青梅花提取物的酪氨酸酶抑制作用及機(jī)理研究

石嘉懌

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京210003）

青梅花提取物的酪氨酸酶抑制作用及機(jī)理研究

石嘉懌

（南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京210003）

目的：以青梅花為原料，探討其提取物（PF）在體外對(duì)酪氨酸酶的抑制作用及機(jī)理。方法：首先采用多巴速率氧化法體外測(cè)定PF酪氨酸酶的抑制活性，并繪制Lineweaver-Burk曲線，推斷其抑制類型。分別采用化學(xué)發(fā)光法和鐵氰化鉀還原法測(cè)定PF的清除自由基能力及還原力。結(jié)果表明：PF能顯著抑制酪氨酸酶活性，其半抑制濃度IC50為（98.89±6.34）μg/mL，抑制類型為混合型抑制。PF對(duì)酪氨酸酶的抑制作用可能與提取物中綠原酸等多酚物質(zhì)、較強(qiáng)的自由基清除能力和還原力有關(guān)。結(jié)論：PF是一種有前途的酪氨酸酶抑制劑，可應(yīng)用于果蔬等食品的加工和貯藏。

青梅花，酪氨酸酶，自由基，還原力

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青梅花 為蕭山大青梅中的大葉青（Prunus mume，‘Da Ye Qing’）品種，采自浙江杭州市蕭山區(qū)進(jìn)化鎮(zhèn)梅林，采摘后及時(shí)真空干燥（含水量在10%以下），室溫避光保存；酪氨酸酶、左旋多巴（L-DOPA） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司，生化試劑；魯米諾（luminol） 瑞士Fluka公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸（EDTA）、無水乙醇等 均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

MK3全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀 芬蘭Thermo公司；Sirius單管式化學(xué)法共檢測(cè)儀 德國(guó)Berthold Detection Systems公司；TU-1810紫外可見（UV-VIS）分光光度儀 北京普析通用儀器有限公司；FA1004型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；培養(yǎng)板，培養(yǎng)皿，離心機(jī)，電熱恒溫水浴鍋、移液槍等實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青梅花提取物的制備 青梅花原料經(jīng)干燥，用萬(wàn)能中藥粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，取1kg，用30%（v/v）乙醇，料液比=1∶10（w/v），在60～70℃回流提取2h，按同樣的條件提取2次，合并兩次的提取液，經(jīng)減壓濃縮后采用冷凍干燥得到棕色粉末狀樣品，隨后真空密封包裝，經(jīng)輻照滅菌（輻射源為60Co-γ，輻射劑量為6kGy，）后在4℃冰箱中保存，供后續(xù)研究所需，青梅花提取物記作PF。

1.2.2 青梅花提取物中多酚、黃酮含量的分析 總酚按福林酚法[5]測(cè)定，以綠原酸為標(biāo)準(zhǔn)品；黃酮參照文獻(xiàn)[6]測(cè)定，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.3 青梅花提取物對(duì)酪氨酸酶活力的影響 以多巴（L-DOPA）為底物，按Huang等[7]的方法進(jìn)行酪氨酸酶的活性測(cè)定。先將待測(cè)樣品用30%（v/v）的乙醇溶解，配成質(zhì)量濃度為1mg/mL的貯備溶液，再依次稀釋成不同濃度的樣品溶液。按表1所示，依次準(zhǔn)確吸取不同濃度的樣品溶液、0.5mol/L pH=6.8的磷酸鹽緩沖溶液、0.5mmol/L的L-DOPA溶液和0.15mg/mL的酪氨酸酶溶液，充分混勻，在37℃的水浴鍋中孵育反應(yīng)30min，然后立即測(cè)取各個(gè)試管中反應(yīng)溶液在475nm處的吸光值。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

根據(jù)酶反應(yīng)活性的定義，在一定的抑制劑濃度下，酶反應(yīng)活性表示為ACTi，在沒有抑制劑時(shí)酶反應(yīng)活性表示為ACT0，則受試樣品對(duì)酶的相對(duì)抑制率（I）可以定義為：

式中：A1、A2、A3、A4分別是1、2、3、4號(hào)反應(yīng)液的吸光值。

表1 酶活力測(cè)定中反應(yīng)液的組成（mL）

1.2.4 Fe2+-H2O2-魯米諾體系測(cè)定清除羥自由基（·OH）能力[8]利用Fe2+-H2O2-魯米諾發(fā)光體系產(chǎn)生·OH，以評(píng)價(jià)樣品·OH自由基清除能力，具體方法如下：

磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：50mmol/L，pH=7.8，并含有0.1mmol/L的EDTA。魯米諾（Luminol）溶液：先用少量的1mmol/L的NaOH熔融后，再用PBS配制成濃度為0.2mmol/L的魯米諾溶液。用水配制成1.5%的雙氧水溶液和0.6mmol/L的硫酸亞鐵溶液。

