辛伐他汀對動脈粥樣硬化大鼠凋亡相關(guān)基因Fas及FasL蛋白表達(dá)的影響

胡司淦柴大敏喬琛琛 邵 杉 吳士禮 高大勝 王洪巨

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管科,安徽 233004;1蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,安徽 233030)

辛伐他汀對動脈粥樣硬化大鼠凋亡相關(guān)基因Fas及FasL蛋白表達(dá)的影響

胡司淦＊柴大敏1喬琛琛 邵 杉 吳士禮 高大勝 王洪巨

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管科,安徽 233004;1蚌埠醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室,安徽 233030)

目的 通過研究辛伐他汀對動脈粥樣硬化大鼠血管壁中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Fas及FasL蛋白表達(dá)產(chǎn)物的影響,探討其在預(yù)防動脈粥樣硬化發(fā)生中的可能機制。方法 復(fù)制動脈粥樣硬化大鼠模型,以辛伐他汀干預(yù),取胸主動脈,觀察其斑塊變化,采用免疫組化Elivision法測定動脈粥樣硬化血管壁中Fas、FasL蛋白表達(dá)。結(jié)果 Fas蛋白表達(dá)在實驗組明顯高于對照組及干預(yù)組(P<0.01,P<0.05),實驗組FasL蛋白表達(dá)也明顯高于對照組及干預(yù)組(P<0.05)。結(jié)論 Fas及 FasL基因通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用而誘發(fā)動脈粥樣硬化過程,辛伐他汀可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。

辛伐他汀; 動脈粥樣硬化; 細(xì)胞凋亡; 免疫組織化學(xué)

近年來研究證實細(xì)胞凋亡在動脈粥樣硬化中扮演重要角色,認(rèn)為細(xì)胞凋亡與斑塊形成、不穩(wěn)定、破裂和血栓形成有關(guān)[1]。在粥樣斑塊中的各型細(xì)胞,包括血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均存在不同程度的凋亡,特別是平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖和凋亡參與斑塊的形成和破裂[2],并且Frostegard等研究[3]發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)和血管細(xì)胞(包括血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞)在通過凋亡和增殖維持自身穩(wěn)態(tài)中可能存在交叉反應(yīng)。目前認(rèn)為干預(yù)細(xì)胞凋亡過程對阻止動脈粥樣硬化發(fā)展可能有重要意義。國內(nèi)外他汀類的臨床試驗證實其可以降低血脂,降低心血管病事件的發(fā)生率,即穩(wěn)定斑塊作用;改善血管內(nèi)皮功能;減少或消除血管炎癥反應(yīng)。雖然其穩(wěn)定斑塊的機制尚不完全清楚,但已發(fā)現(xiàn)后者不能完全用他汀類的降脂作用來解釋。有作者發(fā)現(xiàn)應(yīng)用他汀類藥物后,動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細(xì)胞凋亡與增殖在發(fā)生改變,推測該變化可能影響了斑塊的穩(wěn)定性[4]。有關(guān)他汀類對粥樣斑塊中細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機制的在體研究報道罕見。我們旨在通過他汀藥物辛伐他汀對動脈粥樣硬化斑塊中細(xì)胞凋亡基因蛋白產(chǎn)物的影響,以進(jìn)一步探索細(xì)胞凋亡在動脈粥樣硬化斑塊中的作用以及他汀類藥物干預(yù)的可能作用機制。

材料和方法

1.實驗動物與試劑

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠 36只,清潔級,體重80-100g,購自浙江省實驗動物中心,許可證號SCXK(浙)20080033。維生素D3購自上海通用藥業(yè)股份有限公司,批號:080604;丙基硫氧嘧啶購自上海朝暉藥業(yè)有限公司,批號:081103;膽酸鈉及膽固醇均購自安徽天啟化工科技有限公司;豬油為市售食用豬油;辛伐他汀(舒降之)購自杭州默沙東制藥有限公司,批號:100015。

2.大鼠動脈粥樣硬化模型建立[5]

