宣木瓜粗提物抑菌作用的研究

王旭東，董 明，李 娜，張國慶，俞雅瓊

(安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽合肥230036)

宣木瓜粗提物抑菌作用的研究

王旭東，董 明*，李 娜，張國慶，俞雅瓊

(安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽合肥230036)

為了研究宣木瓜粗提物的抑菌作用以及紫外光和溫度對其抑菌作用的影響，以95%乙醇和蒸餾水作為溶劑，采用水浴振蕩法對宣木瓜粗提物進行提取。采用平板打孔法測定宣木瓜不同粗提物對熒光假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和四聯(lián)球菌的抑菌作用以及最低抑菌濃度和最低殺菌濃度。結(jié)果表明，宣木瓜95%乙醇粗提物和蒸餾水粗提物對5種有害菌都有明顯的抑制作用，而且95%乙醇粗提物的抑菌作用優(yōu)于蒸餾水粗提物，兩種粗提物均有較好的紫外光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。

宣木瓜，乙醇粗提物，蒸餾水粗提物，抑菌作用，平板打孔法

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

宣木瓜 采自安徽省宣城新田區(qū)宣木瓜生產(chǎn)基地，羅漢臍品種，切片，60℃烘干至恒重，然后用DFT－100多功能粉碎機將其粉碎，備用;熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、四聯(lián)球菌(Micrococcus tetragenus) 由安徽農(nóng)業(yè)大學微生物實驗室提供;大腸桿菌(Escherichia coli)菌株編號:CICC44825、枯草芽孢桿菌(Bacillus subfilis)菌株編號:CMCC26003、金黃色葡萄球菌(Staphylocaccus aureus)菌株編號: CMCC63501 以上菌種由廣東微生物種質(zhì)資源庫提供。

LDZX－40型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;FA2104萬分之一電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司;ZK型系列組合式冷庫 中國常州銀雪制冷設(shè)備有限公司;SHA－B雙功能水浴恒溫振蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司; HH－4恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;DHG－9140A型電熱恒溫鼓風干燥器 上海一恒科技有限公司;T6新世紀紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;SPX－150B－Z型MODEL生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;無菌操作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;SHZ－D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵鞏義市英峪予華儀器廠;直徑6mm不銹鋼打孔器，DFT－100多功能中藥粉碎機。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 宣木瓜→切片、60℃烘干→粉碎成粉末狀→水浴振蕩浸提→過濾、濃縮、干燥→配成不同濃度的生藥→抑菌實驗→穩(wěn)定性實驗

1.2.2 粗提物的制備

1.2.2.1 宣木瓜95%乙醇粗提物的制備 稱取10.00g宣木瓜粉末，采用95%乙醇，料液比為1∶8 (g∶mL)，在60℃水浴振蕩器中提取2次，每次1h，紗布過濾，合并兩次濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60℃濃縮至浸膏狀，再經(jīng)真空干燥至無乙醇味，然后用DMSO試劑定容至20mL，此時生藥濃度為500.00mg/mL，存放于4℃冰箱中，抑菌備用。

1.2.2.2 宣木瓜蒸餾水粗提物的制備 稱取10.00g宣木瓜粉末，采用蒸餾水，料液比為1∶8(g∶mL)，在60℃水浴振蕩器中提取2次，每次1h，紗布過濾，合并兩次濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60℃濃縮至20mL，此時生藥濃度為500.00mg/mL，存放于4℃冰箱中，抑菌備用。

1.2.3 培養(yǎng)基的制備［6］牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(BPA):牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15～20g，水1000mL。pH(7.4±0.2)，121℃滅菌20min。

1.2.4 菌懸液的制作

1.2.4.1 菌種的活化 培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、四聯(lián)球菌在37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，熒光假單胞菌在28℃恒溫箱培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)接2次，得到長勢良好的菌種，然后置于0～4℃下冷藏備用。

