竹筍殼提取物抑菌活性研究

高雪娟，陳 健，孫紅男，陶曉赟，孫愛(ài)東

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083）

竹筍殼提取物抑菌活性研究

高雪娟，陳 健，孫紅男，陶曉赟，孫愛(ài)東﹡

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083）

以竹筍殼為原料，利用超聲波輔助-有機(jī)溶劑提取法提取活性物質(zhì)，并經(jīng)大孔樹(shù)脂初步純化；采用雙層平板打孔法研究竹筍殼提取物對(duì)食品中常見(jiàn)的4種細(xì)菌和3種真菌的抑制作用，同時(shí)考察溫度和紫外照射對(duì)其抑菌活性穩(wěn)定性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：竹筍殼提取物對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、大腸桿菌（Escherichia coli）這4種細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）分別為8.75、4.375、35、35mg/mL，對(duì)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、根霉（Rhizopus stolonifer）這3種真菌沒(méi)有抑制作用；竹筍殼提取物的抑菌活性具有很好的熱穩(wěn)定性；對(duì)于不同菌種，竹筍殼提取物的抑菌活性具有不同的紫外光穩(wěn)定性。

竹筍殼提取物，雙層平板打孔法，抑菌活性，穩(wěn)定性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

竹筍殼 5月份毛竹春筍殼，產(chǎn)自福建寧德柘榮縣，60℃烘箱烘干至脆，粉碎，過(guò)40目篩，備用；牛肉膏、大豆蛋白胨、瓊脂粉、氯化鈉、蔗糖、葡萄糖等均為國(guó)產(chǎn)分析純；細(xì)菌菌種 金黃色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、蠟狀芽孢桿（Bacillus cereus）、大腸桿菌（Escherichia coli）；真菌菌種 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、根酶 （Rhizopus stolonifer）、黑曲霉（Aspergillus niger），上述供試菌種由北京林業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供；培養(yǎng)基 細(xì)菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；真菌：馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）。

R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申順生物科技有限公司；JAC-Ⅳ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 濟(jì)寧市奧波超聲波電氣有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；FLC-3超凈工作臺(tái) 哈爾濱市東聯(lián)公司；SHK-99-Ⅱ臺(tái)式空氣恒流搖床 北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 竹筍殼提取物的制備

1.2.1.1 NKA-9大孔樹(shù)脂的預(yù)處理[9]先用95%的乙醇充分浸泡，然后用乙醇洗至洗出液加適量水（1∶5）無(wú)白色混濁，再用去離子水洗盡乙醇，最后轉(zhuǎn)入酸堿處理，用5%HCl溶液浸泡3h，然后用去離子水洗至pH為中性，接著用濃度為50g/L NaOH溶液浸泡3h，最后用去離子水洗至pH為中性。然后抽濾，65℃下真空干燥24h，放入干燥器中備用。

1.2.1.2 提取分離純化 利用超聲波輔助-有機(jī)溶劑提取法在乙醇濃度為60%，提取溫度為70℃，超聲波提取功率為800W，料液比為1∶25的條件下提取竹筍殼中的活性物質(zhì)，提取時(shí)間為30min，將得到的提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸濃縮；然后按照1∶10（g/mL）的比例，將預(yù)處理好的NKA-9大孔樹(shù)脂加入上述濃縮液中，于20℃下振搖吸附24h；然后以70%乙醇為洗脫劑，于20℃下振搖解析24h；將解析得到的液體再次旋蒸濃縮，冷凍干燥后所得粉末置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種活化及菌懸液的制備[10]供試菌從4℃冰箱中取出后，接種于相應(yīng)的新鮮斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌于37℃培養(yǎng)24h，真菌于28℃培養(yǎng)48h。每次做抑菌實(shí)驗(yàn)前將菌種充分活化，然后用接種環(huán)刮取一定量的菌到無(wú)菌生理鹽水中，作為原始菌懸液。采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，對(duì)菌懸液進(jìn)行一系列10倍稀釋?zhuān)缓筮x擇三個(gè)稀釋度的菌懸液，各吸取0.20mL分別加入到滅菌冷卻的各自適宜的平板培養(yǎng)基表面，涂布均勻，按上述條件培養(yǎng)，選擇106～107CFU/mL的菌液為實(shí)驗(yàn)用菌懸液。

