響應(yīng)面法優(yōu)化楊梅渣中槲皮素提取工藝的研究

韓 強(qiáng)，陳 衛(wèi)，葉立斌，勵(lì)建榮，2，*

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310035；2.渤海大學(xué)，遼寧錦州121013）

響應(yīng)面法優(yōu)化楊梅渣中槲皮素提取工藝的研究

韓 強(qiáng)1，陳 衛(wèi)1，葉立斌1，勵(lì)建榮1，2，*

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310035；2.渤海大學(xué)，遼寧錦州121013）

采用超聲輔助提取的方法，通過單因素結(jié)合響應(yīng)面分析，對(duì)楊梅渣活性成分槲皮素的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合(Box-Benhnken)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，以槲皮素提取率為響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析。結(jié)果表明，楊梅渣中槲皮素的最佳提取工藝為：提取時(shí)間33.5min，超聲功率為254.6W，乙醇濃度為62.32%，料液比1∶20，槲皮素提取率為3.82mg/100g，與模型預(yù)測(cè)值基本相符。

超聲輔助提取，楊梅渣，槲皮素，響應(yīng)面分析法

圖1 槲皮素的分子結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

楊梅渣 由浙江海通食品集團(tuán)股份有限公司提供；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品 購自上海博蘊(yùn)生物科技有限公司，HPLC純度95%以上；分析用甲酸、乙腈、乙醇 均為色譜純，F(xiàn)isher公司；提取用乙醇 工業(yè)純。

Agilent 1100高效液相色譜儀 Agilent公司；Auto Science AS7240AT超聲波清洗儀 寧波海曙金達(dá)超聲波設(shè)備有限公司；高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液的配制 精確稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品12.5mg，用無水乙醇定容至25mL，得到濃度為0.5mg/mL的槲皮素母液，從中分別取0.12、0.10、0.08、0.06、0.04、0.02mL至5mL容量瓶中，用無水乙醇定容，得到濃度分別為12.0、10.0、8.0、6.0、4.0、2.0μg/mL的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 楊梅渣提取液的制備 準(zhǔn)確稱取5g楊梅渣粉末于250mL三角燒瓶中，加入一定濃度（v/v）的乙醇在料液比1∶20，一定溫度下，超聲波提取一定時(shí)間，趁熱減壓抽濾，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中定容，0.45μm濾膜過濾后作為待測(cè)液。

1.2.3 HPLC測(cè)定槲皮素含量 參考國(guó)家藥典中槲皮素的測(cè)定方法[9]，稍作修改。色譜柱：Sunfire C18柱；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：378nm；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：20μL；以峰面積外標(biāo)法定量。流動(dòng)相A:體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸；流動(dòng)相B：100%乙腈溶液。洗脫程序：0～5min，0%B；5～10min，20%B；10～15min，40%B；15～25min，60%B；25～30min，70%B。

楊梅渣提取液定容后，過0.45μm濾膜，參照標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定的HPLC條件，計(jì)算溶液中槲皮素含量。

得率（mg/100g）=[（C×V）/m]×100

式中：C—總槲皮素含量（mg/mL）；V—定容后樣品液的體積（mL）；m—稱取樣品的質(zhì)量（g）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)；采用Origin 8.0與Design Expert 7.1.1軟件繪制分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線

在此色譜條件下，供試品色譜中槲皮素色譜峰保留時(shí)間與相應(yīng)對(duì)照品一致，見圖2。

圖2為槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的HPLC圖譜，采用HPLC面積積分法繪制槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），回歸方程y=78394x-2.3155，R2=0.9999。可以看出，槲皮素在2.0～12.0μg/mL之間線性關(guān)系良好。用外標(biāo)法計(jì)算樣品質(zhì)量濃度，從而得出槲皮素的提取率。

2.2 提取槲皮素單因素實(shí)驗(yàn)

圖2 槲皮素對(duì)照品與提取液HPLC色譜圖注：A為槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品；B為樣品。

圖3 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線

影響楊梅渣槲皮素提取的因素很多，主要包括提取功率、提取溫度、提取時(shí)間和乙醇濃度。在進(jìn)行RSM分析前，先通過單因素實(shí)驗(yàn)來選取實(shí)驗(yàn)因素與水平。

2.2.1 提取功率對(duì)槲皮素得率的影響 固定乙醇濃度為60%，提取溫度為60℃，提取時(shí)間為30min，料液比1∶20，研究提取功率對(duì)槲皮素提取率的影響，提取功率梯度設(shè)定為：56、112、168、224、280W，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取功率對(duì)槲皮素提取率的影響

