應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)感染斑馬魚體內(nèi)的傳染性造血器官壞死病毒

吳 斌 孫銘英 肇慧君

1. 遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116001；2. 鐵嶺出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 鐵嶺 112400

應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)感染斑馬魚體內(nèi)的傳染性造血器官壞死病毒

吳 斌1孫銘英2肇慧君1

1. 遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116001；2. 鐵嶺出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 鐵嶺 112400

IHNV-DL是一株經(jīng)過純化鑒定的傳染性造血器官壞死病毒。體外擴(kuò)增的IHNV-DL經(jīng)人工方法感染健康斑馬魚，運(yùn)用原位雜交技術(shù)，對(duì)感染后出現(xiàn)明顯傳染性造血器官壞死病癥狀并進(jìn)行了PCR鑒定呈陽(yáng)性的病魚頭部、內(nèi)臟組織切片進(jìn)行IHNV-DL分子定位和檢測(cè)。結(jié)果顯示，病魚體內(nèi)普遍存在病毒，腦部和內(nèi)臟含量較高。本實(shí)驗(yàn)建立了一種傳染性造血器官壞死病毒的檢測(cè)方法，初步確定了傳染性造血器官壞死病毒在病魚體內(nèi)不同組織的分布情況。

傳染性造血器官壞死病毒；斑馬魚；人工感染；原位雜交

傳染性造血器官壞死病毒屬?gòu)棤畈《究浦Z拉彈狀病毒屬，是傳染性造血器官壞死病的病原體，能引起鮭、鱒等經(jīng)濟(jì)魚類發(fā)生流行性病害。過去IHN只流行于北美洲和歐洲一些國(guó)家，近年來隨著水生動(dòng)物進(jìn)出口貿(mào)易的增加，IHN已經(jīng)傳入我國(guó)，并在一些地區(qū)流行，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是口岸魚類的第一類檢疫對(duì)象。

IHNV的傳統(tǒng)檢測(cè)方法是根據(jù)典型癥狀進(jìn)行初步診斷，再通過細(xì)胞分離病毒進(jìn)行確認(rèn)。最后通過免疫學(xué)方法，如中和試驗(yàn)和ELISA；或者分子生物學(xué)方法，如PCR方法和DNA探針法進(jìn)行鑒定。

原位雜交可以對(duì)組織切片中不同細(xì)胞，不同部位靶基因進(jìn)行精確定位。及特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，因此能夠作為一種很好的水生動(dòng)物動(dòng)物病毒定位檢測(cè)方法。

本研究利用IHNV核蛋白基因的高保守高特異性通過巢式PCR擴(kuò)增出一條323bp的片段，DIG標(biāo)記為探針，建立測(cè)定IHNV在病魚體各組織中分布情況的原位雜交方法。初步確定了IHNV在病魚體內(nèi)存在的部位，為進(jìn)一步研究IHNV的發(fā)病機(jī)理提供了基礎(chǔ)材料。

1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚：

健康斑馬魚購(gòu)自大連市鳥語(yǔ)花市。

1.2 病毒毒株：

IHNV-DL由遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局實(shí)驗(yàn)室純化保存。

1.3 合成分子探針的引物：

本試驗(yàn)中使用的引物為擴(kuò)增IHNV核蛋白基因的兩對(duì)通用引物，巢式擴(kuò)增323bp的目的片段：

由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.4 試劑：

OMEGA凝膠回收試劑盒，羅氏地高辛DNA高效標(biāo)記檢測(cè)試劑盒。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 病毒液的制備：

利用RTG-2細(xì)胞對(duì)IHNV病毒的敏感性體外擴(kuò)增IHNV-DL病毒，并用Reechman方法測(cè)定病毒滴度為10-5.563/0.1ml。

2.2 人工感染：

購(gòu)買的斑馬魚經(jīng)過一周飼養(yǎng)確定沒有病變癥狀，將20條魚分成2組（對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各10條）。將2組魚飼養(yǎng)在10℃水箱中，將病毒液按1:1000比例投入實(shí)驗(yàn)組，適應(yīng)性感染3天。在對(duì)實(shí)驗(yàn)組斑馬魚進(jìn)行背鰭基部肌肉注射滴度在105左右的IHNVDL病毒液5μL進(jìn)行強(qiáng)化。注射后每天觀察記錄狀態(tài)并持續(xù)飼養(yǎng)直至實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)明顯的病變癥狀。

