纖維素酶法水解大豆異黃酮糖苷研究

錢麗麗 左 鋒 張永忠

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319)(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院 國(guó)家教育部大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，哈爾濱 150030)

纖維素酶法水解大豆異黃酮糖苷研究

錢麗麗1左 鋒1張永忠2

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院1，大慶 163319)(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院 國(guó)家教育部大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，哈爾濱 150030)

為了提高大豆異黃酮的生物活性作用，獲得更多的大豆異黃酮苷元成分，對(duì)纖維素酶水解大豆異黃酮進(jìn)行了研究，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，酶水解的影響因素主要為水解溫度、水解時(shí)間、酶－底物質(zhì)量比和酶水解pH值。得到纖維素酶制備大豆異黃酮苷元的較優(yōu)工藝條件:纖維素酶水解時(shí)間17 h，水解溫度48．5℃，水解pH值5．0，酶－底物質(zhì)量比為1．05%。通過(guò)小試試驗(yàn)，以脫脂豆粕原料進(jìn)行提取大豆異黃酮，纖維素酶水解得到苷元產(chǎn)品收率為0．1%，總苷元質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30．79%;以30%大豆異黃酮粉為原料進(jìn)行水解，獲得產(chǎn)品收率為10．2%，總苷元質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47．81%。

纖維素酶 染料木黃酮 黃豆苷元

近年來(lái)，流行病理學(xué)與動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究表明大豆異黃酮苷元(主要是染料木黃酮和黃豆苷元［1］)具有弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性和抗真菌活性，能有效地預(yù)防和抑制白血病、骨質(zhì)疏松、胃癌、乳腺癌和前列腺癌等多種疾病的發(fā)生，尤其是對(duì)乳腺癌和前列腺癌有積極的預(yù)防和治療作用［2］。對(duì)大豆異黃酮進(jìn)一步深入研究還表明，大豆異黃酮對(duì)清除體內(nèi)自由基［3］、延緩機(jī)體衰老、預(yù)防和治療由紫外線照射引起的皮膚老化和各種皮膚癌也具有很好的療效［4］。大豆中的大豆異黃酮主要以糖苷形式存在，大豆異黃酮苷元含量甚少，僅占總異黃酮質(zhì)量的2%～3%，目前近5年國(guó)內(nèi)工藝研究主要集中在獲得更多苷元形式的大豆異黃酮的加工技術(shù)上，由糖苷型到苷元型大豆異黃酮的轉(zhuǎn)化方式有酸水解法、堿水解法、Smith降解和酶法，最為可行的是酶法水解制備大豆異黃酮苷元，研究較多用β－葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷鍵。孫艷梅等［5］自制了大豆β－葡萄糖苷酶經(jīng)純化后水解大豆異黃酮糖苷效果較好。許晶［6］采用里氏木霉β－葡萄糖苷酶在反應(yīng)溫度50℃、水解時(shí)間90 min、pH 4．5、加酶量20 U 的條件下水解染料木黃酮水解率為99%。對(duì)其他酶的研究還未見(jiàn)報(bào)道。試驗(yàn)采用工業(yè)化用酶纖維素酶對(duì)水解大豆異黃酮的條件進(jìn)行探索，根據(jù)纖維素酶水解糖苷鍵的原理，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)酶法水解獲得最佳水解工藝。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器設(shè)備

黃豆苷(Daidzin簡(jiǎn)寫D)、黃豆苷元(Daidzein簡(jiǎn)寫為De)、染料木苷(Genistin簡(jiǎn)寫為G)、染料木黃酮(Genistein簡(jiǎn)寫為Ge):Sigma公司。纖維素酶:諾奧科技發(fā)展有限公司(經(jīng)測(cè)定酶活力38 000 U/mg)。豆粕(東農(nóng)32):東北農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)送。30%大豆異黃酮粉:哈高科。試驗(yàn)所用甲醇為色譜級(jí)，其余試劑為分析純。

