馬鈴薯蛋白酸法脫酰胺改性的初步研究

張 軼，馬長(zhǎng)路，任海偉，張百剛，趙 萍

(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050;2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京102442)

馬鈴薯蛋白酸法脫酰胺改性的初步研究

張 軼1，馬長(zhǎng)路2，任海偉1，張百剛1，趙 萍1

(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050;2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京102442)

采用鹽酸法對(duì)馬鈴薯蛋白進(jìn)行脫酰胺改性，實(shí)驗(yàn)得出最佳工藝條件為:鹽酸濃度0.5mol/L，80℃下反應(yīng)2.5h，此條件下馬鈴薯蛋白的脫酰胺度為44.76%。該脫酰胺度下，馬鈴薯蛋白的溶解性能、持水性及乳化性、乳化穩(wěn)定性較改性前樣品都有顯著增加。

馬鈴薯蛋白，酸法脫酰胺，改性

馬鈴薯蛋白系馬鈴薯淀粉加工后的副產(chǎn)物，從淀粉廢水中回收后目前僅作為飼料應(yīng)用，附加值低。對(duì)其進(jìn)行基礎(chǔ)及改性研究有助于擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，并提升利用價(jià)值，為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)鏈的延伸開辟新的方向。蛋白質(zhì)的脫酰胺化是指蛋白質(zhì)中的天門冬酰胺和谷氨酰胺側(cè)鏈酰胺基脫去氨基而變成高親水性的羧基的過程［1］。其中，酸法脫酰胺是一種常用且有效的脫酰胺方法，對(duì)植物蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性等性質(zhì)有較大程度的提高［2］。但將該法應(yīng)用于馬鈴薯蛋白的改性尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用鹽酸法對(duì)馬鈴薯蛋白進(jìn)行脫酰胺改性的初步研究，以期為馬鈴薯蛋白的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯蛋白粉 蛋白含量65%，黑龍江嵩天薯業(yè)有限公司;鹽酸、硼酸、氫氧化鈉、甲基紅、溴甲酚綠、牛血清白蛋白、考馬斯亮蘭G－250、乙醇、磷酸以上均為分析純。

FD－I－55冷凍干燥機(jī) 梅特勒－托利多上海有限公司;Mark500sR電子分析天平(BEL)、PHS－3D型pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;UV－9200紫外分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司;HH－4數(shù)顯恒溫水浴鍋

鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;FSH－2A可調(diào)高速勻漿機(jī) 江蘇金壇市醫(yī)療儀器總廠;TDL－5－A型高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;JB－50D型電動(dòng)攪拌機(jī) 上海標(biāo)本模型廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 馬鈴薯蛋白酸法脫酰胺樣品的制備［3－4］準(zhǔn)確稱取5g馬鈴薯蛋白粉，分散于100mL一定濃度的鹽酸溶液中，采用電磁攪拌，在一定溫度下反應(yīng)一段時(shí)間后，迅速在冰浴中冷卻，用10mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為7.0，離心得到上清液，冷凍干燥，得到改性蛋白樣品。

1.2.2 馬鈴薯蛋白酸法脫酰胺程度的測(cè)定［2］準(zhǔn)確稱取0.5g蛋白樣品，加5mL 2mol/L鹽酸，抽真空封于硬質(zhì)玻璃管中，在125℃下水解3h，水解完畢取出，待冷后打開玻璃管。在微量彌散皿中央加入含甲基紅－溴甲酚綠指示劑的2%硼酸作為吸收劑，外圍加入2mL樣品，用薄膜覆蓋，留一定空隙，在外圍再加入40%NaOH溶液3mL，立即封上薄膜避免漏氣，輕輕擺動(dòng)，使外圍的樣品與NaOH溶液充分混合，平放桌上反應(yīng)3h，揭開薄膜后用0.01mol/L標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定至略帶微紅，記錄消耗鹽酸的體積，按下式計(jì)算脫酰胺度。

式中:C0－未處理蛋白質(zhì)的酰胺氮含量(mmol/g);Cn－改性后蛋白質(zhì)的酰胺氮含量(mmol/g)。1.2.3 馬鈴薯蛋白酸法脫酰胺改性反應(yīng)條件的選擇

以馬鈴薯蛋白的脫酰胺度為指標(biāo)，考察鹽酸濃度、反應(yīng)溫度及時(shí)間對(duì)馬鈴薯蛋白脫酰胺改性的影響。

1.2.3.1 鹽酸濃度對(duì)脫酰胺度的影響 設(shè)置鹽酸濃度分別為:0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mol/L，其他條件為:溫度50℃，時(shí)間2h，料液比1∶25(g/mL)。