2.3 病魚的PCR鑒定：

出現(xiàn)典型癥狀的病魚加入CTAB研磨，并用Trizol法提取病毒RNA。

2.4 探針的制備

2.4.1 制作模板DNA：

病毒液按照Tizol法提取病毒RNA，再按文獻(xiàn)[6]的方法經(jīng)第一對(duì)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，擴(kuò)增出一條786bp的片段。PCR產(chǎn)物按照國(guó)標(biāo)的方法經(jīng)第二對(duì)引物擴(kuò)增出一條323bp的片段。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。按照凝膠回收試劑盒說明對(duì)PCR擴(kuò)增出的323bp片段進(jìn)行回收。

2.4.2 地高辛標(biāo)記：

按照地高辛DNA高效標(biāo)記檢測(cè)試劑盒說明，將回收的323bp片段標(biāo)記成DIG-323探針。

2.4.3 探針濃度的選擇：

按照地高辛DNA高效標(biāo)記檢測(cè)試劑盒說明，選擇適合的探針濃度。

2.5 切片的制作

實(shí)驗(yàn)組病魚經(jīng)10%甲醛固定24h后，分成頭部、內(nèi)臟和尾臀三部分。經(jīng)過梯度酒精脫水，二甲苯透明，最后石蠟包埋。切片待檢。頭部取腦、眼處橫切片，內(nèi)臟部取內(nèi)臟部分中間處切片，尾臀取有最大橫切面積的切片。

2.6 原位雜交檢測(cè)

將載有病魚切片的玻片恒溫60℃ 45min水化，隨后經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化；加入含100mg/L蛋白酶K的PBS，37℃消化15min；預(yù)冷的0.4%甲醛室溫固定5min；2×SSC（0.3M NaCl，0.03M枸櫞酸鈉，pH7.0）室溫漂洗5min；500μ L預(yù)雜交液（4×SSC，50%甲酰胺，0.02% BSA，0.02%聚蔗糖，0.02% PVP，5%硫酸葡聚糖）37℃預(yù)雜交30min；加入含有0.6ng/μL DIG-323探針溶液的雜交液250μL，42℃雜交2h。依次37℃，2×SSC漂洗30min,1×SSC漂洗5min，0.5×SSC漂洗5min；室溫BufferⅠ（0.1M Tris-HCl，0.15M NaCl，pH 7.5）洗片5min；37℃加入500μL含5%阻斷劑的BufferⅡ阻斷15min；37℃加入500μL含有1/1000抗DIG堿性磷酸酶復(fù)合物中孵育30min；室溫BufferⅠ洗片10min，BufferⅢ（100mM Tris-HCl，100mM NaCl，50mM MgCl2，pH 9.5）平衡5min；滴加500μL顯色液（75mg/mL NBT，50mg/mL BCIP），室溫避光顯色3h；室溫BufferⅣ終止反應(yīng)15min；0.5%皮斯麥棕復(fù)染色5min。梯度乙醇脫水，二甲苯置換10min。樹膠封片鏡檢。可見陽(yáng)性信號(hào)成黑紫色。結(jié)果用照片顯示。

同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照：

以對(duì)照組健康斑馬魚為材料制作切片，完全按照上述方法操作進(jìn)行原位雜交檢測(cè)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 斑馬魚人工感染后的發(fā)病情況

健康斑馬魚經(jīng)過傳染性造血器官壞死病毒的人工感染后，出現(xiàn)游動(dòng)速度加快、應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈、體色變淺、眼球明顯突出、糜樣管狀糞便拖于肛門、腹部和尾基部有皮下出血紅斑等典型的病毒性傳染性造血器官壞死病癥狀。而對(duì)照組未出現(xiàn)變化。

3.2 巢式PCR鑒定結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在786bp的位置上病魚樣品提取的RNA沒有相應(yīng)擴(kuò)增條帶（圖1），標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照與引物預(yù)期擴(kuò)增條帶大小相符。

圖1 第一對(duì)引物PCR產(chǎn)物電泳圖

將第一對(duì)引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物在經(jīng)過第二對(duì)引物的巢式擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，病魚樣品在323bp的位置上有擴(kuò)增條帶（圖2），并與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照大小一致。結(jié)果說明，實(shí)驗(yàn)組斑馬魚已經(jīng)感染了IHNV病毒。