CX－500型超聲波清洗機(jī):北京醫(yī)療設(shè)備二廠;LG10－2．4A型高速離心機(jī):北京醫(yī)用離心機(jī)廠;H．H．S 21－2R型電熱恒溫水浴鍋:上海醫(yī)療器械五廠;ZFQ85A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海醫(yī)械專機(jī)廠;P680戴安高效液相色譜儀:美國(guó)戴安公司。

1．2 方法

1．2．1 大豆異黃酮含量測(cè)定

高效液相分析條件:

流動(dòng)相:甲醇∶0．5%乙酸 =40∶60，色譜柱:Nova－Pak C18(3．9 ×150 mm)，柱溫:50℃，流速:1．0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm，進(jìn)樣量:10 μL。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品染料木黃酮、黃豆苷元、染料木苷和黃豆苷各自性質(zhì)不同，經(jīng)紫外檢測(cè)器測(cè)定，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品比較，以保留時(shí)間定性、峰面積定量、外標(biāo)法計(jì)算。

纖維素酶水解制得大豆異黃酮苷元得率的測(cè)定:

大豆異黃酮苷元得率=水解前后大豆異黃酮苷元含量差/水解后大豆異黃酮總含量×100%

1．2．2 大豆異黃酮提取液的制備

試驗(yàn)采用脫脂豆粕作為原料，稱量脫脂豆粕(過(guò)40目篩)1．0 g，80%乙醇浸提劑10 mL，60 ℃水浴振蕩3 h，調(diào)等電點(diǎn) pH 4．5，3 000 r/min 離心10 min，上清液為大豆異黃酮提取液。

1．2．3 纖維素酶水解糖苷型大豆異黃酮為苷元型大豆異黃酮的工藝路線

用纖維素酶在適合條件下進(jìn)行大豆異黃酮酶水解的研究，以酶水解后大豆異黃酮苷元含量增加為指標(biāo)判定酶的選擇依據(jù)，纖維素酶水解工藝如下:

大豆異黃酮提取液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去乙醇→加入醋酸鹽緩沖液→纖維素酶解→酶滅活→冷卻→乙酸乙酯萃取→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去乙酸乙酯→丙酮溶解→離心→上清液→蒸去丙酮→乙醇溶解定容→膜過(guò)濾→HPLC測(cè)定大豆異黃酮各組分含量。

以下試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果以平均值進(jìn)行計(jì)算。

1．2．4 纖維素酶單因素試驗(yàn)

1．2．4．1 時(shí)間對(duì)酶水解得率的影響

取1．0 g脫脂豆粕加入15 mL 80%乙醇60℃下水浴振蕩提取3 h，2次提取，離心后合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，醋酸－醋酸鈉溶液調(diào)pH至5．0的緩沖液100 mL，加酶－底物質(zhì)量比為1．0%，同時(shí)做空白樣(即不加酶只加底物看豆粕自身水解情況)，在50 ℃下分別水浴振蕩水解4、8、12、16、20 h 經(jīng) HPLC檢測(cè)以苷元水解得率為指標(biāo)，確定最佳水解時(shí)間。

1．2．4．2 溫度對(duì)酶水解得率的影響

取1．0 g脫脂豆粕加入15 mL 80%乙醇60℃下水浴振蕩提取3 h，2次提取，離心后合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，醋酸－醋酸鈉溶液調(diào)pH至5．0緩沖液100 mL，加酶－底物質(zhì)量比為1．0%。分別在45、50、55、60℃下水浴振蕩水解8 h。經(jīng)HPLC檢測(cè)以苷元水解得率為指標(biāo)，確定最佳水解溫度。

1．2．4．3 pH 對(duì)酶水解得率的影響

取1．0 g脫脂豆粕加入15 mL 80%乙醇60℃下水浴振蕩提取3 h，2次提取，離心后合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，分別用醋酸－醋酸鈉溶液調(diào)pH至4．0、4．5、5．0 和 5．5 緩沖液各 100 mL，加酶 － 底物質(zhì)量比為1．0%，在50℃下水浴振蕩水解8 h。經(jīng)HPLC檢測(cè)以苷元水解得率為指標(biāo)，確定最佳水解pH。

