葛花異黃酮提取工藝及其防醉功效的研究

盧 堃，杜先鋒

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥230036）

葛花異黃酮提取工藝及其防醉功效的研究

盧 堃，杜先鋒*

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥230036）

以單因素實驗考察了浸提時間、浸提溫度、固液比、乙醇濃度四因素對葛花異黃酮提取率的影響。通過正交實驗確定了最佳工藝參數(shù)為：70%乙醇溶液，固液比1∶15，75℃水浴中浸提2h。以小鼠為實驗對象，通過毒理學(xué)實驗和防醉功效的研究，證明葛花異黃酮無毒性且可以顯著提高酒后小鼠血清中乙醇脫氫酶（ADH）活力，從而加速酒精在體內(nèi)的分解代謝。

葛花，異黃酮，提取工藝，防醉功效

葛花為豆科葛藤植物野葛或干葛藤的干燥花蕾，又名葛條花，是我國的傳統(tǒng)藥物[1]。性味甘涼，具有解酒醒脾的功效，主治傷酒發(fā)熱煩渴、不思飲食、嘔逆吐酸、吐血、腸風(fēng)下血等癥[2]。其主要功效成分為異黃酮類和皂苷類化合物[3]，經(jīng)研究表明，這兩類化合物可分別在免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)揮協(xié)調(diào)作用，它們共同作用可以改善酒精引起的新陳代謝異常狀況[4-5]。本文對葛花中異黃酮的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了葛花異黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)，并對其防醉作用進(jìn)行了初步研究[6]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干葛花 購于霍山黃何葛業(yè)；56°北京紅星二鍋頭 北京紅星股份有限公司；實驗動物 昆明種小白鼠，體重20～22g，購于安醫(yī)大實驗動物中心；血清（漿）乙醇脫氫酶（ADH）試劑盒 南京建成生物工程研究所第一分所；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物制品檢定所；無水乙醇 分析純，哈爾濱市化工試劑廠。

HX-200A型高速中藥粉碎機(jī) 浙江省永康市溪岸五金藥具廠；MA110型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE52AA 上海亞榮生化儀器廠；0PD-8噴霧干燥機(jī) 上海大川原干燥設(shè)備有限公司；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；unicUV-2102C型紫外分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司；TD5A-WS臺式低速離心機(jī)。

1.2 實驗方法

1.2.1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制 稱取葛根素標(biāo)準(zhǔn)品5.00mg于10mL小燒杯中，加入適量的95%乙醇溶液充分溶解。將溶液移入25mL容量瓶中，再以適量同樣的乙醇洗滌燒杯幾次，并全部移入容量瓶中，加95%乙醇定容至刻度并搖勻；依次吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分別置于5個10mL容量瓶中，95%的乙醇補(bǔ)足1.0mL。加蒸餾水稀釋定容至刻度，搖勻。同時取95%乙醇1.0mL，用蒸餾水稀釋至10mL，作為空白對照，在250nm波長紫外線下分別測定吸光度[7]。分析數(shù)據(jù)，得到吸光度與葛根素濃度的線性關(guān)系式，繪制葛根素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（如圖1）。最小二乘法的吸光值Y對葛根素濃度X（mg/mL）的回歸方程為Y=75.425X-0.0339（R2=0.9997）。

圖1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)品對照曲線

1.2.2 葛花異黃酮含量的測定

1.2.2.1 實驗步驟 葛花→粉碎→過篩→溶劑加熱回流提取→離心20min→吸取上清液測定其250nm吸光度值

1.2.2.2 測定方法 吸取過濾后葛花提取液上清液5mL置于25mL容量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，搖勻；吸取1mL溶液置于10mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋定容至刻度，搖勻；以95%乙醇1mL作為空白對照，于250nm波長紫外光下測定吸光度，然后由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測葛花提取液中異黃酮濃度，再計算異黃酮的提取率。

