響應(yīng)面優(yōu)化γ-谷氨酰甲胺酶法合成條件的研究

李偉橋，沐萬孟，江 波，*，張 濤，繆 銘

（1.江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

響應(yīng)面優(yōu)化γ-谷氨酰甲胺酶法合成條件的研究

李偉橋1，2，沐萬孟1，江 波1，*，張 濤1，繆 銘1

（1.江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

γ-谷氨酰甲胺是一種具有降血壓功能的特殊氨基酸。利用單因素實驗及響應(yīng)面分析方法對γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶合成γ-谷氨酰甲胺的條件進行優(yōu)化，確定了最優(yōu)合成條件為：酶活力為0.5U/mL，反應(yīng)時間為5h，反應(yīng)溫度為37℃，底物L-谷氨酰胺濃度為0.34mol/L，底物甲胺和L-谷氨酰胺摩爾比為5.23，反應(yīng)pH為10.62。在此條件下，γ-谷氨酰甲胺的最大合成量為23.95g/L。

γ-谷氨酰甲胺，合成，優(yōu)化，響應(yīng)面

γ-谷氨酰甲胺（γ-Glutamylmethylamide，N-methyl-L-glutamine，GMA）是一種特殊的氨基酸，存在于多種微生物細胞和植物體中，特別是在綠茶中，是綠茶氨基酸的重要組成部分。在對GMA生理功能的研究中發(fā)現(xiàn)，其具有能夠顯著降低血壓的功能［1］。高血壓病作為現(xiàn)代社會的常見病之一，已經(jīng)嚴重威脅到人民的身體健康，GMA降血壓的特性使其在治療高血壓方面具有廣闊的應(yīng)用前景。GMA的合成包括化學法［2］和酶法。酶法合成具有選擇性高、副產(chǎn)物少和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點，是理想的途徑。目前酶法合成 GMA的途徑主要是谷氨酰胺酶（glutaminase，EC 3.5.1.2）和 γ-谷氨酰甲胺合成酶（γ-Glutamylmethylamide synthetase，EC.6.4.3.12），以谷氨酸或谷氨酰胺和甲胺為底物，在ATP（Adenosine-triphosphate，三磷酸腺苷）和金屬離子的存在下，合成 GMA［3-6］。而微生物的 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，2.3.2.4）具有相同的特性，并且用γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶能夠合成許多γ-谷氨酰類物質(zhì)［7］。在本實驗室前期的研究中，已經(jīng)利用來自枯草芽孢桿菌的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，以谷氨酰胺和甲胺為底物成功合成出GMA（論文發(fā)表中）。對GMA的合成條件優(yōu)化，在提高GMA合成效率，擴大GMA的應(yīng)用范圍方面具有重要意義。本研究以酶反應(yīng)條件影響因素為對象，利用單因素實驗法及響應(yīng)面分析方法，探索GMA合成的最佳條件，對γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶合成GMA的條件進行優(yōu)化，為提高合成GMA的產(chǎn)量和效率提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 來源于實驗室保藏菌種Bacillus subtilis SK 11.004［8］，酶活力為250U/g；GMA標樣 張家港阿拉寧生化有限公司合成；甲醇、乙腈美國TEDIA公司，色譜純；其他試劑 均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

恒溫振蕩水浴鍋 江蘇金壇億通電子有限公司；Eppendorf 5804R離心機 德國艾本德股份公司；Agilent 1200液相色譜儀 配有二極管陣列檢測器和Rev.B.03.02色譜工作站，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶反應(yīng)條件 在硼砂/氫氧化鈉的緩沖液中，依次加入L-谷氨酰胺、甲胺的水溶液和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，反應(yīng)體系中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶為0.5U/mL，總體積為20mL，置于50mL的具塞三角瓶中，150r/min下恒溫水浴振蕩反應(yīng)。

1.2.2 GMA的測定 取1mL反應(yīng)液，將樣品煮沸10min滅酶，10000r/min離心10min，吸取上清液，適當稀釋后，參照文獻方法［9］測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 GMA合成的單因素實驗分析

2.1.1 反應(yīng)時間對GMA合成的影響 在20mL的反應(yīng)體系中，酶反應(yīng)的底物濃度分別為L-谷氨酰胺0.3mol/L、甲胺1.5mol/L，反應(yīng)溫度為 37℃，pH為10.0，取反應(yīng)時間為0.5、1.5、3、4、5、6h的樣品，測定GMA的合成量，結(jié)果如圖1。

