉的制備 稱取新鮮鴨肝100g，用自來水洗凈，再用消毒雙蒸水清洗數(shù)次。剪碎，然后以1∶10（M∶V）的比例加入已經(jīng)-20℃預冷的丙酮，勻漿后抽濾脫脂得濾餅。兩次丙酮脫脂后將濾餅冷凍干燥至恒重，研磨成干粉備用。

1.2.2 粗提液的制備 將丙酮干粉以1∶15（M∶V）的比例加入已經(jīng)預冷的0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH8.0）。勻漿后，4℃冰箱靜置抽提2h，6000×g離心1h，收集上清液即得粗提液。

1.2.3 硫酸沉淀 粗提液加入硫酸調(diào)整pH至3.0，4℃冰箱靜置2h后，6000×g離心30min，收集上清液得粗酶液。

1.2.4 硫酸銨分級沉淀 粗酶液加入固體硫酸銨至10%飽和度，4℃冰箱靜置 2h后，6000×g離心30min，收集上清液。再加入硫酸銨至70%飽和度，4℃冰箱靜置 2h，6000×g離心 30min，沉淀用0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH8.0）溶解，4℃蒸餾水透析過夜，即得到粗酶液。

1.2.5 DEAE-Sepharose離子交換層析 DEAESepharose離子交換柱按產(chǎn)品說明書要求處理。裝柱后，用0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH8.0）平衡4個柱體積，粗酶液樣品上 DEAE-Sephrose柱（2.6× 14cm），每次上樣為10mL，用0～1.0mol/L線性梯度的NaCl溶液（內(nèi)含0.05mol/L，pH8.0的Tris-HCl緩沖液）進行梯度洗脫，流速30mL/h，每管收集5mL，紫外監(jiān)測波長為280nm。最后需測定各管丁酰膽堿酯酶活性和蛋白含量，收集活性較高的各管酶液，4℃透析過夜，冷凍濃縮后進行Sephacryl S-200凝膠層析。

1.2.6 Sephacryl S-200凝膠過濾柱層析 Sephacryl S-200凝膠柱按產(chǎn)品說明書進行裝柱（16mm× 835mm）處理后，每次上樣3mL。用Tris-HCl緩沖液（0.05mol/L，pH8.0）進行洗脫，流速18mL/h，每管收集3mL。測定每管丁酰膽堿酯酶活性和蛋白質(zhì)含量；收集活性較高的各管酶液，4℃透析，冷凍干燥，得到丁酰膽堿酯酶純品。

1.2.7 丁酰膽堿酯酶活性的測定 參照文獻［9］略有改動，以碘化硫代丁酰膽堿為底物，采用SDS終止法進行測定。在試管中加入2.55mL 0.05mol/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液、100μL 10mmol/L DTNB溶液、50μL 75mmol/L碘化硫代丁酰膽堿，混勻，37℃水浴保溫5min，加入200μL丁酰膽堿酯酶液，立即混勻，并開始計時5min，然后加入100μL 3%的SDS溶液終止反應(yīng)，室溫下在波長412nm處測定其OD值。以先加入SDS溶液，再加入酶液為對照。以每分鐘催化分解1μmol碘化硫代丁酰膽堿所需的酶量為一個酶活力單位。

1.2.8 蛋白質(zhì)含量的測定 采用lowery法［10］和分光光度法［11］，以牛血清白蛋白為標準樣品。

1.2.9 丁酰膽堿酯酶的純度鑒定 采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定［12］，分離膠濃度為12%。

1.2.10 丁酰膽堿酯酶的分子量測定 分子量測定采用凝膠過濾法［13-14］。鴨肝丁酰膽堿酯酶亞基分子量的確定采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測得［15］。