1.2.4.2 菌懸液的制備 挑取一環(huán)活化好的菌種接種到已滅菌的含有20mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，150r/min搖床培養(yǎng)，用已滅菌的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基調(diào)整，采用平板計數(shù)法使其菌懸液濃度大約為107～108CFU/mL，存放于4℃的冰箱中保存。

1.2.5 抑菌實驗 用滅過菌的打孔器在涂布菌液的平皿上邊緣處每旋轉(zhuǎn)120°打一個孔，培養(yǎng)皿中心部分打一個孔，95%乙醇粗提物以DMSO試劑作為空白對照，蒸餾水粗提物以無菌水作為空白對照。從培養(yǎng)皿的正下方，用無菌移液槍順時針分別加入0.1mL濃度分別為500.00、100.00、20.00mg/mL的生藥。每種菌平行做3個培養(yǎng)皿實驗。將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和四聯(lián)球菌在37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，熒光假單胞菌在28℃恒溫箱培養(yǎng)24h觀察有無抑菌圈。

1.2.6 最低抑菌濃度(MIC)的測試 在上述3種濃度梯度抑菌實驗的基礎(chǔ)上采用打孔法測試宣木瓜95%乙醇粗提物和宣木瓜蒸餾水粗提物對5種有害菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度。每種菌、每個皿用無菌打孔器每旋轉(zhuǎn)60°打一個孔，每皿共打6個孔，中央的孔作為空白對照，其中宣木瓜95%乙醇粗提物以DMSO溶劑作為對照，宣木瓜蒸餾水粗提物以無菌蒸餾水作為對照。將兩種宣木瓜粗提物采用二倍稀釋法進行稀釋，每種菌的每種濃度的不同粗提物做3個平行，以其平均值作為抑菌結(jié)果。

1.2.7 最低殺菌濃度(MBC)的測試 待測定完最低抑菌濃度后，繼續(xù)將各皿培養(yǎng)24h，以有抑菌圈出現(xiàn)的最低生藥濃度為此藥液對此細菌的最低殺菌濃度(MBC)。

1.2.8 提取物穩(wěn)定性研究

1.2.8.1 紫外光穩(wěn)定性測定 每個皿用無菌打孔器均勻打5個孔，將濃度為100.00mg/mL的宣木瓜粗提物置于紫外光下分別照射5、10、15、20、25min，順時針每孔加入同濃度不同處理時間的藥液，中央的孔加入不經(jīng)過紫外光處理的同濃度同體積的藥液作為對照，平行實驗做3組。分別以熒光假單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和四聯(lián)球菌為指示菌，用十字交叉法測定其抑菌圈直徑，實驗重復3次。

1.2.8.2 熱穩(wěn)定測定 每個皿用無菌打孔器均勻打5個孔，將濃度為100.00mg/mL的宣木瓜粗提物分別置于40、60、80、100、121℃濕熱條件下各處理20min，對照置于常溫條件下。待冷卻到常溫條件下時，順時針每孔加入同濃度不同處理溫度的藥液，中央的孔加入不經(jīng)過熱處理的同濃度同體積的藥液作為對照，平行做實驗3組。分別以熒光假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌和四聯(lián)球菌為指示菌，用十字交叉法測定其抑菌圈直徑，實驗重復3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 宣木瓜粗提物對細菌的抑制作用

由表1可知，95%乙醇粗提物和蒸餾水粗提物均對熒光假單胞菌有抑制作用，其中乙醇粗提物對熒光假單胞菌的抑菌活性高于蒸餾水粗提物。蒸餾水粗提物濃度降低到為20.00mg/mL時，對熒光假單胞菌無抑制作用。95%乙醇粗提物和蒸餾水粗提物均對大腸桿菌有抑制作用，但是濃度為100.00mg/mL時，抑菌圈內(nèi)有零星的菌落生長，總體來看抑菌效果一般，乙醇粗提物的抑制作用優(yōu)于蒸餾水粗提物。95%乙醇粗提物和蒸餾水粗提物均對枯草芽孢桿菌有抑制作用，濃度為100.00mg/mL時，抑菌圈內(nèi)有也有零星的菌落生長，抑菌效果不佳，由抑菌圈的數(shù)據(jù)來看，兩者抑菌作用很接近。95%乙醇粗提物和蒸餾水粗提物對金黃色葡萄球菌均有較強的抑制作用，其中乙醇粗提物的抑菌作用略高于蒸餾水粗提物。95%乙醇粗提物和蒸餾水粗提物均對四聯(lián)球菌表現(xiàn)出了很強的抑制作用，乙醇粗提物對四聯(lián)球菌的抑制作用高于蒸餾水粗提物。