圖1 反應(yīng)時間對GMA合成的影響

由圖1可以看出，GMA的合成量隨時間的推移不斷增大，在反應(yīng)時間為5h時達到最大值，5h后略有下降。在開始階段，GMA的合成速率較大，其后逐漸變緩，趨于穩(wěn)定值。5h之后GMA的含量有所減少，這可能是因為γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶除了催化轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，還同時催化γ-谷氨酰類物質(zhì)的水解反應(yīng)［10］。

2.1.2 反應(yīng)溫度對GMA合成的影響 在20mL的反應(yīng)體系中，酶反應(yīng)底物濃度分別為 L-谷氨酰胺0.3mol/L、甲胺1.5mol/L，取反應(yīng)時間為5h，pH為10.0，測定反應(yīng)溫度分別為27、32、37、42、47℃時GMA的合成量，結(jié)果如圖2。

圖2 反應(yīng)溫度對GMA合成的影響

由圖2可以看出，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化合成GMA的反應(yīng)過程中，溫度對反應(yīng)的影響不大，最適溫度為37℃。在較低或較高的溫度下，GMA的合成量都略有減少，可能是由于低溫下，酶活力較最適宜溫度小，GMA的合成量較??；而溫度稍高情況下，同時加快了γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的水解反應(yīng)。

2.1.3 底物摩爾比率（甲胺/谷氨酰胺）對GMA合成的影響 在20mL的反應(yīng)體系中，L-谷氨酰胺濃度為0.3mol/L，分別添加甲胺濃度至 0.3、0.9、1.5、2.1、2.7mol/L，在反應(yīng)時間為5h，溫度為37℃，pH為10.0的條件下，測定不同底物摩爾比率下GMA的合成量，結(jié)果如圖3。

圖3 底物摩爾比對GMA合成的影響

由圖3可以看出，在甲胺/谷氨酰胺的摩爾比值為5時，GMA的合成量達到最大。在γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化合成GMA的反應(yīng)過程中，谷氨酰胺為供體，為了最大程度合成GMA，必須使受體的濃度大于供體濃度，但隨著受體和供體比率的不斷增大，使得供體和受體結(jié)合的幾率變小［11］，反而降低了GMA的合成量。

2.1.4 底物濃度對GMA合成的影響 在20mL的反應(yīng)體系中，在反應(yīng)時間為5h，溫度為37℃，pH為10.0的條件下，固定甲胺與L-谷氨酰胺的摩爾比為5∶1不變，調(diào)整 L-谷氨酰胺濃度至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mol/L，分別測定GMA的合成量，結(jié)果如圖4。

圖4 底物濃度對GMA合成的影響

由圖4可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著底物濃度的增加，GMA的合成量逐漸增加，在L-谷氨酰胺濃度0.3mol/L、甲胺濃度1.5mol/L時，GMA合成量達到最大。底物濃度繼續(xù)增大使得GMA的合成量反而變小，這可能是由于γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化GMA的水解，參與了L-谷氨酰胺的自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。

2.1.5 反應(yīng)pH對GMA合成的影響 在20mL的反應(yīng)體系中，酶反應(yīng)的底物濃度分別為L-谷氨酰胺0.3mol/L、甲胺1.5mol/L，取反應(yīng)時間為5h，反應(yīng)溫度為37℃，調(diào)整反應(yīng)pH分別為8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，測定不同反應(yīng)pH下GMA的合成量，結(jié)果如圖5。

由圖5可以看出，在pH11以下，GMA的合成量隨pH的升高不斷增大，當pH＞11時，GMA的合成量迅速降低。γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶催化的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)大多在偏堿性條件下進行［6］，但是在堿性過于強烈的情況下，使得酶活性大大降低，不利于轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的進行。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化GMA的合成

由單因素實驗可以看出GMA合成過程中，反應(yīng)時間為5h時GMA的合成量達到最大值，反應(yīng)溫度對GMA的合成影響不大，37℃為反應(yīng)的最適溫度。而底物摩爾比、底物濃度和反應(yīng)pH對GMA的合成影響很大，因此確定反應(yīng)時間為5h，反應(yīng)溫度為37℃，在此基礎(chǔ)上采用中心組合設(shè)計（Central Composite Design），以底物摩爾比（A）、底物濃度（B）和反應(yīng)pH（C）為自變量，GMA合成量（R1）為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面實驗。自變量水平編碼見表1，實驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