1.2.11 丁酰膽堿酯酶的動力學參數(shù)測定 用 pH 8.0，0.05mol/L Tris-HCl緩沖液配制不同濃度的底物溶液（0.05～1mmol/L），按酶活力測定方法測定相應(yīng)的酶活力，根據(jù)Lineweaver～Burk雙倒數(shù)作圖法［16］求出Km值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨肝丁酰膽堿酯酶的分離純化

鴨肝丁酰膽堿酯酶粗酶液經(jīng)DEAE-Sepharose柱層析（每管收集5mL）的洗脫圖譜如圖1所示，丁酰膽堿酯酶的活性峰集中在29～37管之間，其中31～35管酶活性最高；分別收集透析冷凍濃縮后再經(jīng)Sephacryl S-200凝膠分子篩柱層析（每管收集3mL），洗脫圖譜見圖2，丁酰膽堿酯酶的活性峰集中在23～29管之間，其中25～28管酶活性最高，分別收集透析冷凍濃縮后備用。整個純化結(jié)果見表1，最終可得到純化156.45倍，比活力為17.21U/mg的酶制劑。所得丁酰膽堿酯酶經(jīng)SDS-PAGE鑒定為單一蛋白成分，見圖3，說明該酶制劑已達到電泳純。以該純品為對象，進行鴨肝丁酰膽堿酯酶性質(zhì)研究。

圖1 DEAE-Sepharose離子交換層析圖譜

2.2 鴨肝丁酰膽堿酯酶的性質(zhì)

2.2.1 鴨肝丁酰膽堿酯酶相對分子量和亞基相對分子量 經(jīng)Sephacryl S-200凝膠柱層析法測定鴨肝丁酰膽堿酯酶的全酶相對分子量為388.85kDa。經(jīng)SDS -PAGE測定其亞基相對分子量為64.70kDa，說明鴨肝丁酰膽堿酯酶由六個相同的亞基組成。

表1 鴨肝丁酰膽堿酯酶的純化

圖2 Sephacryl S-200凝膠層析圖譜

圖3 SDS-PAGE電泳圖

2.2.2 紫外掃描鴨肝丁酰膽堿酯酶 純酶在 λ為220～360nm 之間掃描，特征峰的最大吸收 λ =278nm。

2.2.3 鴨肝丁酰膽堿酯酶的最適反應(yīng)pH pH是影響酶活的主要參數(shù)之一，在pH3.0～11.0的緩沖液中測定丁酰膽堿酯酶的酶活力，考察丁酰膽堿酯酶催化反應(yīng)的最適pH范圍。以酶活最高值為100%，對不同pH做圖，結(jié)果見圖4。由圖可見，酶的最適pH為8.0，pH在6.5～8.5的范圍內(nèi)丁酰膽堿酯酶的酶活均可達到最高酶活的50%以上，超出該范圍，酶活急劇下降。

圖4 pH對鴨肝丁酰膽堿酯酶活力的影響

2.2.4 鴨肝丁酰膽堿酯酶在不同pH下的穩(wěn)定性酶在不同pH環(huán)境下的穩(wěn)定性是酶應(yīng)用的重要指標。將純化的酶液與pH3.0～11.0的緩沖體系相混合，4℃放置24、48、72h后，取適量酶液在最佳反應(yīng)條件pH8.0時測定酶活。以酶活最高值為100%，對不同pH作圖，結(jié)果見圖5。該丁酰膽堿酯酶在所測pH范圍內(nèi)能較好地保持其酶活；72h孵育后，酶活有所降低，但仍在最高酶活的40%以上；pH3.0～10.0時，酶活均較穩(wěn)定，表明該酶的酸堿耐受性很強。

圖5 不同pH下鴨肝丁酰膽堿酯酶的儲存穩(wěn)定性

2.2.5 鴨肝丁酰膽堿酯酶的最適反應(yīng)溫度 分別測定丁酰膽堿酯酶在20～70℃下的酶活性，其他條件不變。以酶活最高值為100%，對不同溫度下酶活做圖，結(jié)果見圖6，表明該酶的最適溫度在35℃左右。