1.2.3.2 反應(yīng)溫度對(duì)脫酰胺度的影響 設(shè)置脫酰胺反應(yīng)溫度分別為:40、50、60、70、80、90℃。其他條件為:鹽酸濃度0.4mol/L，時(shí)間2h，料液比1∶25(g/mL)。

1.2.3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)脫酰胺度的影響 設(shè)置脫酰胺反應(yīng)時(shí)間分別為:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h。其他條件為:鹽酸濃度0.4mol/L，溫度50℃，料液比1∶25(g/mL)。

1.2.4 馬鈴薯蛋白酸法脫酰胺改性最優(yōu)反應(yīng)條件的確定 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以脫酰胺度為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，確定馬鈴薯蛋白脫酰胺改性的最優(yōu)反應(yīng)條件。正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

表1 馬鈴薯蛋白酸法脫酰胺正交因素水平表

1.2.5 改性前后馬鈴薯蛋白質(zhì)部分功能性質(zhì)的測(cè)定［6］

1.2.5.1 溶解性能測(cè)定 準(zhǔn)確稱取改性前后的馬鈴薯蛋白各0.5g，分別溶于50mL蒸餾水中，配制成1% (W/V)的樣品溶液，平衡30min后于3000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min。吸取1mL上清液采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定溶解蛋白含量。

1.2.5.2 乳化活性及乳化穩(wěn)定性測(cè)定 準(zhǔn)確稱取改性前后的馬鈴薯蛋白各0.5g分別溶于0.02mol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖液中，配制濃度為1.0g/L的蛋白質(zhì)溶液，靜置30min使蛋白樣品充分浸潤(rùn)。

分別取30mL各蛋白溶液，加入10mL大豆色拉油，于室溫下，以10000r/min速度均質(zhì)1min后用微量注射器迅速從底部吸取乳化液100μL稀釋于裝有20mL的0.1g/L SDS溶液的比色管中，以0.1g/L SDS溶液為空白參比，立即用分光光度計(jì)在500nm下測(cè)定吸光值(A)，乳化活性(EA)用吸光值表示。

測(cè)定后的乳液在室溫下放置24h，在80℃加熱30min，冷卻至室溫，搖勻，按上述方法測(cè)定乳化活性(EA80)，并按照下式計(jì)算乳化穩(wěn)定性:

式中:ES－攪打后立即測(cè)定的乳化活性值; EA80－乳化液放置24h，并在80℃加熱30min破乳后所測(cè)定的乳化活性值。

1.2.5.3 持水性與吸油性測(cè)定 分別準(zhǔn)確稱取改性前后的馬鈴薯蛋白置于已干燥、稱重的10mL離心管中，準(zhǔn)確稱重，之后加入7mL蒸餾水(或大豆色拉油)，用細(xì)鋼絲攪拌，使樣品充分與水(油)混勻，在攪拌過程中盡可能地減少損失。將離心管在60℃水浴中加熱 30min，然后用冷水冷卻 30min，接著在2000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，去除上清液(或油)后再次準(zhǔn)確稱重離心管與沉淀總質(zhì)量。按下式計(jì)算持水性(或吸油性)。

式中:W0－分離蛋白樣品的質(zhì)量(g);W1－離心管和干燥樣品的總質(zhì)量(g);W2－離心后離心管和沉淀的總質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯蛋白酸法脫酰胺改性反應(yīng)條件的選擇

2.1.1 鹽酸濃度對(duì)酸法脫酰胺改性的影響 馬鈴薯蛋白與不同濃度的鹽酸在50℃下作用2h的結(jié)果見圖1。由圖1可知，馬鈴薯蛋白脫酰胺度隨著鹽酸濃度的增加而增加，當(dāng)鹽酸濃度達(dá)到0.4mol/L，脫酰胺度的增加趨緩。考慮到鹽酸濃度過高，會(huì)導(dǎo)致蛋白肽鍵的水解，因此鹽酸濃度0.4mol/L較為適宜。

圖1 鹽酸濃度對(duì)脫酰胺度的影響

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)酸法脫酰胺改性的影響 馬鈴薯蛋白與0.4mol/L鹽酸，在不同溫度下作用2h結(jié)果見圖2。由圖2可知，馬鈴薯蛋白質(zhì)的脫酰胺度隨反應(yīng)溫度的增加而提高，當(dāng)溫度介于60～80℃之間時(shí)，變化趨勢(shì)更為顯著，80℃后脫酰胺度提高幅度不大。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)脫酰胺度的影響