表1 宣木瓜95%乙醇粗提物和蒸餾水粗提物對5種細菌的抑制作用

表2 宣木瓜95%乙醇粗提物對5種細菌的最低抑菌濃度(MIC)

表3 宣木瓜95%乙醇粗提物對5種細菌的最低殺菌濃度(MBC)

2.2 宣木瓜粗提物對細菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度

2.2.1 乙醇粗提物的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度由表2和表3可知，宣木瓜95%乙醇粗提物對熒光假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和四聯(lián)球菌均有不同程度的抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為15.63mg/mL，是抑制這5種細菌中所需最高的生藥濃度;對熒光假單胞菌的最低抑菌濃度為0.98mg/mL，是抑制這5種細菌中所需最低的生藥濃度。繼續(xù)將各皿培養(yǎng)24h后，抑菌作用都有不同程度的降低，表現(xiàn)為各皿中抑菌圈變小或者某濃度下抑菌圈消失?？梢娨志饔檬请S著時間的延長而有所降低。

2.2.2 蒸餾水粗提物的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC) 由表4和表5可知，對熒光假單胞菌的最低抑菌濃度為62.50mg/mL，是抑制這5種細菌中所需生藥最高的濃度。對其余4種菌的最低抑菌濃度維持在15.63mg/mL左右。繼續(xù)將各皿培養(yǎng)24h后，金黃色葡萄球菌在最低抑菌濃度下的抑菌圈消失，一直在濃度達到62.50mg/mL時，抑菌圈才出現(xiàn)，和熒光假單胞菌的最低殺菌濃度均為62.50mg/mL。與95%乙醇粗提物相比，蒸餾水粗提物的抑菌作用隨著時間的延長變化不大。

2.3 紫外光和溫度處理對粗提物抑菌作用的影響

2.3.1 紫外光對粗提物抑菌作用的影響 用無菌移液槍順時針分別加入經(jīng)紫外光分別處理5、10、15、20、25min的濃度為100mg/mL生藥0.1mL，中間的孔加入不做任何紫外光處理的同濃度同體積的生藥作為對照。將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、四聯(lián)球菌的培養(yǎng)皿在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，熒光假單胞菌在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，測定其抑菌圈直徑。取3次抑菌圈直徑的平均值。

表4 宣木瓜蒸餾水粗提物對5種細菌的最低抑菌濃度(MIC)

表5 宣木瓜蒸餾水粗提物對5種細菌的最低殺菌濃度(MBC)

表6 紫外光照射對95%乙醇粗提物對5種細菌抑制作用的影響

由表6和表7可知，隨著紫外光處理時間的變化，乙醇粗提物和蒸餾水粗提物的抑菌活性基本保持不變，由此可見宣木瓜乙醇粗提物和蒸餾水粗提物對紫外光具有極高的穩(wěn)定性。

表7 紫外光照射對蒸餾水粗提物對5種細菌抑制作用的影響

2.3.2 溫度對宣木瓜粗提物的抑菌作用影響 用無菌移液槍順時針分別加入經(jīng)熱處理溫度分別為40、60、80、100、121℃的100mg/mL的生藥0.1mL(待冷卻到常溫)，中間的孔加入不做任何熱處理的同濃度同體積的生藥作為對照。將大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、四聯(lián)球菌的培養(yǎng)皿在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，熒光假單胞菌在28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，測其抑菌圈直徑。取3次抑菌圈直徑的平均值。

