米糠油酶法酯化脫酸的研究

馬傳國 潘思軼 王高林 王德志

(華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院1，武漢 430070)

(河南工業(yè)大學糧油食品學院2，鄭州 450052)

米糠油酶法酯化脫酸的研究

馬傳國1，2潘思軼1王高林2王德志2

(華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院1，武漢 430070)

(河南工業(yè)大學糧油食品學院2，鄭州 450052)

通過添加單甘酯和甘油混合物，以Lipozyme TLIM為催化劑對米糠油酶法酯化脫酸進行了研究。分別考察了反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、催化劑添加量、單甘酯和甘油混合物添加量，單甘酯和甘油的比例對酸價的影響。由單因素和響應(yīng)面試驗得出酶法酯化脫酸反應(yīng)的最佳條件為溫度65℃，反應(yīng)時間9．3 h，催化劑添加量10%，單甘酯和甘油的添加量為150%，單甘酯和甘油的比例為1∶1。在此條件下酸值由原料的43．0 mg/g降至 7．2 mg/g。

米糠油 酶法酯化 脫酸

研究人員曾對米糠油化學酯化脫酸進行了研究，取得了較好的脫酸效果［1］。但是，化學酯化脫酸是在高溫條件下進行，因此，會產(chǎn)生一些不利的結(jié)果，如反應(yīng)過程中的高溫、高真空條件造成能耗較大、一定量反式酸和聚合物的產(chǎn)生等。同時對米糠油中的微量營養(yǎng)物質(zhì)也有一定破壞作用。而酶法酯化脫酸的反應(yīng)條件溫和，因此不易產(chǎn)生反式酸和聚合物，同時對米糠油中的微量營養(yǎng)物質(zhì)基本沒有破壞。但是酶法酯化脫酸最大的缺點是現(xiàn)階段酶的價格比較高，導致脫酸的成本升高。隨著生物工程技術(shù)的快速發(fā)展，酶的制造成本將會不斷降低，屆時酶法酯化將是高酸價油脂脫酸的一種優(yōu)選方法。

近年來國內(nèi)外部分學者也對高酸價油脂的酯化脫酸進行了研究，楊博等［2］利用脂肪酶做催化劑，通過添加甘油對高酸價米糠油酯化脫酸進行了研究。認為利用固定化脂肪酶對高酸價米糠油進行酯化脫酸時，不但能大大降低游離脂肪酸(FFA)的含量，滿足傳統(tǒng)精煉過程的要求，使得高酸值米糠油的精煉得以順利進行，而且脫酸的同時提高中性油含量，顯著提高了米糠油精煉的經(jīng)濟性。Sengupta R等［3］在mohua油中添加甘油，以脂肪酶做催化劑，成功地將高酸價脫膠、脫蠟mohua油中的FFA含量由24．5%降到了3．8%。Makasci A等［4］對高酸價橄欖油酶法酯化脫酸的可能性進行了驗證，并且證明了保持低壓對于移除反應(yīng)過程中生成的水分非常重要。B K De等［5］對在米糠油中添加單甘酯(MG)和甘二酯(DG)的酶法酯化和自動催化酯化脫酸進行了對比，分別得出單甘酯和甘二酯在酶法催化和自動催化酯化過程中的最佳工藝條件，發(fā)現(xiàn)甘二酯效果比單甘酯要好，原因是DG比MG更易溶于油脂中，溶解性越好與油的接觸性越好，反應(yīng)就越充分。文中還指出，酶法酯化更有利于降低FFA含量，而且酯化后產(chǎn)品的色澤較好，不皂化物含量較低。

國內(nèi)外關(guān)于高酸價油脂酶法脫酸的研究主要是通過單獨添加甘油、單甘酯或甘二酯，用生物酶做催化劑進行再酯化脫酸。本試驗主要通過添加單甘酯和甘油的混合物，以Lipozyme TLIM作為催化劑在高真空條件下，對高酸價米糠油再酯化脫酸進行研究。