圖6 溫度對鴨肝丁酰膽堿酯酶活力的影響

2.2.6 鴨肝丁酰膽堿酯酶的熱穩(wěn)定性 酶液在4～70℃溫度下分別孵育10、30、60min后測定活性。4℃的酶活力為100%，不同孵育條件下酶的相對酶活見圖7。4、20、30℃下，酶活性穩(wěn)定，保溫60min活性保留原有活性的80%以上；40℃保溫60min酶活損失50%以上，隨著溫度的升高，酶活力迅速降低，溫度至70℃時，酶完全失活。表明該酶在40℃以下具有一定的熱穩(wěn)定性。

2.2.7 鴨肝丁酰膽堿酯酶的反應(yīng)動力學性質(zhì) 用0.05～0.6mmol/L的碘化硫代丁酰膽堿在pH8.0，35℃條件下與酶作用5min，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)［15］作圖法得圖8，求得該酶的表觀 Km和 Vm分別為71.15μmol/L和7.73mmol/L·min。

2.2.8 底物對鴨肝丁酰膽堿酯酶活力的影響 在最適反應(yīng)條件下，分別以碘化硫代丁酰膽堿和碘化硫代乙酰膽堿為底物，其他條件不變。改變反應(yīng)體系中的底物膽堿濃度（0.1～10mmol/L），測定對應(yīng)酶活力。以最高酶活為100%作圖，如圖9。發(fā)現(xiàn)當以碘化硫代乙酰膽堿為底物時，活力很難檢測。以碘化丁酰膽堿為底物，濃度較低時，該酶活力隨底物濃度增加而增加；當?shù)孜餄舛瘸^3.0mmol/L時，酶活力隨底物濃度的增加而基本不變。說明鴨肝丁酰膽堿酯酶不能有效利用碘化乙酰膽堿，以碘化丁酰膽堿為底物時，沒有底物過量抑制現(xiàn)象。

圖7 鴨肝丁酰膽堿酯酶的熱穩(wěn)定性

圖8 丁酰膽堿酯酶催化碘化硫代丁酰膽堿的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖

圖9 底物對丁酰膽堿酯酶活力的影響

2.2.9 金屬離子對鴨肝丁酰膽堿酯酶活力的影響向純化后的鴨肝丁酰膽堿酯酶酶液中分別加入不同的金屬離子，使其終濃度為10mmol/L。同時以不加金屬離子的酶液作為對照，測定丁酰膽堿酯酶的活力，結(jié)果如圖10所示。Ca2+對丁酰膽堿酯酶有激活作用，達到138.1%。Zn2+、Mn2+和Cu2+對酶有顯著的抑制作用，尤其Cu2+能完全抑制鴨肝丁酰膽堿酯酶的活力；其他離子對酶活力影響不明顯。

3 討論

酶的分離純化過程是對其展開全面應(yīng)用和研究的基礎(chǔ)，純化過程的回收率和純酶比活是衡量純化方法可行性的重要指標。本研究通過丙酮脫脂、酸沉淀、硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose陰離子交換層析和Sephacryl S-200凝膠層析方法，從鴨肝中獲得了總回收率為23.60%，純化倍數(shù)為156.45倍，比活達17.21U/mg的酶制劑，經(jīng)SDS-PAGE鑒定該酶達到電泳純，結(jié)果肯定了本實驗的分離純化方法是可行的。

圖10 不同鹽離子對丁酰膽堿酯酶活力的影響

本實驗采用酸沉淀雜蛋白的思路分離目的蛋白。利用目的蛋白在所用pH范圍內(nèi)有較強穩(wěn)定性的特性，有效去除很大一部分雜蛋白，且該方法簡便快速，目的酶活回收高，在本研究中為分離獲得高品質(zhì)丁酰膽堿酯酶打下了基礎(chǔ)。