1.2.3 抑菌活性實(shí)驗(yàn) 藥劑擴(kuò)散法又稱(chēng)抑菌圈法或瓊脂平板法，是化合物通過(guò)介質(zhì)滲透擴(kuò)散，施藥部位周?chē)牟【粴⑺?，或生長(zhǎng)受到限制，從而產(chǎn)生了抑菌圈或透明圈。抑菌圈和化合物濃度之間在一定范圍內(nèi)成函數(shù)關(guān)系，通過(guò)活性測(cè)定結(jié)果，可以比較抗菌化合物活性的大小[11]。

本實(shí)驗(yàn)采用雙層平板打孔法研究竹筍殼提取物的抑菌活性[12]。首先將滅菌的素瓊脂（10～15mL）均勻地倒入直徑為90mm滅菌培養(yǎng)皿中，待素瓊脂凝固后，將滅菌的培養(yǎng)基倒入各培養(yǎng)皿中，每皿約20mL，放置冷卻，待培養(yǎng)基凝固后，用無(wú)菌移液槍取0.1mL菌懸液加入平皿中，再用玻璃涂布棒將菌懸液涂布均勻，制成帶菌平板。然后用滅過(guò)菌的直徑為6mm的吸管打4個(gè)孔，其中3個(gè)孔注入120mg/mL的竹筍殼提取物溶液100μL，另外一個(gè)孔注入無(wú)菌水作對(duì)照。細(xì)菌于37℃恒溫培養(yǎng)24h，酵母菌和霉菌于28℃恒溫培養(yǎng)48h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，采用十字交叉法測(cè)定抑菌圈兩個(gè)垂直方向的直徑大小，取其平均值（mm），以抑菌圈直徑作為竹筍殼提取物抑菌活性指標(biāo)，直徑越大抑菌活性越強(qiáng)[13]。每項(xiàng)抑菌實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)3次。

1.2.4 最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 采用二倍稀釋法測(cè)定提取物對(duì)供試菌的MIC[14]。用無(wú)菌水將竹筍殼提取物逐級(jí)稀釋成140、70、35、17.5、8.75、4.375、2.1875mg/mL等系列濃度，其余步驟均同抑菌活性實(shí)驗(yàn)，每項(xiàng)抑菌實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)3次。完全沒(méi)有抑菌圈出現(xiàn)的提取物濃度即為最小抑菌濃度，表示為MIC（mg/mL）。

1.2.5 溫度對(duì)竹筍殼提取物抑菌活性的影響研究用無(wú)菌水將竹筍殼提取物溶解成濃度為70mg/mL的溶液，作為原液。取一定量原液分別置于80、100℃水浴和121℃濕熱條件下各處理20min。以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌為指示菌，其余步驟均同抑菌活性實(shí)驗(yàn)，每項(xiàng)抑菌實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)3次。

1.2.6 紫外照射對(duì)竹筍殼提取物抑菌活性影響研究稱(chēng)取若干份樣品，分別置于20W的紫外燈下照射10、20、30、40、50、60min，用無(wú)菌水配成濃度為70mg/ mL的樣液。同樣以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌為指示菌，其余步驟均同抑菌活性實(shí)驗(yàn)，每項(xiàng)抑菌實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

以SAS作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，采用t檢驗(yàn)分析顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹筍殼提取物的抑菌活性測(cè)定

抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，竹筍殼提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，與對(duì)其他菌株的抑制作用相比差異顯著（p＜0.05）；其次是對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用，與對(duì)其他菌株的抑制作用相比差異顯著（p＜0.05）；對(duì)蠟狀芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制作用較弱；而對(duì)釀酒酵母、根霉和黑曲霉無(wú)抑制作用。由表1還可以看出，竹筍殼提取物對(duì)供試的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌都有非常明顯的抑制作用，而對(duì)真菌完全無(wú)抑制作用。