按照預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，用30%（v/v）的乙醇溶液配制成一定的適宜濃度梯度的待測(cè)樣品溶液，在發(fā)光管中先手動(dòng)進(jìn)樣50μL的樣品溶液（以加入50μL的30%（v/v）乙醇作為空白對(duì)照）和600μL的Luminol溶液，再用自動(dòng)進(jìn)樣器加入50μL雙氧水溶液和50μL的硫酸亞鐵溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，每隔6s記錄發(fā)光值，采集時(shí)間為30s，發(fā)光值由儀器所帶軟件自動(dòng)對(duì)發(fā)光曲線進(jìn)行積分得到。抑制率（I）的計(jì)算公式為：

式中：CL空白為空白的發(fā)光曲線積分面積，CL樣品為樣品組的發(fā)光曲線積分面積。

清除率為50%時(shí)的待測(cè)樣品濃度，定義為半抑制濃度（IC50）。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.2.5 鐵氰化鉀還原法測(cè)定還原力 采用Dorman等[9]的方法進(jìn)行還原力測(cè)定。在2.5mL pH=6.6的磷酸緩沖液中加入1mL待測(cè)液和1mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻后將混合物在50℃下加熱20min后，急速冷卻，加入2.5mL 10%三氯乙酸，離心分離10min。取上層清液5mL，依次加入5mL水和1mL 0.1%氯化鐵溶液，混合均勻，靜置10min后在波長(zhǎng)710nm下測(cè)定吸光值（A）。A值越大，則樣品的還原力越強(qiáng)。以待測(cè)樣品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值（A710）為縱坐標(biāo)，繪制待測(cè)樣品還原力的曲線。根據(jù)曲線的回歸方程，計(jì)算得到吸光值（A710）為0.5時(shí)的待測(cè)樣品濃度（EC50）。

2 結(jié)果與討論

2.1 青梅花提取物中主要活性成分分析

按上述方法，分別測(cè)得青梅花提取物中總酚含量為（304.8±1.1）mg/g（以綠原酸計(jì)），黃酮含量為（249.2±1.3）mg/g（以蘆丁計(jì)）；在本項(xiàng)目的前期研究中已表明，綠原酸類物質(zhì)為青梅花提取物中的主要活性成分，經(jīng)HPLC方法測(cè)得其中綠原酸（CA）的含量為（26.76±0.04）μg/g[10]，所以在后續(xù)活性的研究中均將青梅花提取物（PF）和綠原酸（CA）進(jìn)行了比較。

2.2 青梅花提取物對(duì)蘑菇酪氨酸酶活力的影響

圖1 青梅花提取物與綠原酸對(duì)酪氨酸酶的抑制率

2.2.1 青梅花提取物對(duì)蘑菇酪氨酸酶活力的影響 據(jù)報(bào)道綠原酸（CA）對(duì)酪氨酸酶有較好的抑制作用[11]，本研究的結(jié)果同樣表明青梅花提取物（PF）和綠原酸（CA）對(duì)蘑菇酪氨酸酶都具有明顯的抑制作用，在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴效應(yīng)關(guān)系，即抑制率隨著樣品濃度的增大而增大。由樣品的抑制曲線求得PF、CA對(duì)蘑菇酪氨酸酶的半抑制濃度（IC50）分別為（98.89±6.34）、（180.47±6.74）μg/mL（見圖1）。值得注意的是，按照IC50判斷，青梅花提取物（PF）對(duì)酪氨酸酶的抑制效果要強(qiáng)于純的綠原酸（CA）。

2.2.2 青梅花提取物（PF）對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制類型 已有文獻(xiàn)報(bào)道了綠原酸（CA）對(duì)酪氨酸酶的抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)型抑制[12]，本研究進(jìn)一步探討了青梅花提取物（PF）對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)理。在測(cè)活體系中，固定加入的酶量，改變底物L(fēng)-DOPA的濃度，測(cè)定酶在不同濃度青梅花提取物（PF）作用下的催化活力。以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，可以判斷青梅花提取物對(duì)該酶的抑制作用類型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，為一組相交在第二象限的直線。橫軸截距和縱軸截距都因效應(yīng)物濃度的變化而改變，米氏常數(shù)（Km）隨效應(yīng)物濃度的增大而變大，酶促反應(yīng)的最大速度（Vm）則隨效應(yīng)物濃度的增大而下降，其抑制類型屬于混合型。二次作圖，以雙倒數(shù)的斜率和縱軸截距對(duì)所含的效應(yīng)物的濃度作圖為直線，分別求出PF對(duì)游離酶抑制常數(shù)（KI）為85.9μg/mL和對(duì)酶-底物絡(luò)合物抑制常數(shù)（KIS）為401.8μg/mL。