36 只SD大鼠入住動物實驗室后以標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機分為對照組(n=10)、實驗組(n=13)、干預(yù)組(n=13),對照組大鼠喂食普通飼料,實驗組和干預(yù)組大鼠首先一次性腹腔注射維生素D3(60萬IU/kg),對照組給予同等體積的生理鹽水,然后喂食高脂飼料即3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎(chǔ)飼料。6周后,干預(yù)組大鼠加以辛伐他汀(5mg/kg/D)灌胃,對照組和實驗組予以同等體積的生理鹽水灌胃,繼續(xù)喂養(yǎng)4周。所有大鼠均分籠按清潔級動物飼養(yǎng),飲用潔凈水,整個試驗周期為11周。

3.標(biāo)本的收集與處理

各組動物于實驗結(jié)束時行空腹心臟取血,分離血清,用Olympus AU5400全自動生化分析儀檢測血清膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白水平。并于實驗結(jié)束時將所有大鼠處死,立即取胸主動脈,用10%福爾馬林液固定,石蠟包埋、切片、HE染色光鏡觀察主動脈的形態(tài)。

4.免疫組化方法

Fas試劑購自武漢博士德生物公司,FasL購自Santa Cruz公司。應(yīng)用免疫組化Elivision方法對9例對照組,11例實驗組及12例干預(yù)組大鼠進(jìn)行Fas、FasL蛋白表達(dá)檢測,操作步驟按說明書進(jìn)行。

5.結(jié)果判定

Fas和FasL的陽性著色定位于血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的細(xì)胞漿或細(xì)胞膜,出現(xiàn)棕黃色顆粒。每張切片隨機觀察10個高倍視野,每個視野計數(shù)200個細(xì)胞,統(tǒng)計陽性細(xì)胞數(shù)及觀察顯色度,陽性強度用半定量法,按陽性細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)評分:陽性細(xì)胞<10%為0分,10%-50%為1分,51%～75%為2分,>75%為3分。細(xì)胞不著色為0分,淺黃為1分,黃色為2分,棕褐色為3分。兩者分?jǐn)?shù)相乘0分為陰性(-),1-4分為弱陽性(+),>4分為中強度陽性(++)。

6.統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

實驗過程中4只大鼠發(fā)生死亡,其中對照組1只,實驗組2只,干預(yù)組1只。

1.三組血脂水平變化

實驗結(jié)束時三組動物均心臟取血,檢測血脂,結(jié)果顯示實驗組血清膽固醇、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)均顯著高于對照組及干預(yù)組(P<0.01),甘油三酯(Triglyceride,TG)水平三組間無明顯差異,高密度脂蛋白(High density lipoprotein HDL)水平在對照組均明顯高于實驗組及干預(yù)組(P<0.01)。見表 1。

表1 三組血清血脂水平比較(±s)(mmol/l)Table 1 The level of serum lipid in three groups(±s)(mmol/l)

表1 三組血清血脂水平比較(±s)(mmol/l)Table 1 The level of serum lipid in three groups(±s)(mmol/l)

＊P<0.01,compared with control group;#P<0.01,compared with experimental group

Groups cases Total cholesterd TG HDL LPC對照組(Control group)實驗組(Experimental group)干預(yù)組(Intervention group)9 11 12 1.49 ±0.47 4.68 ±1.93 ＊2.50 ±0.46#1.46 ±0.51 2.02 ±1.29 1.59 ±1.20 2.59 ±0.92 0.80 ±0.39＊1.00 ±0.31＊0.63 ±0.07 1.92 ±0.87＊1.01 ±0.17#

2.病理形態(tài)學(xué)改變

光鏡下對照組升主動脈內(nèi)膜薄且結(jié)構(gòu)完整、規(guī)則,未見斑塊,中膜、外膜形態(tài)規(guī)則,分界清楚;實驗組內(nèi)膜明顯增厚,脂質(zhì)斑塊彌漫,內(nèi)有泡沫細(xì)胞大量積聚,覆蓋于整個管腔表面,平滑肌細(xì)胞排列紊亂,中膜彈力纖維增粗,彈力纖維和膠原纖維排列紊亂;干預(yù)組僅局部存在斑塊、泡沫細(xì)胞數(shù)目減少、體積變小、胞內(nèi)空泡明顯減少,內(nèi)膜增生程度低于實驗組,彈力纖維和膠原纖維排列也較實驗組規(guī)則。見圖1。