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酸法脫酰胺改性的影響 馬鈴薯蛋白與0.4mol/L鹽酸，在50℃下作用不同反應(yīng)時(shí)間結(jié)果見圖3，由圖3可知，反應(yīng)時(shí)間對(duì)馬鈴薯蛋白脫酰胺度有較大影響，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，馬鈴薯蛋白的脫酰胺度隨之增大，到2h后，脫酰胺度的增加趨于平緩。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)脫酰胺度的影響

2.2 馬鈴薯蛋白酸法脫酰胺改性條件的優(yōu)化

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 馬鈴薯蛋白酸法脫酰胺正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析表

經(jīng)驗(yàn)證，馬鈴薯蛋白脫酰胺化反應(yīng)的最佳條件為:鹽酸濃度0.5mol/L，80℃下反應(yīng)2.5h，此條件下馬鈴薯蛋白的脫酰胺度為44.76%。

2.3 脫酰胺改性對(duì)馬鈴薯蛋白功能性質(zhì)的比較

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)條件下得到的改性蛋白進(jìn)行功能性質(zhì)的測(cè)定，并隨行對(duì)照，比較結(jié)果見表3。

表3 馬鈴薯蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的比較

表3結(jié)果表明，除了吸油性未見明顯改善外，改性后的馬鈴薯蛋白溶解性、持水性及乳化性、乳化穩(wěn)定性較對(duì)照都有顯著增加。其原因主要是由于脫酰胺引起天冬酰胺和谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為天冬氨酸和谷氨酸，使凈電荷增加，對(duì)水的吸引能力增強(qiáng)。而在脫酰胺過程中可能存在的少量水解亦會(huì)引起蛋白質(zhì)溶解度的增大。

3 結(jié)論與討論

3.1 馬鈴薯蛋白脫酰胺改性的最適條件:鹽酸濃度0.5mol/L，80℃下反應(yīng)2.5h，此條件下馬鈴薯蛋白的脫酰胺度為44.76%。該脫酰胺度下，馬鈴薯蛋白的溶解性能、持水性及乳化性、乳化穩(wěn)定性較改性前樣品都有顯著增加，這與文獻(xiàn)報(bào)道的馬鈴薯蛋白含有較高天冬氨酸和谷氨酸相一致［7］，因此脫酰胺改性對(duì)馬鈴薯蛋白而言是有效的改性方法，有助于擴(kuò)大馬鈴薯蛋白的應(yīng)用范圍。

3.2 酸法脫酰胺改性是在酸性條件下的高溫反應(yīng)，必然伴隨著馬鈴薯蛋白的水解和變性過程，該過程的變化趨勢(shì)和這部分改變對(duì)馬鈴薯蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、功能性質(zhì)的影響以及脫酰胺度與馬鈴薯蛋白功能性質(zhì)的關(guān)系等問題將在今后的研究中進(jìn)一步深入探討。

［1］董奮強(qiáng)，崔英德，崔亦華，等.蛋白質(zhì)化學(xué)修飾及其工業(yè)應(yīng)用［J］.河南化工，2006，23(4):1－4.

［2］那治國(guó)，王成波，張浩，等.大豆蛋白酸法去酰胺改性及對(duì)蛋白溶解性的影響［J］.現(xiàn)代食品科技，2009，25(6):600－603.

［3］李紅梅，侯立琪，馬興勝.玉米蛋白去酰胺改性的研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2007(4):19－21.

［4］孔祥珍，周惠明.小麥面筋蛋白改性的研究［J］.食品科學(xué)，2003，24(12):47－50.

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［7］張澤生，劉素穩(wěn)，郭寶芹，等.馬鈴薯蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)［J］.食品科技，2007，23(11):219－221.

Preliminary research of modification of potato protein by acid deamidation

ZHANG Yi1，MA Chang－lu2，REN Hai－wei1，ZHANG Bai－gang1，ZHAO Ping1
(1.College of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China; 2.Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442，China)

Potato protein was deamidated by hydrochloric acid.The experiments showed that the optimal conditions: the concentration of HCl 0.5mol/L，reaction time 2.5h at temperature 80℃，the deamidation degree was 44.76%. After deamidation，the solubility，holding water capacity and emulsifying activity of potato protein were improved greatly.

potato protein;acid deamidation;modification

TS201.2+1

A

1002－0306(2011)12－0152－03

2011－08－30

張軼(1976－)，女，碩士，副教授，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

甘肅省自然科學(xué)研究基金(1107RJZA204)。