由表8和表9可知，乙醇粗提物和蒸餾水粗提物經(jīng)不同溫度處理后其抑菌活性差別不大，基本保持原有的抑菌活性，即使在121℃處理20min后仍具有較高的活性。表明宣木瓜粗提物的抑菌活性具有較好的熱穩(wěn)定性。

表8 溫度對95%乙醇粗提物對5種細菌抑制作用的影響

表9 溫度對蒸餾水粗提物對5種細菌抑制作用的影響

2.4 宣木瓜中抑菌成分探討

從抑菌的實驗結(jié)果來看，宣木瓜的兩種粗提物對細菌有廣譜抑制作用，抑菌作用應該是宣木瓜中的抑菌物質(zhì)綜合作用的結(jié)果。宣木瓜中含有的有機酸尤其是齊墩果酸、單寧、黃酮類等物質(zhì)都是粗提物可能對細菌產(chǎn)生抑制作用的物質(zhì)。

齊墩果酸是木瓜主要藥效成分之一，以單體或皂甙形式存在，國內(nèi)外研究證實，齊墩果酸具有消炎抑菌、降轉(zhuǎn)氨酶、降糖、降血脂、抗血栓形成、抗突變、抗愛滋病、抑制HIV－1的復制等作用［7］。

有關(guān)資料表明，黃酮類化合物具有顯著的抗氧化及抗自由基、抗癌及防癌、降壓及降血脂、改善微循環(huán)、抑菌、消炎等功能［4］。

單寧對微生物具有廣譜抗性(包括對絲狀真菌、酵母、細菌、病毒的抑制)。以單體為主體的植物多酚不僅抵御食草動物對植物體的損害，同時也阻止了微生物的侵襲，包括提高對各種致病菌的耐受力和保護受傷部位。除了對植物致病菌外，單寧對動物體內(nèi)和其他環(huán)境中多種微生物的生長都有明顯的抑制作用［8］。

綜上所述，宣木瓜粗提物對細菌有抑制作用，是上述多種成分共同抑制的結(jié)果，并不是單一成分在起作用。由于提取溶劑95%乙醇和蒸餾水，提取出來的抑菌成分在比例和量的方面有所不同，這或許是乙醇粗提物和蒸餾水粗提物對細菌的抑制作用不同的原因。

3 結(jié)論

宣木瓜乙醇粗提物和蒸餾水粗提物對細菌有廣譜抗菌作用，既對革蘭氏陰性菌(熒光假單胞菌和大腸桿菌)有抑制作用，也對革蘭氏陽性菌(枯草桿菌、金黃色葡萄球菌和四聯(lián)球菌)有抑制作用，既有球菌如:金黃色葡萄球菌和四聯(lián)球菌，也有桿菌如:枯草桿菌、大腸桿菌和熒光假單胞菌。從同濃度抑菌實驗來看，95%乙醇粗提物對5種有害菌的抑菌強弱順序為:四聯(lián)球菌＞金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞大腸桿菌＞熒光假單胞菌;蒸餾水粗提物對5種有害菌的抑菌強弱順序為:四聯(lián)球菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞枯草桿菌＞熒光假單胞菌;且95%乙醇粗提物的抑菌活性普遍高于蒸餾水粗提物。

宣木瓜95%乙醇粗提物對5種細菌的MIC范圍為:0.98～15.63mg/mL，MBC范圍為:3.91～31.25mg/mL;蒸餾水粗提物的 MIC和 MBC范圍均為15.63～62.50mg/mL。

宣木瓜粗提物的抑菌作用是宣木瓜中多種抑菌成分綜合作用的結(jié)果，并非單一成分的作用，可能與其中含有的齊墩果酸、黃酮類化合物、酚類等成分有關(guān)。粗提物的紫外光穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性好，溫度甚至達到121℃仍能保持較高的抑菌活性。從抑菌效果來看，宣木瓜粗提物具有被開發(fā)為天然防腐劑的潛力。至于宣木瓜中具體是哪些物質(zhì)在起抑菌作用以及抑菌機理如何，有待于進一步研究。

［1］張超，陳奉玲，湯興毫.木瓜的本草考證［J］.中草藥，1999，30(12):943.