推測(cè)竹筍殼提取物的抑菌機(jī)理主要有以下兩種：一種是活性物質(zhì)水解細(xì)胞壁中的糖苷鍵，破壞了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞壁出現(xiàn)部分缺失，失去對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，細(xì)胞質(zhì)解體出現(xiàn)空腔；另外一種作用是活性通過(guò)滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，擾亂細(xì)胞正常的生理活動(dòng)。具體的抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究[15]。

表1 竹筍殼提取物對(duì)常見(jiàn)菌的抑制效果（樣品液濃度120mg/mL）

2.2 最小抑菌濃度的測(cè)定（MIC）

為了定量研究竹筍殼提取物對(duì)食品中常見(jiàn)菌的抑制活性，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)定了竹筍殼提取物的MIC，以期為竹筍殼的綜合利用提供一定的理論依據(jù)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，竹筍殼提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有很強(qiáng)的抑制作用，并隨著提取物濃度的增加，其抑菌活性明顯增高，竹筍殼提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的最小抑菌濃度分別為8.75、4.375mg/mL；竹筍殼提取物對(duì)蠟狀芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制作用相對(duì)較弱，其最小抑菌濃度均為35mg/mL。

表2 竹筍殼提取物最低抑菌濃度的測(cè)定

2.3 溫度對(duì)竹筍殼提取物抑菌活性的影響研究

溫度對(duì)竹筍殼提取物抑菌活性影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，竹筍殼提取物經(jīng)80℃和100℃處理后，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌的抑制活性相比沒(méi)有顯著差異，但是經(jīng)121℃高溫處理后，對(duì)上述3種菌株的抑制活性差異顯著（p＜0.05）；竹筍殼提取物經(jīng)80、100、121℃三種高溫處理對(duì)大腸桿菌的抑制活性沒(méi)有顯著差異。

表3 溫度對(duì)竹筍殼提取物抑菌效果的影響

由表3還可得知，溫度對(duì)竹筍殼提取物的抑菌活性有一定的影響，隨處理溫度的升高，竹筍殼提取物對(duì)4種供試菌的抑菌活性呈下降的趨勢(shì)，但是仍具有較強(qiáng)的抑菌效力，說(shuō)明竹筍殼提取物的抑菌成分具有一定的熱穩(wěn)定性。

2.4 紫外照射對(duì)竹筍殼提取物抑菌活性的影響研究

紫外照射實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，竹筍殼提取物經(jīng)不同時(shí)間的紫外照射后，對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制活性沒(méi)有顯著差異；而對(duì)蠟狀芽孢桿菌和大腸桿菌完全無(wú)抑制作用。由此看出對(duì)于不同菌種，竹筍殼提取物的抑菌活性具有不同的紫外光穩(wěn)定性，推測(cè)原因?yàn)橹窆S殼提取物對(duì)不同菌種的抑菌機(jī)制存在差異。

表4 紫外照射對(duì)竹筍殼提取物抑菌效果的影響

3 討論

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌、黑曲霉、根霉等菌種是食品加工和貯藏工程中常見(jiàn)的腐敗菌種，在自然界的分布也較廣泛。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：

3.1 竹筍殼提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌的抑制作用依次減弱，MIC分別為8.75、4.375、35、35mg/mL；對(duì)釀酒酵母、黑曲霉、根霉完全沒(méi)有抑制作用。竹筍殼提取物是一種天然提取物，且對(duì)細(xì)菌中革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌均有較好的抑制作用，經(jīng)安全性評(píng)價(jià)后，可以作為天然食品防腐劑添加到食品中。

3.2 竹筍殼提取物經(jīng)短時(shí)高溫處理后，對(duì)4種供試細(xì)菌仍然具有較強(qiáng)的抑制活性，說(shuō)明竹筍殼提取物的抑菌活性具有很好的熱穩(wěn)定性。

3.3 竹筍殼提取物經(jīng)不同時(shí)間的紫外照射處理后，對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制活性幾乎沒(méi)有變化，而對(duì)蠟狀芽孢桿菌和大腸桿菌則完全沒(méi)有抑制活性，此結(jié)果說(shuō)明對(duì)于不同的菌種，竹筍殼提取物的抑菌活性具有不同的紫外光穩(wěn)定性。

