透性化處理提高黑曲霉細胞α-葡萄糖苷酶的表觀轉(zhuǎn)苷活力

陳桂光，李 瑋，符佳精，張云開，梁智群，*

(1.廣西大學生命科學與技術(shù)學院，廣西南寧530005; 2.廣西亞熱帶生物資源保護利用重點實驗室，廣西南寧530004; 3.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004)

透性化處理提高黑曲霉細胞α-葡萄糖苷酶的表觀轉(zhuǎn)苷活力

陳桂光1，2，李 瑋2，3，符佳精1，2，張云開1，2，梁智群1，2，*

(1.廣西大學生命科學與技術(shù)學院，廣西南寧530005; 2.廣西亞熱帶生物資源保護利用重點實驗室，廣西南寧530004; 3.廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004)

黑曲霉菌株D－597所產(chǎn)α－葡萄糖苷酶是胞內(nèi)酶，完整細胞呈現(xiàn)的酶活力較低。研究了吐溫－80、十六烷基溴化銨(CTAB)、乙醚、丙酮、戊二醛、乙醇等滲透劑的透性化效果，并對最適滲透劑戊二醛的透性化條件進行了優(yōu)化，最優(yōu)透性化處理條件為:每1g濕菌絲體添加30mL濃度為10%(v/v)的戊二醛溶液，處理溫度30℃，處理時間60min。制備所得的透性化細胞的表觀酶活達到483.9U/g濕菌體，是完整細胞表觀酶活的193.3%。使用透性化細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)低聚異麥芽糖(IMO)，其轉(zhuǎn)化周期為24h，較完整細胞縮短24h，轉(zhuǎn)化率保持在70%以上，具有一定的工業(yè)化應(yīng)用前景。

黑曲霉，低聚異麥芽糖，透性化，α－葡萄糖苷酶

功能性低聚糖因其具有多種獨特生理功能，正日漸廣泛地被應(yīng)用于食品工業(yè)當中。低聚異麥芽糖(Isomaltooligosaccharides，IMO)作為一種重要的低聚糖產(chǎn)品，味質(zhì)柔和，性質(zhì)穩(wěn)定，具有能促進人體內(nèi)益生菌－雙歧桿菌的生長繁殖、調(diào)理腸道功能、預(yù)防齲齒等諸多的保健作用［1－2］。通過添加IMO還能防止淀粉老化，延長食品的保存時間［3］。目前，低聚異麥芽糖主要是采用酶轉(zhuǎn)化法進行生產(chǎn)，先用高溫α－淀粉酶對淀粉漿進行液化，再用β－淀粉酶或真菌淀粉酶進行糖化，在糖化過程中或結(jié)束后添加α－葡萄糖苷酶催化淀粉糖化液進行轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，生成IMO糖漿［4］。雖然該生產(chǎn)工藝較為成熟，但需要大量使用價格較為昂貴的酶制劑，糖化及轉(zhuǎn)苷工序較繁雜，且產(chǎn)品糖漿中IMO的實際含量僅為50%～60%，這些都對低聚異麥芽糖產(chǎn)品生產(chǎn)成本的降低及后續(xù)精制造成了不利影響。黑曲霉具有較強的產(chǎn)生真菌淀粉酶及α－葡萄糖苷酶的能力，能夠使淀粉液化液轉(zhuǎn)化生成IMO糖漿。我們在先前的研究中選育獲得了一株產(chǎn)α－葡萄糖苷酶能力較強的黑曲霉菌株D－597，其能以高轉(zhuǎn)化率催化淀粉液化液生產(chǎn)IMO糖漿。由于具有轉(zhuǎn)苷活性的α－葡萄糖苷酶為胞內(nèi)酶，若直接用菌體催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)，細胞壁及細胞膜會阻礙底物及產(chǎn)物在細胞內(nèi)外的交換，造成酶的表觀活力較低。因此，本研究通過細胞透性化方法改善菌體通透性，提高α－葡萄糖苷酶的表觀轉(zhuǎn)苷活力，以進一步提高轉(zhuǎn)化生產(chǎn)IMO的效率，為IMO的生產(chǎn)提供新方法。