1 材料與方法

1．1 材料和試劑

米糠毛油:河南省某企業(yè)提供;分子蒸餾單甘酯:廣東省中山市南方新元食品生物工程有限公司;其他試劑均為分析純。

1．2 試驗儀器

AY120型分析天平:上海路達實驗儀器有限公司;ZXZ－2型旋片式真空泵:北京中興偉業(yè)儀器有限公司;SXCL－3型數(shù)顯加熱磁力攪拌器:鞏義市英峪予華儀器廠;DF－101C型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:鞏義市英峪予華儀器廠;薄層色譜－火焰離子檢測儀Mistubishi Kagaku Iatron．有限公司;800型低速離心機:金壇市華峰儀器有限公司;WLS－2型比較測色儀:上海精密科學儀器有限公司。

1．3 試驗方法

1．3．1 原料理化指標的測定

酸價測定參照GB/T 5534—1995;皂化值測定參照 GB/T 5530—1985;水分測定參照 GB 14489．1—1993;不皂化物含量測定參照GB 5535—1985。

膠體和蠟含量測定［5］:膠體和蠟含量以4℃下丙酮不溶物的百分含量來表示。取一定量油脂按照1 g油/20 mL丙酮加入丙酮溶液，在4℃條件下保持4 h，然后用G2坩堝過濾干燥后稱量。膠體和蠟含量=(w2－w1)/w×100% ，其中w2為坩堝和過濾后剩余物的總質(zhì)量，w1為坩堝的質(zhì)量，w為所取油樣的質(zhì)量;色澤的測定按SN/T 0801．14—1999。

油脂組成分析［6］:用薄層色譜－火焰離子檢測儀(TLC－FID)定量檢測油樣中甘一酯、甘二酯、甘三酯的含量。樣品溶解在正己烷中配制成10～20 mg/mL的溶液，取1μL樣點于薄層色譜棒上，在苯/三氯甲烷/乙酸(50∶20∶0．7，體積比)溶劑體系下展開后進行儀器分析。TLC－FID操作條件:氫氣流速130 mL/min;空氣流速1 700 mL/min;掃棒速度:30 s/棒。

1．3．2 酯化反應(yīng)

在三口燒瓶中加入一定量的米糠毛油，按照比例加入單甘酯和甘油的混合物，在電熱套上加熱，使得單甘酯和甘油均勻混合在米糠油中，然后冷卻到40℃以下。將三口燒瓶置于帶攪拌的水浴中，待溫度恒定后加入一定量的Lipozyme TLIM作催化劑，連接真空冷凝裝置，進行酶法酯化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至離心筒內(nèi)，通過離心分離出Lipozyme TLIM。然后測定酯化后米糠油的酸價。

2 結(jié)果與討論

2．1 原料的理化指標

原料理化指標的測定結(jié)果見表1。

表1 原料的理化指標

2．2 單因素試驗

2．2．1 反應(yīng)溫度對反應(yīng)的影響

在反應(yīng)時間8 h、單甘酯與甘油的比例1∶1(質(zhì)量比)、單甘酯和甘油混合物的添加量150%、添加油質(zhì)量10%的Lipozyme TLIM作為催化劑，真空條件下，酸價隨溫度變化的趨勢如圖1所示。

圖1 反應(yīng)溫度對酸價的影響

由圖1可以看出，隨著溫度的升高反應(yīng)體系的酸價逐漸降低，在65℃時反應(yīng)體系的酸價降至最低點;此時隨著溫度的繼續(xù)升高，反應(yīng)體系的酸價反而開始升高，這主要是因為反應(yīng)向正反應(yīng)方向進行需要一定的能量來突破反應(yīng)能壘限制，隨著溫度的升高提供給反應(yīng)體系的能量增多，有利于反應(yīng)的進行。但是，當反應(yīng)溫度超過酶的最適反應(yīng)溫度時，部分酶開始變性失活，造成酶的催化效果降低?？紤]到酶的最佳反應(yīng)溫度選擇酶催化酯化合成的最佳溫度為65℃。

2．2．2 反應(yīng)時間對反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度65℃、單甘酯與甘油的比例1∶1、單甘酯和甘油混合物添加量150%、添加10% 的Lipozyme TLIM作為催化劑，真空條件下，酸價隨反應(yīng)時間變化的趨勢如圖2所示。