3.4 本實(shí)驗(yàn)為竹筍殼的綜合利用以及天然食品防腐劑的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)，具體竹筍殼提取物的抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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Study on the antimicrobial activity of bamboo shoot shell extracts

GAO Xue-juan，CHEN Jian，SUN Hong-nan，TAO Xiao-yun，SUN Ai-dong*
（College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

With bamboo shoot shells as raw materials，active substance was extracted by ultrasonic-organic solvent method，and purified by macroporous adsorption resin.Agar diffusion method was used to investigate antimicrobial effect of bamboo shoot shell extracts on some common food putrefied microbes，the stability of the antimicrobial activity was also investigated under heat treatment and UV light treatment.The results showed that the minimum inhibition concentration of bamboo shoot shell extracts in the test range was 8.75mg/mL for StaphyIoccocus aureus，4.375mg/mL for BaciIIus subtiIis,35mg/mL for BaciIIus cereus,35mg/mL for Escherichia coIi，but there was no significant antibacterial effect on Saccharomyces cerevisiae，Rhizopus stoIonifer and AspergiIIus niger.The antibacterial activity substance in bamboo shoot shell extracts has good heat stability；UV light stability of the antibacterial activity substance is different to different microbials.

bamboo shoot shell extracts；agar diffusion method；antimicrobial activity；stability

TS255.1

A

1002-0306（2011）10-0076-04

竹子是禾本科竹亞科多年生植物，中國(guó)有竹類(lèi)植物41屬約500種，擁有竹林面積500多萬(wàn)hm2[1]。竹筍是竹鞭或稈基上的芽萌發(fā)而成的膨大的芽和幼嫩的莖[2]。竹筍含有多種營(yíng)養(yǎng)元素，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值。目前，竹筍除鮮食外，還被制作成筍干和罐頭等。但竹筍中用于制作筍罐頭、筍干等筍制品的筍肉只占筍體的30%，其余均為筍頭和筍殼等下腳料[3]。近年來(lái)，人們已經(jīng)意識(shí)到直接將這些下腳料丟棄所造成的經(jīng)濟(jì)損失和環(huán)境污染，因此，對(duì)下腳料廢棄物進(jìn)行開(kāi)發(fā)和利用是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。羅曼等人從鮮筍殼中提取活性高、耐熱性好的過(guò)氧化物酶[4]。孫靜亞等人對(duì)竹筍殼色素的提取工藝和性質(zhì)進(jìn)行了研究[5]。謝碧霞等人以竹筍渣和竹筍殼為原料研究了膳食纖維的生產(chǎn)工藝和性質(zhì)[6]。Baiyi Lu等人采用一種新的高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜方法對(duì)不同品種、不同部位、不同收獲季節(jié)竹筍中甾醇類(lèi)化合物的含量和組成進(jìn)行研究，結(jié)果表明毛竹竹筍殼中甾醇類(lèi)化合物的含量最高為321.8mg/100g干重[7]。但是目前針對(duì)竹筍殼提取物抑菌活性的研究鮮有報(bào)道。國(guó)外對(duì)竹筍肉提取物的抑菌活性研究已見(jiàn)報(bào)道，Eun-Jin Park等以韓國(guó)2種常見(jiàn)竹種（毛竹和紫竹）竹筍為原料，采用不同溶劑提取竹筍中的活性物質(zhì)，研究了所有提取物的抗氧化能力、抑菌活性、對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的抑制活性[8]。本文以竹筍殼為原料，利用超聲波輔助-有機(jī)溶劑提取法提取活性物質(zhì)；采用雙層平板打孔法研究竹筍殼提取物對(duì)食品中常見(jiàn)腐敗菌的抑制作用，同時(shí)考察溫度和紫外照射對(duì)其抑菌活性穩(wěn)定性的影響，以期為竹筍殼的綜合利用及新型安全天然食品防腐劑的開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

2010-09-02*通訊聯(lián)系人

高雪娟（1987-），女，在讀碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物生理活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)與利用。

“十一五”國(guó)家科技支撐項(xiàng)目（2006BAD19B08，2008BADA9B04，2009BADB9B07）。