［2］吳延廷，張俊.中藥木瓜的基源和性狀鑒定［J］.華西醫(yī)科大學學報，1996，27(4):404－408.

［3］周根土.宣木瓜豐產(chǎn)栽培技術(shù)經(jīng)濟林研究［J］.2003，21 (4):85－86.

［4］唐春紅，葉志義，項昭保，等.木瓜營養(yǎng)保健作用研究動態(tài)［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2000，12(4):97－100.

［5］中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典一部［M］.北京:化學工業(yè)出版社，2000:45.

［6］張文治.新編食品微生物學［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2001:379.

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［8］石碧，狄瑩.植物多酚［M］.北京:科學出版社，2000:118.

Study on the antimicrobial activity of Chaenomeles Speciosa S.Nakai

WANG Xu－dong，DONG Ming*，LI Na，ZHANG Guo－qing，YU Ya－qiong
(College of Tea and Food Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China)

Chaenomeles Speciosa S.Nakai was extracted by bain－marie vibration method with 95%ethanol and distilled water as solvent in order to study the antimicrobial activity of its crude extracts and the influence of ultraviolet ray and temperature on their antimicrobial activities.Two different crude extracts were tested the antimicrobial activity to Pseudomonas fluorescens，Escherichia coli，Bacillus subtilis，Staphylocaccus aureus，Micrococcus tetragenus and minimum inhibitory concentration and minimal bactericidal concentration by disk diffused tests.The results showed that 95%ethanol crude extract and distilled water extract possessed obvious antimicrobial activity to five harmful bacterias，and 95%ethanol crude extract of antimicrobial activity was superior than that of distilled water extract，crude extracts both had good ultraviolet stabilization and thermo stabilization. Key words:Chaenomeles Speciosa(Sweet)Nakai;ethanol crude extract;distilled water crude extract;antimicrobial activity;disk diffused tests

TS255.1

A

1002－0306(2011)12－0175－05

宣木瓜，安徽著名特產(chǎn)，因產(chǎn)于安徽省宣城市而得名，是藥用木瓜的正品［1－2］。國家衛(wèi)生部第一批“藥食同源”名單中公布:宣木瓜既是藥品，又是食品。學名為貼梗海棠(Chaenomeles Speciosa(Sweet) Nakai)，又名皺皮木瓜、鐵腳梨，屬薔薇科木瓜屬，落葉闊葉灌木。宣木瓜與“甘枸杞”、“川杜仲”、“藏紅花”并稱為我國的四大名產(chǎn)中藥材［3］。關(guān)于宣木瓜的研究集中在醫(yī)療作用［4］和栽培技術(shù)［3］領(lǐng)域。研究表明，宣木瓜果實富含有機酸、皂甙、維生素、胡蘿卜素、氨基酸、果膠、黃酮類和鉀、鎂、鈣、鋅、鐵、錳、磷等多種微量元素和營養(yǎng)物質(zhì)，具有極高的食用價值和營養(yǎng)保健作用［4］。李時珍在《本草綱目》中記載:“木瓜處處有之，而宣城者為佳?！蹦竟献鳛橐环N常用中藥，味酸、溫、入肝、脾經(jīng)，有平肝舒筋、和胃化濕之功效［5］。鑒于宣木瓜中含有很多活性物質(zhì)，本實驗采用水浴振蕩法分別以95%乙醇和蒸餾水為溶劑對宣木瓜進行提取得到粗提物，通過平板打孔法測定宣木瓜乙醇粗提物和蒸餾水粗提物對食品中的有害菌:熒光假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和四聯(lián)球菌的抑菌效果，并測定它們各自對每種有害菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度，以期為把宣木瓜粗提物開發(fā)成食品的天然防腐劑提供理論依據(jù)。

2010－11－03 *通訊聯(lián)系人

王旭東(1985－)，男，碩士研究生，研究方向:植物源食品質(zhì)量與安全。