圖2 反應(yīng)時間對酸價的影響

由圖2可以看出，隨著反應(yīng)時間的延長，反應(yīng)體系的酸價不斷降低，在8 h后降低的趨勢逐漸平緩，這是因為反應(yīng)初期反應(yīng)物的濃度較大，反應(yīng)容易向正反應(yīng)方向進行，所以反應(yīng)體系酸價的降低速度較快。但是，隨著反應(yīng)時間的進一步延長，反應(yīng)體系趨于反應(yīng)平衡狀態(tài)，因此，酸價降低的趨勢逐漸平緩。考慮到隨著時間延長，能量消耗的問題選擇最佳反應(yīng)時間為8 h。

2．2．3 催化劑添加量對反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度65℃、單甘酯與甘油的比例1∶1、單甘酯和甘油混合物添加量150%、反應(yīng)時間8 h，真空條件下，酸價隨著酶添加量變化趨勢如圖3所示。

圖3 酶添加量對酸價的影響

由圖3所示，反應(yīng)體系的酸價隨著酶添加量的增加而逐漸降低，添加量在10%后反應(yīng)體系酸價降低值趨于平緩。這主要是因為隨著酶的添加量的增加，酶的催化能力逐漸增加，但是，當酶的添加量增加到一定程度時，進一步增加酶的用量，對反應(yīng)體系酸價的影響不大?？紤]成本的問題最終選擇酶的添加量為10%。

2．2．4 單甘酯和甘油混合物添加量對反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度65℃、單甘酯與甘油的比例1∶1、添加10%的Lipozyme TLIM作為催化劑、反應(yīng)時間8 h，真空條件下，酸價隨單甘酯和甘油混合物添加量變化趨勢如圖4所示。

圖4 單甘酯和甘油混合物添加量對酸價的影響

由圖4所示，隨著單甘酯和甘油混合物添加量的增加，反應(yīng)體系的酸價不斷降低，在150%以后降低的趨勢逐漸平緩，這主要是由于在一個動態(tài)平衡反應(yīng)體系中，隨著其中某一種反應(yīng)物的增加，反應(yīng)必然不斷向正反應(yīng)方向進行，但是當單甘酯和甘油混合物的量增加到一定程度時，進一步增加單甘酯和甘油混合物的量，對反應(yīng)體系酸價的影響不大。而且添加過多的單甘酯和甘油混合物時，未能參加反應(yīng)的單甘酯和甘油可能會對體系中甘三酯、甘二酯和甘一酯含量產(chǎn)生一定影響。因此綜合考慮各方面的因素選擇單甘酯和甘油混合物添加量為150%。

2．2．5 單甘酯和甘油比例對反應(yīng)的影響

在反應(yīng)溫度65℃、單甘酯和甘油混合物添加量150%、添加10% 的Lipozyme TLIM作為催化劑、反應(yīng)時間8 h，真空條件下，酸價隨單甘酯與甘油比例變化的趨勢見圖5。

圖5 單甘酯和甘油的比例對酸價的影響

由圖5所示，隨著單甘酯與甘油比例的減小，反應(yīng)體系的酸價先降低后增加，在1∶1時反應(yīng)體系的酸價達到最低。雖然單甘酯與油的互溶性比較好，但是其分子存在兩個羥基和一個酯鍵，所以在反應(yīng)過程中隨著其比例的增加會使反應(yīng)的空間位阻增大，而不利于反應(yīng)進行和體系酸價的降低。甘油分子中存在三個羥基，在與脂肪酸反應(yīng)過程中雖然其位阻較小，但是，由于其與油脂的互溶性不好，所以隨著其比例的增加，反應(yīng)速率降低，體系的酸價反而升高。從圖5亦可看出，在酶法催化酯化的過程中單甘酯和甘油比例對于反應(yīng)體系酸價的影響不大，因此選擇單甘酯與甘油的比例為1∶1。

2．3 響應(yīng)面分析試驗

根據(jù)以上的單因素試驗結(jié)果在單甘酯與甘油比例為1∶1的條件下選擇反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、催化劑添加量、單甘酯和甘油混合添加量4個因素，做4因素3水平響應(yīng)面試驗。因素水平見表2，試驗結(jié)果與極差分析見表3和表4。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平表