葛花異黃酮提取率（mg/g）=（C×V）/m

式中：C：葛花提取液異黃酮濃度（mg/mL）；V：待測提取液的體積（mL）；m：干葛花粉的質(zhì)量（g）。

1.2.3 葛花異黃酮最佳提取條件的優(yōu)化 以浸提溫度、料液比、浸提時間、乙醇濃度為因素，做單因素實驗，然后按表1做L9（34）正交實驗，以異黃酮提取率為指標(biāo)，優(yōu)化葛花異黃酮的最佳提取條件。

表1 葛花異黃酮提取因素水平表

1.2.4 防醉藥效的初步研究

總體來說，這一時期河南省宗教工作，注重引導(dǎo)宗教界自我革新，充分完成了宗教界的革新需求，全面堅持貫徹了國家的宗教政策，依法加強(qiáng)對宗教事務(wù)的管理，擴(kuò)大了愛國統(tǒng)一戰(zhàn)線。同時，客觀地講，這一時期的宗教工作也存在著一些問題，如有些地方在反帝愛國運(yùn)動中，對爭取天主教虔誠教徒和神職人員方面，缺乏全面正確的認(rèn)識，要求過高過急，對他們實行諷刺打擊，從而造成了先進(jìn)與后進(jìn)分子的對立情況。又如部分工作人員對于宗教工作的長期性、復(fù)雜性、艱苦性認(rèn)識不足，在工作取得初步成效后產(chǎn)生了自滿情緒與麻痹思想，但自1953年起，這些現(xiàn)象已經(jīng)受到重視，并得到了糾正。

1.2.4.1 樣品制備 葛花→粉碎→過篩→溶劑加熱回流提取→離心20min→濃縮→噴霧干燥→將粉末配制成相應(yīng)濃度，待用

1.2.4.2 急性毒性實驗 選取體重為20g左右的小鼠20只，雌雄各半，分為4組，每組5只，每只小鼠每次灌胃0.3g/mL的樣品0.5mL，每d三次，間隔時間6h。給藥1d，連續(xù)觀察7d，觀察小鼠是否有異常反應(yīng)[8]。

1.2.4.3 飲酒量的確定 體重為20g左右的小鼠20只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組5只，每組分別按比例（酒量∶體重）灌胃飲用56°北京紅星二鍋頭白酒0.1、0.15、0.2、0.25mL/10g，觀察小鼠醉酒及死亡情況。小鼠醉酒與否以翻正反射消失作為指標(biāo)，即將小鼠背面向下輕放在動物籠內(nèi)，若仰臥姿勢保持在30s以上，則認(rèn)為翻正反射消失。

1.2.4.4 小白鼠血藥飽和 小白鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，分別灌胃超純水，濃度為0.09、0.18、 0.45g/mL的樣液0.5mL，每d定時一次，連續(xù)灌胃3d，使小白鼠達(dá)到血藥飽和，第3d灌胃前給小鼠禁食不禁水12h。

1.2.4.5 防醉藥效實驗 防醉藥效實驗即先灌胃藥物再灌胃飲用酒。在第3d給藥后，隔1h后按比例灌胃56°北京紅星二鍋頭，觀察小鼠反應(yīng)。2h后每組隨機(jī)抽取雌雄各3只，眼球取血，按照乙醇脫氫酶（ADH）試劑盒的檢測方法測定血清中乙醇脫氫酶的活力[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 異黃酮提取工藝的優(yōu)化

2.1.1 單因素實驗

圖2 浸提溫度對葛花異黃酮提取率的影響

由圖2可以看出，隨浸提溫度升高，樣品異黃酮的提取率增大。另外，溫度高，擴(kuò)散系數(shù)增大，使浸提的速度加快，但是溫度過高會導(dǎo)致黃酮結(jié)構(gòu)的破壞，使其部分被氧化變性，由圖2可知，在大于70℃后葛花異黃酮的提取率開始降低。

2.1.1.2 固液比對提取率的影響 稱取一定量的葛花粉碎樣，其他的提取條件不變，浸提溫度70℃，再根據(jù)不同的固液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）加入70%乙醇溶液，研究不同的固液比對浸提效果的影響，結(jié)果如圖3。