1．2．4．4 不同酶－底物質(zhì)量比對(duì)酶水解得率的影響

取1．0 g脫脂豆粕加入15 mL 80%乙醇60℃下水浴振蕩提取3 h，2次提取，離心后合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，醋酸－醋酸鈉溶液調(diào)pH至5．0緩沖液100 mL，分別加酶－底物質(zhì)量比為0．6%、0．8%、1．0%、1．2%、1．4%，同時(shí)做空白樣(即不加酶只加底物看豆粕自身水解情況)，分別在50℃下水浴振蕩水解8 h。經(jīng)HPLC檢測(cè)以苷元水解得率為指標(biāo)，確定最佳酶－底物質(zhì)量比。

1．2．5 纖維素酶正交試驗(yàn)確定酶水解條件

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2．1 纖維素酶單因素試驗(yàn)

2．1．1 不同酶－底物質(zhì)量比對(duì)大豆異黃酮苷元水解得率的影響

由圖1可知，隨著添加纖維素酶－底物質(zhì)量比不斷增加，苷元水解得率也不斷迅速增加，當(dāng)增加到1．0%時(shí)大豆異黃酮苷元水解得率較高。

圖1 纖維素酶酶－底物質(zhì)量比對(duì)大豆異黃酮苷元水解得率的影響

2．1．2 時(shí)間對(duì)大豆異黃酮苷元水解得率的影響

由圖2可知，纖維素酶水解時(shí)間隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，苷元水解得率增加，達(dá)到一定時(shí)間以后，水解得率上升緩慢，纖維素酶水解時(shí)間為16 h時(shí)有較優(yōu)水解得率。

圖2 纖維素酶水解時(shí)間對(duì)大豆異黃酮苷元水解得率的影響

2．1．3 pH對(duì)大豆異黃酮苷元水解得率的影響

由圖3可以看出，pH對(duì)酶活力影響較大，不同的pH環(huán)境內(nèi)，大豆異黃酮苷元水解程度有很大差異，當(dāng)pH為4．0時(shí)，大豆異黃酮苷元水解得率只有20%，而當(dāng)pH為5．0時(shí)大豆異黃酮苷元水解得率增加一倍，其總水解苷元得率可達(dá)到近45%。

圖3 pH對(duì)大豆異黃酮苷元水解得率的影響

2．1．4 溫度對(duì)大豆異黃酮苷元水解得率的影響

由圖4可以看出，溫度對(duì)纖維素酶水解得率影響較前面幾個(gè)因素較小，當(dāng)溫度在50℃時(shí)有較高苷元水解得率。

圖4 溫度對(duì)大豆異黃酮苷元水解得率的影響

2．2 纖維素酶正交試驗(yàn)

由表2可以看出影響纖維素酶水解效率的主次因素依次為B＞A＞D＞C。表明溫度和水解時(shí)間是影響糖苷型大豆異黃酮水解的主要因素，而酶－底物質(zhì)量比和pH是次要因素。最佳水解條件為A3B1C2D3，即纖維素酶水解時(shí)間17 h，水解溫度48．5℃，水解pH 5．0，酶 －底物質(zhì)量比為1．05%。

表2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

2．3 纖維素酶水解制備富含苷元大豆異黃酮粉

利用上述較優(yōu)條件進(jìn)行富含苷元的大豆異黃酮粉，采用豆粕和30%含量的大豆異黃酮粉為原料，進(jìn)行纖維素酶水解，多次萃取，回收溶劑干燥后得到富含苷元的大豆異黃酮。經(jīng)HPLC檢測(cè)苷元含量及收率見(jiàn)下表3。水解前后樣品色譜圖見(jiàn)圖5、圖6。

表3 纖維素酶法制備大豆異黃酮苷元

由表3可計(jì)算出5 g含量30%的大豆異黃酮經(jīng)纖維素酶水解后可得到黃豆苷元177 mg，染料木黃酮67 mg;10 g脫脂豆粕經(jīng)纖維素酶水解可得到黃豆苷元 1．07 mg，染料木黃酮 3．9mg。