表1 不同滲透劑處理對α－葡萄糖苷酶表觀酶活的影響

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉(Aspergillus niger)D－597 廣西大學生命科學與技術(shù)學院食品與發(fā)酵工程研究所保藏;斜面種子培養(yǎng)基(g/L) 麥芽汁干粉20、瓊脂15、pH6;液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) 麩皮30、木薯淀粉200(經(jīng)α－淀粉酶液化);十六烷基三甲溴化銨(CTAB)、乙醚、乙醇、丙酮、戊二醛、吐溫－80 國藥集團化學試劑有限公司;葡萄糖、麥芽糖、異麥芽糖、麥芽三糖、潘糖、異麥芽三糖標準品 Sigma公司。

LC－10AT型高效液相色譜儀 日本島津公司; Labfors3 Fermentor 3L發(fā)酵罐 瑞士 infors－h(huán)t公司; METTLER TOLEDO 320 pH計、METTLER TOLEDO PL303精密電子天平 德國METTLER公司;SKY－211B振蕩培養(yǎng)箱、SKJH－1109超凈工作臺 上海蘇坤公司;SPX－250恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑曲霉D－597菌絲體的培養(yǎng) 取培養(yǎng)3d長滿成熟孢子的斜面，用無菌水將孢子洗下，轉(zhuǎn)移至盛有玻璃珠的100mL無菌三角瓶中，振蕩30min將孢子充分振蕩打散后，用血球計數(shù)板計算孢子數(shù)并調(diào)節(jié)孢子濃度至106個/mL。將所制得的孢子懸浮液按10%(v/v)的量接種到裝有2L液體發(fā)酵培養(yǎng)基的3L小試發(fā)酵罐中。培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度37℃，攪拌轉(zhuǎn)速400r/min，通氣量1L/min，培養(yǎng)時間60h。真空抽濾收集培養(yǎng)所得的菌絲體，用去離子水反復(fù)洗滌3次后用于透性化處理。

1.2.2 透性化處理方法 分別取1g黑曲霉菌絲體，各自懸浮于50mL pH5.0檸檬酸緩沖液配制而成的質(zhì)量濃度為5%的CTAB、吐溫－80溶液及體積比為5%的乙醚、乙醇、丙酮、戊二醛溶液中，30℃，160r/min振蕩60min，抽濾收集處理后的菌絲體，用上述檸檬酸緩沖液洗滌3次，測定α－葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷活力。

1.2.3 粗酶液的制備 采用國外已報道的α－葡萄糖苷酶粗酶液制備方法制備粗酶液［5］。

1.2.4 酶活測定方法 將得到的透性化細胞懸浮于50mL由pH5.0檸檬酸緩沖液配制而成的250g/L麥芽糖溶液中，于55℃、160r/min振蕩反應(yīng)1h后，沸水浴10min終止反應(yīng)。參照GB/T20881－2007《低聚異麥芽糖》強制性國家標準中IMO含量的檢測方法檢測反應(yīng)產(chǎn)物中異麥芽糖、潘糖的含量。

α－葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷活力單位的定義［5］:在上述條件下，每小時轉(zhuǎn)化生成1μmol異麥芽糖或潘糖所需的酶量為一個酶活單位U。透性化細胞表觀酶活力以U/g濕細胞表示［6］。

1.2.5 透性化處理對α－葡萄糖苷酶熱穩(wěn)定性的影響 分別將完整細胞、透性化細胞及由相同濕細胞量制備成的粗酶液，分別于30～70℃下保溫2h后，在酶轉(zhuǎn)苷反應(yīng)最適溫度55℃下測定其相對酶活力。