圖5 反應(yīng)pH對GMA合成的影響

表1 中心組合實驗因素水平編碼

表2 GMA合成條件的中心組合實驗設(shè)計及結(jié)果

利用Design expert?7.1軟件對實驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3（P值＜0.05為顯著項）。

通過對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到GMA合成量（R1）對自變量底物摩爾比（A）、底物濃度（B）和反應(yīng)pH（C）的回歸方程為：

方差分析顯示該模型顯著，相關(guān)系數(shù) R2= 95.76%，說明模型能夠較好地預(yù)測響應(yīng)值與自變量的關(guān)系，校正相關(guān)系數(shù)=91.95%，說明僅有約4.24%的響應(yīng)值的總變異不能用該模型表示。由表3可以看出，GMA合成反應(yīng)中的B、C、A2、B2和C2為顯著影響因素，即反應(yīng)底物濃度、pH、底物摩爾比平方項、底物濃度的平方項和pH的平方項為顯著因素。圖6～圖8分別給出了反應(yīng)的底物摩爾比與底物濃度、底物摩爾比與pH和底物濃度與pH的交互作用對GMA合成量的響應(yīng)曲面圖。

表3 中心組合實驗結(jié)果方差分析表

圖6 反應(yīng)pH為11時，底物摩爾比和底物濃度交互作用對GMA合成量的響應(yīng)曲面圖

圖7 反應(yīng)底物濃度為0.3mol/L時，底物摩爾比和pH的交互作用對GMA合成量的響應(yīng)曲面圖

圖8 反應(yīng)為底物摩爾比5時，底物濃度和pH的交互作用對GMA合成量的響應(yīng)曲面圖

對模型方程（1）求導(dǎo)，得出當R1取最大值時，A、B和C的值分別為5.23、0.34和10.62。即模型預(yù)測GMA合成最大值時，底物摩爾比為5.23，底物L-谷氨酰胺濃度為0.34mol/L，pH為10.62，此時GMA的合成為24.35g/L。按照模型預(yù)測參數(shù)，對預(yù)測值進行驗證，重復(fù)三次實驗，得到GMA合成濃度的平均值為23.95g/L，和預(yù)測值24.35g/L非常接近，說明模型能夠很好地解釋各參數(shù)對GMA合成的變化，即在酶活力為0.5U/mL的情況下，GMA合成的最佳條件為：反應(yīng)時間為5h，反應(yīng)溫度為37℃，底物L-谷氨酰胺濃度為0.34mol/L，底物甲胺和L-谷氨酰胺摩爾比為5.23，反應(yīng)pH為10.62。

3 結(jié)論

3.1 通過單因素實驗確定了γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶合成GMA的最佳條件區(qū)間，利用中心組合設(shè)計響應(yīng)面實驗進一步優(yōu)化反應(yīng)條件，確定GMA合成的模型，模型相關(guān)系數(shù)R2=95.76%，說明模型能夠較好地解釋GMA合成過程中各因素的影響。

3.2 通過對GMA合成模型的分析，得到GMA合成的最佳條件為：酶活力為0.5U/mL，反應(yīng)時間為5h，反應(yīng)溫度為37℃，底物L-谷氨酰胺濃度為0.34mol/L，底物甲胺和L-谷氨酰胺摩爾比為5.23，反應(yīng)pH為10.62。經(jīng)驗證實驗得到 GMA合成的平均值為23.95g/L，與預(yù)測值相一致。

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Optimization of enzymatic synthesis of γ-Glutamylmethylamide with response surface methodology

LI Wei-qiao1，2，MU Wan-meng1，JIANG Bo1，*，ZHANG Tao1，MIAO Ming1
（1.State Key Lab of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

γ-Glutamylmethylamide（GMA）is a unique amino acid which has effective hypotensive action.Using single-factor experiments and response surface methodology，the optimal conditions for GMA synthesis were determined.The optimal conditions were introduced as follows：enzyme activity 0.5U/mL，reaction time was 5h，temperature at 37℃，L-glutamine was 0.34mol/L，molar ratio of methylamine to L-glutamine was 5.23，pH 10.62.Under these conditions，the synthesis of GMA could reach 23.95g/L.

γ-Glutamylmethylamide；synthesis；optimization；response surface methodology

TS201.2

B

1002-0306（2011）01-0215-04

2010-09-21 *通訊聯(lián)系人

李偉橋（1980-），男，博士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室目標導(dǎo)向資助項目（SKLF-MB-200804）；江南大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室自由探索資助項目（SKLF-TS-200808）。