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    南五味子葉綠體DNA的提取

    2011-10-26 07:22:30湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院李俊雅
    河南科技 2011年9期
    關(guān)鍵詞:葉綠體烷基五味子

    湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院 李 君 李俊雅

    河南羚銳制藥股份有限公司 袁德先

    南五味子葉綠體DNA的提取

    湘潭職業(yè)技術(shù)學(xué)院 李 君 李俊雅

    河南羚銳制藥股份有限公司 袁德先

    隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RandomAmplifiedPolymorphic DNA,RAPD)是在DNA水平上進(jìn)行遺傳標(biāo)記的常用分析方法之一。在操作過程中,DNA的提取質(zhì)量是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果最為關(guān)鍵的因素。本文,筆者在對(duì)五味子進(jìn)行分子生物學(xué)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)南五味子葉中多酚、多糖、蛋白質(zhì)等復(fù)雜的次生、初生代謝物質(zhì),給葉綠體DNA提取造成很大的影響。因此,本文,筆者對(duì)傳統(tǒng)的葉綠體DNA提取方法進(jìn)行了改良,對(duì)南五味子葉綠體DNA的提取方法進(jìn)行了研究,在確定有效的提取方法并獲得高質(zhì)量的葉綠體DNA后,為下一步優(yōu)選適合的RAPD條件創(chuàng)造了條件。

    一、材料與試劑

    1.實(shí)驗(yàn)材料。南五味子葉片由貴州GAP基地提供,葉片臨用前先用去離子水浸泡,使其變軟,展開,洗去表面灰塵,然后用酒精棉球擦拭其表面,以達(dá)到滅菌的目的,防止外源性DNA的污染,晾干或用吸水紙吸干備用。

    2.試劑。液態(tài)氮,PVP(聚乙烯基吡咯烷酮),提取緩沖液A(50mmol/L Tris-HClpH=3.6,25mmol/L EDTA,1.25mol/L NaCl),提取緩沖液B(50mmol/LTris-HClpH=3.6,25mmol/L EDTA,1.25mol/LNaCl,10mmol/Lβ-巰基乙醇),提取緩沖液C(0.15mol/LNaCl,100mMEDTApH=8.0),提取緩沖液D(50mmol/LTris-HClpH=8.0,25mMEDTA),提取緩沖液E(0.35mol/L 山 梨 醇 ,100mmol/L Tris-HClpH=8.0,5mM EDTA),β-巰基乙醇,MgCl2(1mol/L),10%SDS(十二烷基磺酸鈉),10%十二烷基肌氨酸鈉,蛋白酶K。以上Tris(三(羥甲基)氨基甲烷)、蛋白酶K及RNaseA(核糖核酸酶A)均為上海生工試劑,其他為市售分析純。UNIQ-10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒(SK1203,Sangon)。

    二、實(shí)驗(yàn)方法

    在常規(guī)的葉綠體DNA提取方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行方法學(xué)考察。

    1.常規(guī)的葉綠體DNA提取方法。取干燥葉片1.5~2g,4℃暗處理過夜,沖洗干凈,吸干水分,去中脈,剪碎后置勻漿器中,加入5倍體積4℃預(yù)冷的緩沖液A,勻漿;用8~10層無菌細(xì)布過濾,濾液于4℃ 2500r·min-1離心10min;棄去上清液;沉淀加入10ml緩沖液B(其中10mmol/Lβ-巰基乙醇用前加入),輕輕懸浮,4℃ 2500r·min-1離心8min;棄上清,沉淀(可用緩沖液B再洗一次)用少量5ml緩沖液C懸浮沉淀,4℃下4000rpm離心10min,此沉淀即為純化的葉綠體。

    上述葉綠體沉淀加入50μg蛋白酶K(20mg/ml)和10%的SDS2ml,37℃保溫2h;用等體積的氯仿:異戊醇(24∶1)抽提3次,上清液加1/10體積0.2mol/LNaAc和2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇,-20℃放置過夜;10000rpm離心30min收集沉淀,20ml 70%乙醇沖洗一遍,室溫放置15min,12000rpm離心10min,風(fēng)干,溶于1000μlTE,加入1/100體積的5mg/mlRNA酶,37℃保溫0.5h;再加1/200體積蛋白酶K(10mg/ml),繼續(xù)保溫1h;氯仿:異戊醇(24∶1)抽提后,無水乙醇沉淀,70%乙醇洗,真空抽干,用50μl去離子水溶解DNA沉淀,-20℃冰箱保存。

    2.方法學(xué)考察。在常規(guī)提取方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn),見圖1。

    方法1。樣品加入10%PVP粉末,在研缽中加提取緩沖液A研磨。

    方法2。純化的葉綠體沉淀加入2.5ml緩沖液B(無β-巰基乙醇),19μlDNaseI,1mlMgCl2(1mol/L)冰浴1h,后加200μl EDTA終止反應(yīng),離心,棄上清。