我們發(fā)現(xiàn)，鴨肝膽堿酯酶對碘化乙酰膽堿酯酶特異性低，不能以碘化乙酰膽堿為底物，說明該膽堿酯酶可能是丁酰膽堿酯酶。早在上世紀50年代，Augustinsson［17］等人經(jīng)過全面研究發(fā)現(xiàn)，底物抑制現(xiàn)象是區(qū)別乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶的一個重要依據(jù)，本實驗結(jié)果表明鴨肝膽堿酯酶沒有過量底物抑制現(xiàn)象，為該膽堿酯酶定性為丁酰膽堿酯酶提供了有力的依據(jù)。研究所得膽堿酯酶以碘化硫代丁酰膽堿為底物時表觀 Km為71.15μmol/L，高于陳久禎［18］等人以碘化硫代乙酰膽堿為底物時測得乙酰膽堿酯酶表觀Km值44μmol/L，低于吳方輝［19］等人以碘化丁酰膽堿為底物時測得丁酰膽堿酯酶表觀Km值144μmol/L，說明本實驗純化的膽堿酯酶與碘化硫代丁酰膽堿親和性很高，能夠特異水解硫代丁酰膽堿。由于肝臟是丁酰膽堿酯酶合成和分泌的主要場所［20］，且鴨肝膽堿酯酶與丁酰膽堿親和力高，不能有效水解乙酰膽堿，沒有底物過量抑制現(xiàn)象，說明本實驗純化的鴨肝膽堿酯酶是丁酰膽堿酯酶。

金屬離子抑制研究表明，10mmol/L Zn2+、Mn2+可顯著抑制該酶活性，10mmol/L Cu2+可以完全抑制該酶活性，為該酶抑制劑的研究提供了參考。

本實驗純化的丁酰膽堿酯酶比活高于現(xiàn)市售且價格昂貴的同類產(chǎn)品，并且鴨肝丁酰膽堿酯酶具有較高的酸堿耐受性，40℃以下該酶具有較好的熱穩(wěn)定性，說明該酶具有廣泛推廣應(yīng)用的潛力。

4 結(jié)論

本研究成功地從家鴨肝臟中純化出丁酰膽堿酯酶，性質(zhì)研究表明該酶具有較高的利用價值。我國是農(nóng)業(yè)大國，家禽養(yǎng)殖遍及全國，規(guī)模大；鴨肝材料豐富，易于收集，成本低廉，是提取丁酰膽堿酯酶的可靠來源。以鴨肝為材料從中純化丁酰膽堿酯酶也成為提升家禽附加值，幫助農(nóng)民增加收入的一條新途徑。該酶在農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

［1］FournierD，Mutero A.Minireview：modification of acetylcholineterase as a mechanism of resistance to insecticides［J］.Comp Biochemphysiol，1994，108c（1）：19-311.

［2］Lockridge O.Genetic variants of human serum cholinesterase influence matabolism of the muscle relaxant succinylcholine［J］. Pharmac Ther，1990，47（1）：35-60.

［3］Mattes C E，Lynch T J，Singh A，et al.Therapeutic use of butyrylcholineaterase for cocaine intoxication［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，1997，145（2）：372-380.

［4］Alber R，Sporns O，Weikert T，et al.Cholinesterase and peanut agglutinin being related to cell proliferation and axonal growth in embryonic chick limbs［J］.Anat Embryol Berl，1994，190（5）：429-438.

［5］Greig N H，Lahiri D K，Sambamurti K.Butyrylcholinesterase：an important new target in Alzheimer’s disease therapy［J］.Int Psychogeriatrics，2002，14：77-91.

［6］Bullock R，Lane R.Executive dyscontrol in dementia with emphasis on subcortical pathology and the role of butyrylcholinesterase［J］.Curr Alzheimer Res，2007，4（3）：277-293.

［7］Kamal M A，Klein P，Yu Q S，et al.Kinetics of human serum butyrylcholinesterase and its inhibition by a novel experimental Alzheimer therapeutic，bisnorcymserine［J］.J Alzheimers Dis，2006，10（1）：43-51.