圖2 青梅花提取物抑制酪氨酸酶活力的雙倒數(shù)圖

2.3 青梅花提取物的清除·OH能力

圖3 青梅花提取物（PF）清除·OH的IC50值

圖4 綠原酸（CA）及維生素C（VC）清除·OH的IC50值

·OH是生物系統(tǒng)中活性最強(qiáng)的自由基，危害性最強(qiáng)[13]。結(jié)果表明青梅花提取物對(duì)·OH具有一定程度的清除作用，結(jié)果如圖3所示，以半抑制濃度IC50表示自由基清除能力，其值越小說明清除作用越強(qiáng)。值得注意的是，綠原酸（CA）是青梅花提取物中主要的活性成分[10]，它對(duì)·OH自由基清除能力要顯著強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照VC（見圖4），而VC是已知的清除·OH較強(qiáng)的物質(zhì)之一，說明綠原酸作為青梅花提取物的主要活性成分賦予了PF較強(qiáng)的清除·OH的作用。

2.4 青梅花提取物的還原力

鐵氰化鉀還原法是用來測(cè)定樣品鐵還原能力的。結(jié)果表明，所測(cè)試樣在該體系中的還原力與樣品濃度呈正相關(guān)。其EC50值越小說明其還原能力越強(qiáng)，如圖5所示，鐵還原能力由強(qiáng)到弱的排序?yàn)椋篊A＞VC＞PF。同上述·OH清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果一樣，青梅花提取物中的主要活性成分綠原酸的還原能力要強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照VC。

圖5 不同物質(zhì)的EC50值（μg/mL）

3 討論

大量的研究結(jié)果表明，多酚類物質(zhì)具有良好的抗氧化作用，而酪氨酸酶所催化的反應(yīng)正是一系列的氧化還原反應(yīng)，所以含有多酚類的提取物可以在這個(gè)系列反應(yīng)的多個(gè)階段產(chǎn)生抑制作用。許多研究也證實(shí)了其具有強(qiáng)的酪氨酸酶抑制作用同時(shí)也是具有較強(qiáng)的抗氧化作用[14]。本文的研究也再次證實(shí)了這一理論。值得注意的是青梅花提取物的抑制作用又較單一的綠原酸強(qiáng)（p＜0.05），這說明雖然青梅花提取物的這種體外對(duì)酪氨酸酶的抑制作用與綠原酸類物質(zhì)的含量密切相關(guān)，但是多種混合的多酚類物質(zhì)較單一的物質(zhì)作用強(qiáng)，這可能是混合物中的不同活性成分對(duì)酶的作用位點(diǎn)不同，從而發(fā)生協(xié)同作用，這樣使得抑制作用大大增強(qiáng)。

本研究表明青梅花提取物（PF）對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制是屬于混合型競(jìng)爭(zhēng)，作用機(jī)理可以推斷如下：a.在酪氨酸酶的催化氧化過程中，活性氧既是引發(fā)劑又是反應(yīng)物，因此PF的這種清除自由基的能力，可以將ROS清除，從而阻斷反應(yīng)的引發(fā)，使該氧化反應(yīng)的強(qiáng)度減弱，同時(shí)也削弱了酪氨酸酶的供氧作用，所以PF對(duì)活性氧的清除作用是其對(duì)酪氨酸酶的抑制的一個(gè)重要的方面；b.青梅花提取物中的綠原酸類等酚酸類化合物中帶的羧基是強(qiáng)吸電子基，它可以抑制氧化態(tài)的酶中的氧原子與芳環(huán)的取代反應(yīng)，使氧化態(tài)的酶與這些酚酸類化合物形成的產(chǎn)物成了終端化合物，從而減緩或抑制氧化反應(yīng)發(fā)生；c.由于青梅花提取物中的多酚類物質(zhì)為含有多個(gè)活性酚羥基的結(jié)構(gòu)，而酪氨酸酶催化的反應(yīng)底物，如酪氨酸、多巴等這些化合物也是含有類似結(jié)構(gòu)，例如對(duì)位苯酚的結(jié)構(gòu)，因此在這種多步驟的氧化反應(yīng)過程中，青梅花提取物中的多酚類化合物可以被酪氨酸酶催化，可以與反應(yīng)底物競(jìng)爭(zhēng)性地與酪氨酸酶結(jié)合，從而削弱酪氨酸酶對(duì)酪氨酸、多巴等及其系列氧化產(chǎn)物的催化氧化作用；d.實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，青梅花提取物及其中所含的活性成分綠原酸類具有強(qiáng)的還原效果，如綠原酸類的還原能力較相同濃度的維生素C強(qiáng)（p＜0.05），因?yàn)樗鼈冞@種強(qiáng)的還原能力，可以還原酪氨酸酶催化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的一系列氧化產(chǎn)物（如還原多巴醌），從而阻斷反應(yīng)發(fā)生或者使反應(yīng)中間物質(zhì)被還原。