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果表

表4 回歸模型方差分析表

由表4可知，模型是顯著的(P＜0．000 1)，回歸模型的決定系數(shù)R2為0．993 6，說明該模型的擬合度較好，可用此模型對酯化反應(yīng)體系的酸價進行分析和預測。經(jīng)回歸擬合后，試驗因素對響應(yīng)值的影響可用回歸方程表示為:Y=7．53 － 1．35A － 1．90B － 2．75C －1．85D+2．50A2+1．05B2+1．85C2+0．80D2+0．31AB －0．46AC －0．39AD+0．36BC+0．19BD －0．99CD

利用design－expert 6．0軟件對表3數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，所得到得二次回歸方程的響應(yīng)面見圖6～圖11。

由圖6可以看出，在65～70℃區(qū)間內(nèi)，隨著溫度的升高，反應(yīng)體系的酸價也逐漸升高，但此時若在6～8 h區(qū)間內(nèi)增加反應(yīng)的時間，反應(yīng)體系的酸價逐漸降低。而在8～10 h區(qū)間內(nèi)，增加反應(yīng)時間，反應(yīng)體系的酸價呈上升趨勢，這主要是因為在此溫度區(qū)間內(nèi)隨著反應(yīng)時間的延長，變性的酶的量就會增加，導致酶的催化能力下降而使反應(yīng)體系的酸價升高。由此可以得出，在65～70℃區(qū)間內(nèi)隨著溫度的升高相應(yīng)的減少反應(yīng)時間，有利于反應(yīng)體系酸價的降低。

由圖7可以看出在67．5～70℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高，反應(yīng)體系的酸價增加。但是此時若增加酶的添加量，就可以保證反應(yīng)體系的酸價繼續(xù)降低。因為在這個溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高只有部分酶變性，而隨著酶的添加量的增加，未變性的酶的量也相應(yīng)增加。因此在這個溫度區(qū)間內(nèi)隨著溫度的升高，酶添加量也應(yīng)該有相應(yīng)的增加;相反在這個區(qū)間內(nèi)隨著溫度的降低，酶添加量也可以相應(yīng)降低。

由圖8可以看出，隨著反應(yīng)溫度的升高，反應(yīng)體系的酸價先降低后升高;隨著單甘酯和甘油混合物添加量增加，反應(yīng)體系的酸價不斷降低，但添加過多單甘酯和甘油混合物對終產(chǎn)品中的甘三酯組成會產(chǎn)生一定影響。由此可以看出在一定反應(yīng)溫度的條件下，增加單甘酯和甘油混合物添加量，有利于反應(yīng)體系酸價的降低。

圖8 反應(yīng)溫度和單甘酯和甘油混合物添加量的交互作用

由圖9可以看出，隨著反應(yīng)時間的增加，反應(yīng)體系的酸價不斷降低，但是在一定的攪拌條件下，隨著酶添加量的增加，反應(yīng)體系中的反應(yīng)物與酶的接觸機會加大，會加速反應(yīng)的進行，從而相應(yīng)縮短反應(yīng)時間;反過來隨著酶添加量的減少，反應(yīng)體系中的反應(yīng)物與酶的接觸機會減小，這就會延緩反應(yīng)的進行，從而相應(yīng)增加反應(yīng)時間。

圖9 酶添加量和反應(yīng)時間的交互作用

由圖10可以看出，在一定反應(yīng)時間條件下，隨著單甘酯和甘油混合物添加量的增加，反應(yīng)體系酸價不斷降低，但降低趨勢非常平緩，因此可知在一定反應(yīng)時間條件下通過增加單甘酯和甘油混合物添加量可以降低反應(yīng)體系的酸價。但單甘酯和甘油混合物添加量對反應(yīng)體系酸價的影響比較弱，而且具有一定的限度。同樣在一定單甘酯和甘油混合物添加量的條件下，隨著反應(yīng)時間的延長，反應(yīng)體系的酸價不斷降低，降低的趨勢也較平緩，說明在單甘酯和甘油混合物添加量一定的條件下，可以通過增加反應(yīng)時間，來降低反應(yīng)體系酸價，但是這種影響也較弱，而且有一定的限度。