    方法3。用少量5ml緩沖液C懸浮沉淀,離心,棄上清后加入冷藏的提取緩沖液E懸浮沉淀,冰上放置10min,離心,棄去上清液,沉淀即為純化的葉綠體。

    方法4。加入10ml緩沖液D懸浮,加1/20體積10%十二烷基硫酸鈉(SDS),l/5體積10%十二烷基肌氨酸鈉及1/200體積10mg/ml蛋白酶K,充分搖勻,37℃保溫3h,其間不斷輕輕搖勻,其余同常規(guī)的方法。

    方法5。加入10ml緩沖液D懸浮,加1/20體積10%十二烷基硫酸鈉(SDS),l/5體積10%十二烷基肌氨酸鈉1/200體積10 mg/ml蛋白酶K,充分搖勻,37℃保溫3h,其間不斷輕輕搖勻,其余同常規(guī)的方法。

    方法6。綜合方法1、2、3和5,余下步驟同常規(guī)的提取方法。

    方法7。同方法6,接下來用UNIQ-10柱處理,-20℃冰箱保存。

    根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,確定南五味子葉綠體DNA的提取方法:

    稱取硅膠快速干燥的葉片1.5~2g,4℃暗處理過夜,沖洗干凈,吸干水分,去中脈,剪碎后置研缽中,加入10%的PVP粉末和冷藏的提取緩沖液A研磨;用8~10層無菌細(xì)布過濾,濾液于4℃ 2300r·min-1離心10min;棄去上清液;沉淀加入10ml緩沖液B(其中200μL10mmol/Lβ-巰基乙醇用前加入),輕輕懸浮,4℃ 2300r·min-1離心8min;棄上清,沉淀可用緩沖液B再洗一次;加2.5ml緩沖液B(無β-巰基乙醇),19μlDNaseI,1mlMgCl2(1mol/L)冰浴1h,后加200μlEDTA終止反應(yīng),離心,棄上清;加入冷藏的提取緩沖液E,冰上放置10min,4℃,3000r/min離心10min,棄上清,沉淀即為純化的葉綠體,并用分光光度計(jì)測(cè)量上清液;加入10ml緩沖液D懸浮,加1/20體積10%十二烷基硫酸鈉(SDS),l/5體積10%十二烷基肌氨酸鈉,1/200體積10mg/ml蛋白酶K及100μlβ-巰基乙醇,充分搖勻,37℃保溫3h,其間不斷輕輕搖勻;用等體積的氯仿:異戊醇(24∶1)抽提3次,上清液加1/10體積0.2mol/LNaAc和2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇,-20℃放置過夜;12000rpm離心15min收集沉淀,70%乙醇沖洗一遍,室溫放置15min,12000rpm離心10min,風(fēng)干,溶于1000μlTE;加入1/ 100體積的5mg/mlRNA酶,37℃保溫0.5h;加1/200體積蛋白酶K(10mg/ml),繼續(xù)保溫1h;氯仿:異戊醇(24∶1)抽提后,乙醇沉淀,70%乙醇洗,真空抽干,用50μl去離子水溶解cpDNA沉淀;保存于-20℃冰箱保存。

    三、結(jié)果與分析

    高質(zhì)量的DNA模板是RAPD成功的關(guān)鍵因素之一,因此選用最佳的葉綠體DNA提取及純化方法是實(shí)驗(yàn)成功的根本保證。

    電泳檢測(cè):取10μlcpDNA提取物,在1.2%的瓊脂糖凝膠上用1×TAE電泳緩沖液電泳,0.5ng/mlEB染色,紫外檢測(cè),拍照。紫外檢測(cè)結(jié)果見圖2。

    四、討論

    1.目前對(duì)葉綠體DNA的提取多采用蔗糖梯度離心等方法,所提取的葉綠體DNA純度高無降解是做RAPD等分子標(biāo)記的理想方法,但本文筆者提取葉綠體DNA的方法其效果同樣非常理想。所提取cpDNA在純度完整性上都可以滿足RAPD的要求。

    2.在提取cpDNA中分別采用了硅膠快速干燥的材料和新鮮的材料,提取結(jié)果顯示新鮮材料純度高、無降解,而快速干燥的樣品則有少許降解現(xiàn)象,所以cpDNA提取最好使用新鮮材料。本實(shí)驗(yàn)選擇了采用硅膠快速干燥的葉片提取效果較好,而且采集葉片的方法簡(jiǎn)單易行,比較適合實(shí)驗(yàn)研究。

    3.在提取之前先對(duì)葉片進(jìn)行暗處理和潔凈處理,能夠消耗一部分糖類并有效地避免外源性DNA的污染。在分離葉綠體時(shí),于2300r/min離心,目的是盡量減少細(xì)胞核,但同時(shí)保證盡量多的完整葉綠體。

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