由圖4可見，在相同超聲提取條件下，功率的大小對(duì)槲皮素的提取率有顯著的影響。功率越高，槲皮素提取率越高，兩者呈線性正相關(guān)關(guān)系。功率越大，萃取時(shí)料液擴(kuò)散速度越快，并且對(duì)楊梅渣細(xì)胞的破壞作用越大，越有利于槲皮素浸出。當(dāng)功率大于224W時(shí)，進(jìn)一步增大提取功率，槲皮素提取率增加不明顯，此時(shí)槲皮素分子的溶解和擴(kuò)散基本達(dá)到平衡[10]。另外，功率過大，提取溫度會(huì)發(fā)生較大波動(dòng)，過大的能量產(chǎn)生的瞬間高溫往往會(huì)使槲皮素化合物分解或部分分解。從升溫速率、節(jié)能和安全角度考慮，采用224W進(jìn)行提取比較恰當(dāng)。

2.2.2 提取溫度對(duì)槲皮素得率的影響 固定提取功率224W，乙醇濃度為60%，提取時(shí)間為30min，料液比1∶20，研究溫度對(duì)槲皮素提取率的影響，提取溫度梯度設(shè)定為：20、30、40、50、60、70℃，結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取溫度對(duì)槲皮素提取率的影響

由圖5可知，在40～60℃溫度范圍內(nèi)，隨提取溫度升高，槲皮素得率顯著增加，進(jìn)一步提高提取溫度，槲皮素得率增長(zhǎng)則不明顯。在低于60℃時(shí)，由于溫度的提高增加了溶劑分子和溶質(zhì)分子的動(dòng)能，促進(jìn)擴(kuò)散作用的進(jìn)行，從而使槲皮素的提取率迅速增加[11]；在60℃后，槲皮素得率趨于平衡，表明已經(jīng)基本浸出?？紤]高溫對(duì)槲皮素的結(jié)構(gòu)和性能還會(huì)產(chǎn)生其他的影響，初步推測(cè)比較合適的提取溫度應(yīng)該在60℃左右。

2.2.3 超聲提取時(shí)間對(duì)槲皮素得率的影響 固定提取功率224W，乙醇濃度為60%，提取溫度為60℃，料液比1∶20，研究提取時(shí)間對(duì)槲皮素提取率的影響，超聲提取時(shí)間梯度設(shè)定為：10、20、30、40、50、60、70min，結(jié)果如圖6所示。

圖6 提取時(shí)間對(duì)槲皮素取率的影響

由圖6可知，10～30min之間，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，槲皮素得率不斷增加，30min以后趨于平緩。這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間超聲處理，槲皮素在溶液中的濃度不斷上升，并伴有少量膠體溶出，使得系統(tǒng)中黏度增加，阻礙槲皮素溶出，而導(dǎo)致槲皮素的得率趨于平穩(wěn)，由此推測(cè)30min為較佳的提取時(shí)間。

2.2.4 乙醇濃度對(duì)槲皮素得率的影響 固定超聲功率224W，提取溫度為60℃，提取時(shí)間為30min，料液比1∶20，研究乙醇濃度對(duì)槲皮素提取率的影響，乙醇濃度梯度設(shè)定為：0%、20%、40%、60%、80%、100%，結(jié)果如圖7所示。

圖7 乙醇濃度對(duì)槲皮素提取率的影響

由圖7可知，乙醇濃度在0%～60%時(shí)槲皮素提取率明顯增加，繼續(xù)增加乙醇濃度至80%，提取率基本不變；而當(dāng)乙醇濃度在80%以后，受溶液極性的影響，提取率隨著乙醇濃度的增加反而下降。這可能是因?yàn)殡S著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，溶于乙醇中的黃酮類化合物溶出量增加，提取率隨之提高，直至達(dá)到槲皮素溶出最佳極性。隨乙醇濃度的進(jìn)一步增加，溶液極性降低，反而不利于槲皮素的溶出，從而使得槲皮素的提取率降低[12]。由此我們確定了乙醇最佳提取濃度為60%。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化楊梅渣中槲皮素的提取工藝

2.3.1 分析因素的選取及分析方案 根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合2.2單因素實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，在提取溫度60℃，料液比1∶20條件下，選取對(duì)槲皮素提取率影響較明顯的提取時(shí)間、超聲功率和乙醇濃度這3個(gè)因素，采用三因素三水平響應(yīng)面分析方法分析超聲輔助提取最佳工藝條件，實(shí)驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表1，結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果