在反應(yīng)體系中酶與反應(yīng)體系中一定量FFA的接觸機率是一定的。由圖11可以看出在反應(yīng)體系中，反應(yīng)物FFA的量是一定的，因此其與一定量酶的接觸機會也是一定的。而隨著單甘酯和甘油混合物添加量的增加，單甘酯和甘油與酶的接觸機率增大，有利于反應(yīng)的進行，因此當增加單甘酯和甘油混合物添加量時酶的添加量就可以相應(yīng)的減少;反過來，隨著酶的添加量的增加，單甘酯和甘油混合物與酶之間的接觸機率也會增大，有利于反應(yīng)的進行，因此當增加酶的添加量時單甘酯和甘油混合物添加量也可以相應(yīng)的減少。

由表5可以看出預測方案四的反應(yīng)溫度65℃;反應(yīng)時間9 h;酶的添加量是10%(油質(zhì)量);單甘酯和甘油混合物的添加量是144%，與單因素試驗結(jié)果比較接近。在單甘酯和甘油比例1∶1的條件下采用方案四進行驗證試驗，最終得到驗證試驗的酸價為7．2 mg/g與預測值比較接近。因此綜合響應(yīng)面分析和驗證實驗結(jié)果確定其為酶法酯交換最佳方案。

表5 試驗預測方案表

3 結(jié)論

由試驗的結(jié)果可見，利用單甘酯和甘油做酯化劑，Lipozyme TLIM作為催化劑對高酸價米糠油進行酶法酯化脫酸是可行的。由單因素和響應(yīng)面試驗得出，米糠油酶法酯化脫酸的最佳條件為反應(yīng)溫度65℃;反應(yīng)時間9．3 h;酶的添加量10%(油質(zhì)量);單甘酯和甘油混合物的添加量150%;單甘酯和甘油的比例為1∶1。在此優(yōu)化條件下做驗證試驗得出反應(yīng)體系的酸價為7．2 mgKOH/g。酯化后米糠油中甘三酯(TG)含量為70．2%，DG含量為24．2%，MG含量為1．2%;酯化后米糠油的色澤為黃35紅6．0;酯化后米糠油的過氧化值為9．1 mmol/kg。

［1］馬傳國，王高林，王德志．米糠油化學酯化脫酸的研究［J］．中國油脂，2008，33(12):36 －39

［2］楊博，楊繼國，王永華，等．米糠油酶法酯化脫酸的研究［J］．中國油脂，2005(7):22 －24

［3］R sengupa，D K Bhattacharyya．A comparative between biorefining combined with other processes and physical refining of high － acid mohua oil［J］．Journal of the American of Chemist＇s society，1992，69:1146 － 1149

［4］Makasci A，Arisoy K，Telefoncu A．Deacidification of high acid olive oil by immobilized lipase［J］．Turkish Journal of Chemistry，1996，20:258 －264

［5］B K De，D K Bhattacharyya．Deacidification of high － acid rice bran oil by reesterification with monoglyceride［J］．Jour-nal of the American of Chemist＇s society，1999，76:1243 － 1246

［6］孫曉洋，畢艷蘭，楊國龍．代可可脂、類可可脂、天然可可脂的組成及性質(zhì)分析［J］．中國油脂，2007，32(10):38－42．

Deacidification of Rice Bran Oil by Enzymatic Esterification

Ma Chuanguo1，2Pan Siyi1Wang Gaolin2Wang Dezhi2

(College of Food Science ＆ Technology，Huazhong Agricultural University1，Wuhan 430070)
(College of Grain，Oil＆ Food，Henan University of Technology2，Zhengzhou 450052)

Deacidification of rice bran oil by enzymatic esterification with addition of monoglyceride and glycerol blends was studied．Lipozyme TLIM was used as the reaction catalyst．The effects of reaction temperature，reaction time，catalyst dosage，addition amount of monoglyceride and glycerol blends and the ratio of monoglyceride to glycerol were examined through single － factor tests and response surface experiments．Results:The optimal esterification conditions are reaction temperature 65 ℃，reaction time 9．3 h，catalyst dosage 10%，addition of monoglyceride and glycerol blends 150%，and the ratio of monoglyceride to glycerol 1∶1 ．Under the optimal conditions，the acid value of the rice bran oil decreases from 43．0 to 7．2 mg/g．

rice bran oil，enzymatic esterification，deacidification

TS22

A

1003－0174(2011)03－0041－07

863計劃(2010AA101506)

2010－03－16

馬傳國，男，1966年出生，博士，食品科學與工程

潘思軼，男，1965年出生，教授，博士生導師，食品科學與工程