圖3 固液比對葛花異黃酮提取率的影響

由圖3可知，固液比過低，原料中的異黃酮在介質(zhì)中達(dá)到溶解平衡后，原料中剩余的異黃酮將不能繼續(xù)溶出，提取率較低。隨著浸提固液比的增加，葛花黃酮的提取率也隨之提高。溶劑量增大，會直接影響到葛花異黃酮有效成分從原料內(nèi)部向外部的擴(kuò)散過程。當(dāng)固液比超過1∶10時，提取率提高并不顯著。

2.1.1.3 浸提時間對提取率的影響 稱取一定量的葛花粉碎樣，其他的提取條件不變，70%濃度乙醇，浸提溫度70℃，分別設(shè)置提取時間為0.5、l、1.5、2、3h，研究不同的浸提時間對提取效果的影響，結(jié)果如圖4。

圖4 浸提時間對葛花異黃酮提取率的影響

由圖4可以看出，在相同提取條件下，隨浸提時間的增加，葛花異黃酮的提取率也隨之提高。但是時間超過1.5h后，提取率增大不明顯。其原因可能在于葛花異黃酮比較容易浸出，而質(zhì)地疏松，蛋白質(zhì)含量少，所以溶劑也易于滲入。這就導(dǎo)致超過1.5h后，葛花細(xì)胞內(nèi)外溶劑濃度己逐漸達(dá)到平衡。另外，由于黃酮類物質(zhì)本身易被氧化破壞，加熱回流時間過長，可能不利于其母核的穩(wěn)定性，會造成葛花異黃酮的部分降解，所以提取率在浸提時間過長時，提取率增加得不是特別明顯。

2.1.1.4 溶劑中乙醇體積濃度對提取率的影響 實驗設(shè)置50%、60%、70%、80%、90%五個乙醇濃度水平，固液比1∶10，在70℃水浴加熱回流浸提1.5h。其他提取條件不變，比較乙醇濃度對浸提效果的影響，結(jié)果如圖5。

圖5 溶劑中乙醇體積濃度對葛花異黃酮提取率的影響

由圖5可以看出，用較低濃度乙醇溶液提取時，浸出物的葛花粉碎樣品總異黃酮含量較低，雜質(zhì)較多。當(dāng)使用60%、70%的乙醇溶液浸提時，葛根總黃酮的提取率較高，當(dāng)乙醇濃度在70%時，其提取率為9.615mg/g。其原因是非黃酮類物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖類會在較高濃度的乙醇中部分沉淀而分離除去，因此提取率會隨乙醇濃度的增大而提高。當(dāng)使用80%濃度以上乙醇溶液時，提取率反而降低，其可能的原因是乙醇濃度高會導(dǎo)致脂質(zhì)類物質(zhì)溶解量加大，而水溶性的物質(zhì)溶解量減少，葛花總黃酮的含量相對減小。

2.1.2 正交實驗 按表1進(jìn)行正交實驗，結(jié)果見表2。

由表2可以得出，四個因素的主次順序為A>B>D> C，通過對四個因素均值的分析，確定最佳提取工藝為A2B3C2D2，即用70%的乙醇溶液，固液比1∶15，在75℃水浴回流浸提2.5h為葛花提取的最優(yōu)方案。另外依據(jù)單因素實驗中得出的結(jié)果，以及在實際的生產(chǎn)過程中出于對能耗的考慮，可以適當(dāng)?shù)慕档徒釙r間，故選擇浸提時間為2h。

表2 L9（34）正交實驗結(jié)果表

2.1.3 葛花異黃酮含量測定 依據(jù)上述單因素和正交實驗選出最佳浸提條件，即葛花粉末用70%的乙醇溶液，固液比1∶15，在75℃水浴回流浸提2h為葛花提取的最優(yōu)方案。根據(jù)此條件進(jìn)行三組平行驗證實驗，最終所得葛花異黃酮提取率為9.853mg/g。