3.免疫組化結(jié)果

免疫組化結(jié)果表明,凋亡相關(guān)基因Fas和FasL在三組中均有不同程度的表達(dá),陽性顆粒主要存在于細(xì)胞膜、細(xì)胞漿,呈棕黃色,在血管壁的巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及淋巴細(xì)胞表達(dá)明顯。2種基因表達(dá)水平在對照組、實驗組及干預(yù)組蛋白表達(dá)量各不相同。Fas蛋白表達(dá)水平在實驗組明顯高于對照組及干預(yù)組(P<0.01,P<0.05)見表 2、圖 2,FasL 蛋白表達(dá)在實驗組明顯高于對照組及干預(yù)組(P<0.05)見表 3、圖 3。

表2 三組Fas蛋白的表達(dá)水平比較Table 2 The expression level of Fas protein in three groups

表3 三組FasL蛋白的表達(dá)水平比較Table 3 The expression level of FasL protein in three groups

討 論

目前研究認(rèn)為冠狀動脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定發(fā)生破潰破裂繼發(fā)血栓形成導(dǎo)致冠狀動脈急性完全或部分堵塞是產(chǎn)生冠狀動脈事件的重要原因。近來的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)貫穿于冠狀動脈內(nèi)粥樣斑塊的發(fā)生與發(fā)展以及斑塊的破潰破裂過程的全過程[6,7]。細(xì)胞凋亡(又稱程序性死亡)參與動脈粥樣硬化斑塊的形成發(fā)展以及易損斑塊的形成和破裂過程。目前我們對其在動脈粥樣硬化中的具體發(fā)生機制及其后果仍不清楚,但有研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡可能啟動動脈的粥樣硬化過程,局部血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的凋亡則更多地參與易損斑塊的形成以及斑塊的破裂[8]。

Bennett[9]指出冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的細(xì)胞凋亡主要是由Fas和 FasL所介導(dǎo)。Fas抗原系統(tǒng)主要表達(dá)于激活的 T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞和血管細(xì)胞的表面,這些細(xì)胞上的Fas與FasL結(jié)合后介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡過程[10]。研究[11]也發(fā)現(xiàn) Fas系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)動脈粥樣斑塊中血管平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞的凋亡過程。在動脈內(nèi)膜損傷時Fas有異常表達(dá),血管平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡受Fas-FasL系統(tǒng)的調(diào)控[12]。Boylle JJ[13]等提出 Fas抗原表達(dá)增高介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞凋亡增多、纖維帽張力下降可直接導(dǎo)致斑塊破裂參與急性冠脈事件的發(fā)生。并且研究也發(fā)現(xiàn)Fas基因啟動子區(qū)域的基因多態(tài)性可增加急性心肌梗死的發(fā)生率[14]。在本研究中實驗組Fas及 FasL蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P<0.01,P<0.05),Fas及 FasL蛋白在動脈粥樣硬化血管壁中的高表達(dá)表明動脈粥樣硬化血管較正常血管存在較多的細(xì)胞凋亡,Fas與FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡參與動脈粥樣硬化的形成過程,并且也發(fā)現(xiàn) Fas與FasL主要表達(dá)于血管壁的巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的細(xì)胞漿及細(xì)胞膜上。目前有很多臨床實驗證實他汀類藥物可以減少冠心病的死亡和心肌梗死的發(fā)生,他們可以通過減少斑塊表面的細(xì)胞凋亡而穩(wěn)定斑塊。他汀類藥物可直接影響細(xì)胞的生存,并且具有在斑塊內(nèi)的抗炎作用從而抑制炎癥細(xì)胞觸發(fā)的細(xì)胞凋亡。他汀類藥物通過影響eNOS的產(chǎn)生抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。早期應(yīng)用他汀類藥物可抑制激活 T淋巴細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,從而減少血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,防止易損斑塊破裂,預(yù)防冠脈事件發(fā)生[15]。在體外實驗中他汀類藥物可以很大程度的增加血管平滑肌細(xì)胞的凋亡[16],然而在體內(nèi)的動物實驗和人體實驗中表現(xiàn)為他汀類藥物在減少膽固醇的同時可以減少斑塊的血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的凋亡[4],并且表現(xiàn)出獨立于降低膽固醇以外的抗凋亡作用。本研究中實驗組與干預(yù)組比較,實驗組Fas及FasL蛋白表達(dá)明顯高于干預(yù)組(P<0.05),而干預(yù)組與對照組比較,Fas與FasL蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義,表明辛伐他汀可通過調(diào)節(jié)Fas及FasL的表達(dá)影響血管細(xì)胞的細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。