1.2.6 透性化黑曲霉細胞轉(zhuǎn)化木薯淀粉液化液生產(chǎn)IMO糖漿 各取3g(約相當于100mL發(fā)酵液中分離獲得的菌體細胞量)透性化細胞和完整細胞，分別與100mL淀粉含量為250g/L的淀粉液化液充分混勻，于55℃、160r/min振蕩條件下反應(yīng)，觀察IMO的生成情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 最適滲透劑的選擇

滲透劑提高胞內(nèi)酶表觀酶活的機理是改變細胞壁及細胞膜的通透性［7］，由于不同微生物的細胞壁及細胞膜的組成結(jié)構(gòu)不盡相同，所以需要試用多種不同滲透劑，對比其透性化處理效果，選擇最適的滲透劑。如表1所示，除乙醇處理的細胞表觀酶活反而低于完整細胞外，其余滲透劑均能不同程度地提高細胞α－葡萄糖苷酶的表觀酶活。其中經(jīng)戊二醛處理的細胞表觀酶活最高，故選擇戊二醛進行進一步研究。

2.2 戊二醛濃度對α-葡萄糖苷酶表觀酶活的影響

分別取1g黑曲霉菌絲體，各自懸浮于50mL pH5.0檸檬酸緩沖液配制而成的不同濃度戊二醛溶液中，在30℃下以160r/min振蕩60min，測定細胞的表觀酶活，結(jié)果如圖1所示。隨戊二醛濃度的增加，細胞的表觀酶活逐漸增加，當戊二醛濃度達到10% (v/v)時，細胞的表觀酶活達到最大值480.1U/g濕細胞，在此后繼續(xù)提高戊二醛的濃度，表觀酶活反而降低，且處理后的菌體顏色會由白色變?yōu)榛疑?，說明高濃度的戊二醛可能會導(dǎo)致酶變性失活。

圖1 戊二醛濃度對α－葡萄糖苷酶表觀酶活的影響

2.3 戊二醛處理時間對α-葡萄糖苷酶表觀酶活的影響

分別取1g黑曲霉菌絲體，各自懸浮于50mL pH5.0檸檬酸緩沖液配制而成的10%(v/v)戊二醛溶液中，在30℃下以160r/min振蕩不同的時間，測定細胞的表觀酶活，結(jié)果如圖2所示。當透性化處理時間為60min時，細胞的表觀酶活最高，過度延長處理時間反而會使細胞的表觀酶活下降。

圖2 戊二醛處理時間對α－葡萄糖苷酶表觀酶活的影響

2.4 戊二醛處理溫度對α-葡萄糖苷酶表觀酶活的影響

分別取1g黑曲霉菌絲體，各自懸浮于50mL pH5.0檸檬酸緩沖液配制而成的10%(v/v)戊二醛溶液中，在不同溫度下以160r/min振蕩60min，測定細胞的表觀酶活，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，在室溫下對黑曲霉菌絲體進行透性化處理，溫度對于表觀酶活的影響不大。

圖3 戊二醛處理溫度對α－葡萄糖苷酶表觀酶活的影響

2.5 戊二醛溶液最小用量的確定

分別取1g黑曲霉菌絲體，各自懸浮于不同體積的pH5.0檸檬酸緩沖液配制而成的10%(v/v)戊二醛溶液中，在30℃下以160r/min振蕩60min，測定細胞的表觀酶活，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，處理1g黑曲霉菌絲體以達到最佳透性化效果所需的戊二醛溶液量約為30mL，過多的戊二醛溶液添加量并不能進一步提高透性化的效果。