4 結(jié)論

前期研究已經(jīng)表明，綠原酸類物質(zhì)是青梅花提取物（PF）中的主要活性成分，而綠原酸（CA）又具有較強(qiáng)的酪氨酸酶抑制作用。值得注意的是，PF的酪氨酸酶抑制作用比單一的綠原酸（CA）強(qiáng)，這表明PF中除主要的活性成分綠原酸的貢獻(xiàn)外，還存在其他的活性成分發(fā)生協(xié)同作用，這種協(xié)同作用的結(jié)果是使酪氨酸酶的抑制作用大大加強(qiáng)，由此可見，青梅花提取物（PF）是一種十分有前途的酪氨酸酶抑制劑，將來可應(yīng)用于果蔬等食品的加工和貯藏。

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Inhibitory effect and mechanism of Prunus mume flowers extracts on tyrosinase

SHI Jia-yi
（School of Food Science and Engineering,Nanjing University of Finance&Economics,Nanjing 210003,China）

Objective:The inhibitory mechanism of flower extracts from Prunus mume (PF)on tyrosinase was discussed.Method:First，tyrosinase inhibiting activity was determined，and then Lineweaver-Burk curve was made，on which the inhibiting types of PF was deduced.The free radical scavenging and the reducing power of PF were evaluated by chemiluminescence and potassium ferricyanide，respectively.Results:The results showed that PF could inhibit the tyrosinase activity remarkably with the half inhibiting concentration IC50(98.89± 6.34)μg/mL.The type of PF on tyrosinase was mixed inhibition.The effect of PF on tyrosinase might relate to polyphenol，free radicals scavenging ability and reducing power.Conclusion:PF was a promising inhibitor of tyrosinase and could be applied to food processing and storage.

Prunus mume flowers；tyrosinase；free radicals；reducing power

TS255.1

A

1002-0306（2011）10-0205-04

酪氨酸酶（EC 1.14.18.1，Tyrosinase）廣泛存在于動(dòng)植物及人體內(nèi)，是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多亞基的含銅的氧化還原酶，同時(shí)具有單酚酶和二酚酶活性[1]。酪氨酸酶在酶促褐變、體內(nèi)色素合成的過程中起了關(guān)鍵的作用。特別是與果蔬的褐變有著密切關(guān)系，是引起水果、蔬菜發(fā)生酶促褐變的主要酶類。它可使多種果蔬在貯存、處理、加工過程中容易發(fā)生褐變反應(yīng)，如桃、荔枝、蘋果、馬鈴薯、鱷梨等。同時(shí)，酪氨酸酶氧化果蔬中的內(nèi)源性多酚物質(zhì)生成黑色素，影響了果蔬制品的營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味及外觀品質(zhì)和商品價(jià)值，使產(chǎn)品難以進(jìn)入市場(chǎng)。目前采用酪氨酸酶抑制劑如半胱氨酸、谷胱甘肽、肉桂酸、VC、天然提取物等處理果蔬，是水果保鮮手段之一[2]。研究表明，酪氨酸酶抑制劑廣泛存在于多種植物中，如柑橘、葡萄、桑葉、蘋果、茶葉等植物的提取物對(duì)酪氨酸酶都有抑制作用[3]。由于許多傳統(tǒng)的酪氨酸酶抑制劑大多是化學(xué)合成，有一定的毒副作用，因此從植物中分離天然酪氨酸酶抑制劑已得到人們的普遍關(guān)注。青梅（Prunus mume Sieb. Et Zucc）是薔薇科（Rosaceae）櫻桃屬植物。我國(guó)是世界上適合栽種青梅地域最廣的國(guó)家，目前我國(guó)青梅產(chǎn)地分布在全國(guó)18個(gè)省（自治區(qū)）[4]。據(jù)明代《本草綱目》記載，青梅花具有“開清神思、助雅致”的功效。目前國(guó)內(nèi)對(duì)青梅花的研究尚屬空白，本文以青梅花提取物為原料，研究了對(duì)酪氨酸酶的抑制作用，并通過清除自由基能力、還原能力等方面探討了青梅花提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)理，為青梅花在食品、醫(yī)藥及化妝品等工業(yè)的開發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

2011-07-15

石嘉懌（1979-），女，講師，博士，主要從事天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。