［8］魏婉麗，孫曼霽.丁酰膽堿酯酶結(jié)構(gòu)研究新進展［J］.生物化學與生物物理進展，2000，27（1）：37-40.

［9］Ellman G L，Kiane Courtney K，AndresV，et al.A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity［J］.Biochem Pharmacoogyl，1961（7）：88-95.

［10］Lowery DH.Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent［J］.J Biol Chem，1951，193-267.

［11］Layne E.Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins//Methods in Enzymology［C］.New York：Academic Press，1957，3：447.

［12］朱廣廉，楊中漢.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)分子量［J］.植物生理學通訊，1982（2）：43-47.

［13］楊安鋼.生物化學與分子生物學實驗技術(shù)［M］.北京：高等教育出版社，2001：248-252.

［14］陳石根，周潤琦.酶學［M］.上海：復旦大學出版社，2001：174-175.

［15］LaemmLi UK.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T 4［J］.Nature，1970，227：680-685.

［16］陳鈞輝，陶力，朱婉華，等.生物化學實驗［M］.北京：科學出版社，2004.

［17］AUGUSTINSSON K B.Cholinesterogy［J］.Acta Physiol Scand，1948，52：1-182.

［18］陳久禎，王惠芳，李艷軍，等.梭曼和沙林對電鰩電器官乙酰膽堿酯酶抑制作用動力學［J］.中國生物化學與分子生物學報，1998，12：790-792.

［19］吳方暉，高川，張靖，等.梭曼、沙林對鴨血清丁酰膽堿酯酶的動力學研究［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2004（6）：1058-1060.

［20］張秀明，李健齋，魏明竟，等.現(xiàn)代臨床生化檢驗學［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2001：1086.

Purification and characterization of the butyrylcholinesterase from duck liver

ZHU Hong，LI Xiang-yun，DENG Yu，WANG Song，F(xiàn)U Wei-li，TANG Liang-ting，GAO Zhao-wei，TANG Yun-ming*
（School of Life Science，Southwest University，Southwest University，Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region Ministry of Education，Chongqing Sweet Potato Engineering Research Center，Chongqing 400715，China）

Objective：To obtain butyrylcholinesterase from duck liver and study on the characterization of the purified product.Methods：The butyrylcholinesterase was extracted by acetone treatment，acid precipitation，ammonium sulfate precipitation，and ion-exchange chromatography on DEAE-Sepharose and gel filtration on Sephacryl S-200.SDS-PAGE was used to identify the purity and relative molecular of the butyrylcholinesterase.Results：The enzyme was purified to electrophoretic homogeneity.lt was purified 156.45-fold and the activity recovery 23.60% was obtained.lts specific activity was 17.21U/mg.The relative molecular weight of this butyrylcholinesterase was 388.85kDa，and the weight of subunit was 64.70kDa.The butyrylcholinesterase consisted of six identical subunits. Ultraviolet spectrum showed a maximum absorption at 278nm.The optimum pH and temperature of the enzyme for the hydrolysis of S-Butyrylthiocholine iodide were 8.0 and 35℃，respectively.The enzyme was stable in the pH ranges of 3.0～10.0 under 35℃and at temperatures below 45℃.Zn2+，Mn2+，Cu2+had significant inhibition on this enzyme and the enzyme could not be inhibited by excess substrate.The apparent Kmof this enzyme was 71.15μmol/L at pH8.0 and 35℃.Conclusion：The butyrylcholinesterase was successfully purified，and this butyrylcholinesterase showed good acid-base tolerance.

duck liver；butyrylcholinesterase；purification；characterization

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0095-05

2010-01-18 *通訊聯(lián)系人

朱鴻（1985-），男，碩士研究生，主要從事酶與酶工程研究。

重慶市科委資助項目（CSCT，2004AC1012）。