圖4 戊二醛用量對α－葡萄糖苷酶表觀酶活的影響

2.6 戊二醛處理對α-葡萄糖苷酶熱穩(wěn)定性的影響

分別將完整細胞、透性化細胞及粗酶液于不同溫度下保溫2h，測定其殘余酶活力。結(jié)果如圖5所示，完整細胞中α－葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性最佳，但其所表現(xiàn)出的表觀酶活較低;透性化細胞雖然由于細胞壁及細胞膜受到一定的破壞，熱穩(wěn)定性有所下降，但其在30～60℃保溫2h后的殘余酶活遠高于未經(jīng)處理的細胞;粗酶液中α－葡萄糖苷酶的活力雖高于同等質(zhì)量的完整濕細胞，但其熱穩(wěn)定性最差。說明透性化處理能在不嚴重影響α－葡萄糖苷酶熱穩(wěn)定性的情況下，大幅度提高細胞α－葡萄糖苷酶的表觀酶活性。

圖5 戊二醛處理對α－葡萄糖苷酶熱穩(wěn)定性的影響

2.7 透性化黑曲霉細胞轉(zhuǎn)化木薯淀粉液化液生產(chǎn)IMO

完整細胞與透性化細胞轉(zhuǎn)化木薯淀粉液化液生成IMO的轉(zhuǎn)化曲線如圖6所示。結(jié)果表明，透性化細胞轉(zhuǎn)化生成IMO的速度更快，其轉(zhuǎn)化周期由完整細胞所需的48h左右縮短至約24h;使用透性化細胞的轉(zhuǎn)化率為73.2%，完整細胞為75.0%，二者的轉(zhuǎn)化率大體相當。

圖6 透性化細胞與完整細胞轉(zhuǎn)化IMO的生成曲線對比

3 結(jié)論

目前國內(nèi)已報道的通過透性化處理提高細胞的胞內(nèi)酶表觀酶活的研究并不多［6－10］。本實驗采用戊二醛作為滲透劑，通過透性化處理成功的大幅度提高了黑曲霉細胞α－葡萄糖苷酶表觀酶活力。最優(yōu)透性化處理條件為:10%(v/v)戊二醛，30℃，處理時間60min，處理1g濕菌絲體需要30mL戊二醛溶液。經(jīng)最優(yōu)條件處理后，透性化細胞的酶活達到483.9U/g濕菌體，是完整細胞酶活的193.3%。使用制備出的透性化細胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)IMO，其轉(zhuǎn)化周期較完整細胞縮短了24h，轉(zhuǎn)化率保持在70%以上，高于傳統(tǒng)的IMO生產(chǎn)技術(shù)［4］，具有一定的工業(yè)化應(yīng)用前景。

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Permeabilization of Aspergillus niger for enhancing apparent transglucosylation activity of α－glucosidase

CHEN Gui－guang1，2，LI Wei2，3，F(xiàn)U Jia－jing1，2，ZHANG Yun－kai1，2，LIANG Zhi－qun1，2，*
(1.College of life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530005，China; 2.Guangxi Key Laboratory of Subtropical Bioresources Conservation and Utilization，Nanning 530004，China; 3.College of Light Industry and Food Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China)

α－glucosidase was an intracellular enzyme in Aspergillus niger.The whole cells of Aspergillus niger exhibited low transglucosylation activity.Various chemical agents such as tween－80，cetyltrimethylammoinium bromide，diethyl ether，acetone，glutaral and ethanol were used to permeabilize the mycelium and demonstrated that glutaral was the most effective of them.The maximum transglucosylation activity(483.9U/g wet cells，increased by 93.3%compared to the whole cells)was obtained when cells were treated with 30mL 10%(v/v)glutaral per gram wet cells at 30℃ for 60min.The permeabilized Aspergillus niger cells convert liquefied cassava starch to isomaltooligosaccharides(IMO)within 24h(shorten by 24h than the whole cells)，the IMO yield accounted for 70%，demonstrating the research had great potential on IMO industrial production.

Aspergillus niger;isomaltooligosaccharides;permeabilization;alpha－glucosidase

TS201.2+5

A

1002－0306(2011)12－0072－04

2010－12－14 *通訊聯(lián)系人

陳桂光(1963－)，男，學士，副教授，主要從事食品與發(fā)酵工程方面的研究工作。

國家自然科學基金項目(20362001);國家“863”項目(2006AA10Z339)。