由圖5、圖6可見(jiàn)，由峰出現(xiàn)的先后順序檢測(cè)物質(zhì)依次為:溶劑峰、黃豆苷D(5 min)、染料木苷G(8 min)、丙二?；S豆苷MD(15 min)、丙二酰基染料木苷MG(25 min)、黃豆苷元De(23 min)、染料木黃酮Ge(40 min)，水解后黃豆苷元De和染料木黃酮Ge峰明顯增加，黃豆苷和染料木苷峰明顯減小，說(shuō)明纖維素酶水解糖苷鍵效果明顯。

3 結(jié)論

試驗(yàn)是通過(guò)尋找工業(yè)化酶制備富含苷元的大豆異黃酮中，初步確認(rèn)纖維素酶能夠水解制備大豆異黃酮苷元，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出采用纖維素酶水解糖苷形式大豆異黃酮為苷元形式大豆異黃酮較優(yōu)條件為:水解時(shí)間17 h，水解溫度48．5℃，水解pH 5．0，酶－底物質(zhì)量比為1．05%。通過(guò)以脫脂豆粕原料進(jìn)行提取大豆異黃酮，纖維素酶水解得到苷元產(chǎn)品收率為 0．1%，總苷元質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30．79%;30%大豆異黃酮粉獲得產(chǎn)品收率為10．2%，總苷元質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47．81%。

［1］張永忠，孫艷梅．大豆異黃酮研究中的名詞術(shù)語(yǔ)［J］．中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2004，(4):46 －49

［2］Kritz Silverstein D，Goodman Gruen D L．Usual dietary isoflavone intake，bone mineral density，and bone metabolism in Postmenopausal Women［J］．Womens Health Gend．Based Med．2002，11(1):69 －78

［3］Ghosh P，F(xiàn)enner G P．Improved method for gas chromatographic analysis of genistein and daidzein from soybean(glycine max)seeds［J］．Agric．Food Chem，1999，47(9):3455 －3456

［4］Wang G，Kuan S．A simplified HPLC method for the determination of phytoestrogens in soybean and its processed products［J］．Agric．Food Chem．，1990，38:185 －190

［5］孫艷梅，張永忠．大豆β－葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷的研究［J］．中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2006，21(2):86－89

［6］許晶，孫艷梅．里氏木霉β－葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷的工藝研究［J］．中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2009，24(3):31 －34．

Hydrolysis of Soybean Isoflavone Glucosides by Cellulase

Qian Lili1Zuo Feng1Zhang Yongzhong2

(College of Food Science，August－ first Land Reclaim University1，Daqing 163319)
(College of Science，ScienceNortheast AgricultureUniversity，Key Laboratory of Soybean Biology of National Ministry of Education2，Harbin 150030)

For increasing the biological activity of soybean isoflavones and producing aglycon from soybean isoflavones，soybean isoflavones hydrolysis by cellulase was studied．The single factor experiment and orthogonal experiment revealed that the affecting factors during the enzymatic hydrolysis of soybean isoflavones were hydrolysis temperature，time，enzyme dosage and pH，and the following best conditions of the enzymatic hydrolysis were obtained:enzymatic hydrolysis time 17 h，temperature 48．5 ℃，pH 5．0，and enzyme dosage 1．05%．Taking isoflavones extracted from defatted soybean meal as raw material to be hydrolyzed by cellulase，the yield of aglycon was 0．1%，the total aglycon content of product was 30．79%．Taking 30%isoflavones meal as material，the aglycon yield was 10．2%，and product aglycon content was 47．81%．

cellulase，genistein，aglycon

TS218

A

1003－0174(2011)03－0016－04

黑龍江省“十一五”重大科技攻關(guān)專項(xiàng)大豆綜合加工關(guān)鍵技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)(GA06B402－4)

2010－02－26

錢麗麗，女，1979年出生，講師，天然保健功能因子開(kāi)發(fā)

張永忠，男，1953年出生，教授，研究生導(dǎo)師，食品化學(xué)