細(xì)胞凋亡現(xiàn)象可發(fā)生于動脈粥樣硬化斑塊的各種細(xì)胞中,并且表現(xiàn)隨著斑塊的發(fā)展變的越來越重要。它參與斑塊的產(chǎn)生、脂核的形成、斑塊破裂和血栓形成,目前我們對于它們的調(diào)節(jié)過程仍不十分清楚。細(xì)胞凋亡在不同的細(xì)胞和在不同的局部或全身因素的作用下表現(xiàn)為不同的調(diào)節(jié)機制。目前對動脈粥樣硬化中細(xì)胞凋亡靶點的干預(yù)主要集中在減少斑塊中細(xì)胞的凋亡,對于動脈粥樣硬化斑塊的凋亡機制和調(diào)節(jié)方式的研究值得我們更深一步探討。

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圖 版 說 明

圖1 血管組織 HE染色結(jié)果,1A表示對照組,1B表示實驗組,1C表示干預(yù)組。(HE染色×400)。

圖2 Fas蛋白在三組中表達(dá)水平不同,圖2A示Fas蛋白在對照組低表達(dá),圖2B示 Fas蛋白在實驗組高表達(dá),圖2C示 Fas蛋白在干預(yù)組中表達(dá)。(Elivision法 ×100)。

圖3 FasL蛋白在三組中表達(dá)水平不同,圖2A示FasL蛋白在對照組低表達(dá),圖2B示 FasL蛋白在實驗高表達(dá),圖2C示FasL蛋白在干預(yù)組中表達(dá)。(Elivision法×100)。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 HE staining of vascular tissue. 1A is control group.1B is experimental group.1C is intervention group.(HE staining ×400).

Fig.2 The expression level of Fas protein was different in three groups.2A show lower expression of Fas protein in the control group.2B show high expression of Fas protein in the experimental group.2C show moderate expression of Fas protein expression in the intervention group. (Elivision method ×100).

Fig.3 The expression level of FasL protein was different in three groups.3A show lower expression of FasL protein in the control group.3B show high expression of FasL protein in the experimental group. 3C show moderate expression of FasL protein expression in the intervention group. (Elivision method ×100).

E ffect of simvastatin on apoptosis related genes fas and fasl protein expression

Hu Sigan,Chai Damin1,Qiao Chenchen,Shao Shan,Wu Shili,Gao Dasheng,Wang Hongju

(Department of Cardiovasology,First A f f iliated Hospital,Bengbu Medical College,A nhui233004;1Department ofPathology,Bengbu Medical College,A nhui233030,China)

Objective To investigate the effect of simvastatin on the protein expression of apoptosis relate genes Fas and FasL in atherosclerotic rats,and explore the possible mechanism of simvastatin in preventing atherosclerosis.Methods We made the rat model of atherosclerosis,with simvastatin intervention,and took the thoracic aortato observe the plaque.The expressions of Fas and FasL protein were determined using Elivision immunohistochemical technique.Results The positive rates of Fas expressions in the experimental group were higher than those in the control group and the intervention group(P<0.01,P<0.05).The expression of FasL protein in the experimental group was also obviously higher than that in the control group and the intervention group(P<0.05). Conclusion Fas and FasL genes can accelerate the process of apoptosis during atherosclerosis.Simvastatin acts against atherosclerosis by adjusting cell apoptosis.

Simvastatin; Atherosclerosis; Apoptosis; Immunohistochemistry

R329

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.013

2010-11-30

2011-02-20

蚌埠醫(yī)學(xué)院科研課題資助(BY0855)

胡司淦,男(1979年),漢族,主治醫(yī)師。

＊通訊作者(To whom correspondence should be addressed)