2.3.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn) 由于各因素對(duì)槲皮素提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，為了更明確各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件V9.0 RSREG程序，對(duì)表3中槲皮素提取率實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得回歸方程：

當(dāng)“Prob＜F”值小于0.05級(jí)表示該指標(biāo)顯著，從表3的分析結(jié)果來看，整體模型的“Prob＞F”值略大于0.001，表明該二次方程模型比較顯著?；貧w方差分析顯著性檢驗(yàn)表明，該模型回歸顯著，并且失擬項(xiàng)不顯著，說明方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合較好[13]。各因素及因素的一次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響顯著程度為B＞BC＞AC＞C＞A＞AB。

表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表

2.3.3 因素間的交互影響 借助Design Expert軟件依回歸方程式來繪制響應(yīng)面圖，見圖8～圖10。

2.3.3.1 提取時(shí)間與超聲功率的交互作用 由圖8可知，當(dāng)乙醇濃度固定在60%，在一定的提取時(shí)間條件下，隨超聲功率的增加，槲皮素提取率增加，且剛開始的時(shí)間槲皮素提取率增加速度快，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后，提取率趨于平穩(wěn)，這與單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符。當(dāng)在一定功率條件下，隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，槲皮素提取率迅速增加，影響顯著；當(dāng)超過一定功率條件時(shí)，隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，槲皮素提取率未見有上升的趨勢(shì)。由此可見，槲皮素提取的超聲功率和提取時(shí)間應(yīng)該有一定限制范圍。由等高線圖接近圓形可知，提取時(shí)間與提取功率的交互項(xiàng)作用不顯著。

圖8 超聲功率與提取時(shí)間對(duì)槲皮素得率影響的響應(yīng)面圖

2.3.3.2 提取時(shí)間與乙醇濃度的交互作用 由圖9可見，固定超聲功率為224W，在一定的提取時(shí)間條件下，隨乙醇濃度的提高，槲皮素提取率迅速增加，影響顯著；在中心點(diǎn)后，槲皮素的提取率隨著乙醇濃度提高，出現(xiàn)下降趨勢(shì)。在一定的乙醇濃度下，隨提取時(shí)間的增加，槲皮素提取率增加，但長(zhǎng)時(shí)間提取對(duì)槲皮素提取率影響不明顯。由等高線為橢圓形可知，兩者的交互作用較顯著。

圖9 乙醇濃度與提取時(shí)間對(duì)槲皮素得率影響的響應(yīng)面圖

2.3.3.3 超聲功率與乙醇濃度的交互作用 由圖10可見，固定提取時(shí)間30min，在一定的超聲功率條件下，在低乙醇濃度時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，槲皮素提取率增加；且大功率條件下，槲皮素提取率隨濃度變化速度加快。在乙醇濃度小于60%時(shí)槲皮素提取率增加較明顯，以后反而下降，此結(jié)果與前面的結(jié)論相一致。在一定的乙醇濃度條件下，隨著提取功率的增大，槲皮素提取率先升高后降低；在中心點(diǎn)附近，超聲功率對(duì)提取率的影響最為顯著。由等高線圖為橢圓形可知，兩者的交互作用顯著。

圖10 乙醇濃度與超聲功率對(duì)槲皮素得率影響的響應(yīng)面圖

2.3.4 提取工藝條件的確定 由響應(yīng)面的分析可知，回歸模型存在最大值，槲皮素提取率的最大值為3.886%。最高點(diǎn)位于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)。其A，B，C最佳點(diǎn)位于0.350，0.547，0.116，即理論最佳提取工藝為提取時(shí)間33.5min，提取溫度為60℃，提取功率為254.6W，乙醇濃度為62.32%，理論槲皮素提取率為3.88mg/100g，與模型預(yù)測(cè)值基本相符。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)RSM法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行槲皮素的提取實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作便利，槲皮素最佳提取條件為提取時(shí)間34min，提取溫度為60℃，提取功率為255W，乙醇濃度為62%，在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，槲皮素提取率分別為3.86、3.90、3.70mg/100g，與理論預(yù)測(cè)值基本相符，這說明回歸方程能夠真實(shí)地反映篩選因素對(duì)楊梅渣中槲皮素提取率的影響，對(duì)于槲皮素提取工藝的研究具有指導(dǎo)意義。