2.2 動物實驗結(jié)果

2.2.1 急性毒理學(xué)實驗結(jié)果 受試小鼠都沒有異常反應(yīng)，小鼠毛色光潔，飲食、活動和兩便正常，鼻、眼、口腔無異常分泌物，未出現(xiàn)不良情況，也沒有死亡情況。得到小鼠對本藥物的最大耐受量≥22.5g/kg。

2.2.2 小鼠飲酒量的確定 結(jié)果顯示，0.2mL/10g以上劑量組即有小鼠發(fā)生急性酒精中毒死亡，而0.15mL/10g劑量組小鼠翻正反射消失，使小鼠呈現(xiàn)醉酒狀態(tài)而又無小鼠死亡，所以本實驗選用0.15mL/10g為飲用酒量。

2.2.3 灌胃相同濃度樣品的雌雄小鼠血乙醇脫氫酶活力平均值比較 對小鼠取血后，依照血清乙醇脫氫酶（ADH）試劑盒的檢測方法測定小鼠血清中ADH活力，分別計算灌胃不同濃度樣品的雌雄小鼠血乙醇脫氫酶活力的平均值，如圖6。

圖6 雌雄小鼠血乙醇脫氫酶活力平均值比較

由圖6可知，小鼠血清乙醇脫氫酶活力隨著樣液濃度的增大而遞增，說明樣液可以顯著提高醉酒小鼠血清中ADH的活力，從而起到解酒的效果。雌鼠和雄鼠血清ADH變化線基本呈平行狀態(tài)，說明樣液對雌雄作用并沒有太大差異。

3 結(jié)論

通過單因素實驗和正交實驗得到葛花異黃酮最佳提取工藝，即以70%乙醇，浸提溫度75℃，固液比為1∶ 15，回流提取2h，葛花異黃酮的提取率最高。但因乙醇浸提對動物實驗有干擾，所以動物實驗采用的是超純水浸提。通過毒性實驗和防醉藥效實驗表明，葛花異黃酮沒有毒性，且具有明顯增大小鼠血清中乙醇脫氫酶活力的作用，從而可以加速酒精在人體的分解代謝。

[1]尹俊亭，仲英，孫敬勇，等.葛花化學(xué)成分的研究（I）[J].中草藥，2006，37（3）：350-352.

[2]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1963：270-271.

[3]張淑萍，張尊聽.野葛花異黃酮化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17（5）：595-597.

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[5]Lee H W，Choo M K，Bea E A，et al.β-Glucuro nidase inhibitor tectorigenin isolated from the flower of pueraria thunber giana protects carbon tetrachloride-induced liver injury[J].Liver 1nt，2003，23：221-226.

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[7]李海濤.葛根有效成分的提取工藝及其解酒功效的研究[D].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[8]王珮珮，張玉，王凱平.當(dāng)歸多糖鐵小鼠口服的急性毒性研究[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29（4）：271-272.

Study on extracting process of isoflavone from the flowers of Pueraria Lobata and its preventing alcoholism function

LU Kun,DU Xian-feng*
（College of Tea&Food Science and Technology,Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

The effect of time，temperature，rate of solid to liquid，consistency of solvent on extraction rate of isoflavone from the flowers of Pueraria Lobata was studied.The best optimized extracting p1rocess were chosen by the orthogonal test:70%alcohol，the rate of solid to liquid was 1∶15，refluxing extracted 2h in 75℃water bath. Based on the toxicology and preventing alcoholism function experiments，the isoflavone of flowers of Pueraria Lobata has been proved no toxicity and can improve ADH vitality of mice's blood serum.Thus，the catabolism of alcohol in vivo was quickened.

flowers of Pueraria Lobata；isoflavone；extracting process；preventing alcoholism

TS201.2

B

1002-0306（2011）10-0364-04

2010-10-28 *通訊聯(lián)系人

盧堃（1986-），女，在讀碩士研究生，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。