2.5 超聲輔助提取與傳統(tǒng)水提法的比較

采用超聲波輔助提取法和傳統(tǒng)水提法對(duì)楊梅渣槲皮素進(jìn)行提取，按照各自的工藝流程比較槲皮素提取率，結(jié)果見表4。

表4 超聲輔助提取與傳統(tǒng)水提法的效果比較

由表4可見，超聲輔助提取法與傳統(tǒng)水提法相比，提取時(shí)間縮短了四分之三，槲皮素產(chǎn)率提高了近一倍，這是因?yàn)槌暣龠M(jìn)了細(xì)胞壁的破碎以及槲皮素物質(zhì)的溶出和擴(kuò)散，從而使提取時(shí)間大大縮短，提取率明顯提高。

3 結(jié)論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)表明，超聲輔助提取楊梅渣中槲皮素的適宜條件為：提取時(shí)間30min，提取功率224W，提取濃度60%，提取溫度為60℃。

3.2 應(yīng)用SAS統(tǒng)計(jì)軟件V9.0 RSREG程序回歸分析確定各因素對(duì)槲皮素提取率的影響；通過嶺脊法分析得到超聲輔助提取的最佳工藝條件為：提取時(shí)間33.5min，提取功率為254.6W，乙醇濃度為62.32%，槲皮素的提取率為3.82mg/100g，與理論值基本相符。

3.3 超聲輔助法提取槲皮素與傳統(tǒng)水提法相比，具有省時(shí)、高效、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)。

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Optimization of quercetin extraction technology from Red bayberry (Myrica rubra Sieb.et Zucc)pomace using response surface methodology

HAN Qiang1,CHEN Wei1,YE Li-bin1,LI Jian-rong1,2,*
（1.College of Food Science and Biotechnology,Zhejiang Gongshang University,Hangzhou 310035，China；2.Bohai University,Jinzhou 121013,China）

Extraction technology of quercetin from Red bayberry (Myrica rubra Sieb.et Zucc)pomace was investigated.Single factor experiments were first performed using ultrasonic-assisted extraction(UAE)，then Box-Benhnken design (3 factors and 3 levels)combined with regression analysis were applied.Finally，response surface and contour were graphed with the extraction yield of quercetin as the response value. According to the above design and results，the optimal condition was obtained as follows:the extracting time was 33.5min，the extracting power was 254.6W，the ethanol concentration was 62.32%，and solid-liquid ratio 1∶20. Under this optimal condition，the yield of quercetin was 3.82mg/100g，which was almost in accordance with the predicted data.

ultrasonic-assisted extraction；Red Bayberry pomace；quercetin；response surface methodology

TS255.1

B

1002-0306（2011）10-0316-05

楊梅（Myrica rubra Sieb.et Zucc）屬于楊梅科楊梅屬，是原產(chǎn)于中國(guó)的亞熱帶果樹之一，為多年生常綠小喬木，喜溫暖濕潤(rùn)氣候，耐陰，不耐強(qiáng)烈日照。中國(guó)是楊梅的主產(chǎn)區(qū)，主要分布在北緯18～33°之間[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，楊梅藥用價(jià)值較高[2]，其果實(shí)、仁、葉、皮均可入藥，有生津止渴、和胃消食、益腎利尿及消暑等諸多功效。楊梅渣是楊梅果實(shí)在榨取汁液后留下的殘?jiān)?，屬于工業(yè)加工的下腳料。鑒于其高糖分含量，直接廢棄對(duì)環(huán)境保護(hù)會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響，研究楊梅渣的深加工，具有雙重意義。有關(guān)楊梅化學(xué)成分的研究已取得了很大進(jìn)展，研究表明楊梅果實(shí)中含有葡萄糖、果糖、維生素﹑檸檬酸、氨基酸、木脂素、花青素、槲皮素等多種生物活性成分[3]。槲皮素（Quercetin）屬黃酮類化合物[4]，廣泛存在于楊梅、蘋果、柑橘等植物的花、葉、果實(shí)中，具有降血壓、降血脂、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，清除自由基等多種生理功能[5-6]。近年來，應(yīng)用超聲技術(shù)提取植物黃酮的研究已有報(bào)道，研究表明該技術(shù)具有能耗低、效率高、不破壞有效成分的特點(diǎn)[7-8]。為了更好地開發(fā)利用楊梅資源，本文以楊梅加工的副產(chǎn)物楊梅渣為原料，基于單因素和響應(yīng)面分析法，采用超聲波輔助提取技術(shù)，優(yōu)化活性成分槲皮素的提取工藝，以期為槲皮素的提取制備以及楊梅資源的充分利用提供理論參考。

2010-09-16 *通訊聯(lián)系人

韓強(qiáng)（1985-），男，碩士研究生。

寧波市農(nóng)業(yè)攻關(guān)國(guó)際科技合作項(xiàng)目（2008C10042）；“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2006BAD27B03）。