圖2 第二對(duì)引物巢式PCR產(chǎn)物電泳圖

3.3 探針的制備

病毒RNA經(jīng)巢式PCR擴(kuò)增出的323bp片段經(jīng)膠回收(圖3)后按照羅氏地高辛DNA高效標(biāo)記檢測(cè)試劑盒的說明進(jìn)行標(biāo)記。DIG標(biāo)記濃度為100ng/μL。

圖3 制備DIG-323探針的模板膠回收?qǐng)D

3.4 探針濃度的測(cè)定

在硝酸纖維素（NC）膜上進(jìn)行的斑點(diǎn)印記雜交反應(yīng)選擇探針濃度的結(jié)果表明，DIG-323探針對(duì)同源靶基因的檢測(cè)靈敏度在探針濃度為0.1ng/μL時(shí)仍有明顯的紫色雜交斑點(diǎn)。本研究中選擇使用產(chǎn)生藍(lán)紫色斑點(diǎn)中探針濃度較低的濃度，0.6ng/μL作為原位雜交檢測(cè)中使用的探針濃度。

圖4 探針濃度斑點(diǎn)印記雜交結(jié)果

3.5 原位雜交檢測(cè)結(jié)果

感染的斑馬魚原位雜交檢測(cè)結(jié)果（圖5）與對(duì)照組健康斑馬魚原位雜交檢測(cè)結(jié)果（圖6）對(duì)比顯示，在腦、肌肉、腹部?jī)?nèi)膜和內(nèi)臟組織切片中均檢測(cè)到了深紫色的陽(yáng)性信號(hào)斑點(diǎn)。其中，整個(gè)頭部（A）、腹部?jī)?nèi)膜（E）和內(nèi)臟部分（F）的陽(yáng)性斑點(diǎn)較多，肌肉組織中也可觀察到陽(yáng)性信號(hào)。

圖5 實(shí)驗(yàn)組病魚組織切片DIG-323探針原位雜交檢測(cè)結(jié)果

圖6 對(duì)照組健康魚組織切片DIG-323探針原位雜交檢測(cè)結(jié)果

4 討論

核酸原位雜交技術(shù)有嚴(yán)格的要求，組織的預(yù)處理、切片厚度、使用標(biāo)記的探針濃度、檢測(cè)的靶基因的量、雜交的溫度、梯度洗液的濃度及pH都要求適當(dāng)、穩(wěn)定，否則會(huì)影響雜交效果。其中，探針模板的長(zhǎng)度和探針的濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果起到至關(guān)重要的作用。一般認(rèn)為，用于原位雜交的探針長(zhǎng)度以50～300bp為最佳，這樣的探針通透性好并且雜交效率高；雜交反應(yīng)時(shí)，探針的濃度過高不但造成浪費(fèi)，而且會(huì)使背景顏色很深。

原位雜交技術(shù)將分子生物學(xué)與組織學(xué)相結(jié)合，從細(xì)胞水平上在原位研究特異性核酸同時(shí)定位靶基因的分布，敏感直觀。為病毒的組織細(xì)胞定位提供了一個(gè)有效的方法，有助于研究病毒的發(fā)病機(jī)理。

本研究應(yīng)用原位雜交方法測(cè)定了人工感染的健康斑馬魚組織切片中的傳染性造血器官壞死病毒的主要分布部位。利用IHNV核蛋白基因的高保守高特異性，使用通用引物擴(kuò)增出標(biāo)準(zhǔn)病毒的一段323bp的片段作為模板，通過將模板變性將模板標(biāo)記成探針DIG-323。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IHNV病毒原位雜交斑點(diǎn)顏色呈亮藍(lán)紫色明顯區(qū)別于經(jīng)過俾斯麥棕復(fù)染的組織顏色。說明本研究中選擇使用的探針濃度0.6ng/μL具有較高的敏感性，并且背景顏色不會(huì)過深，實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果容易判定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IHNV病毒在人工感染的斑馬魚體內(nèi)普遍分布但是含量較低，并且在于腦、腹部?jī)?nèi)膜和內(nèi)臟組織中的含量高于在肌肉組織中的含量。本研究中IHNV在斑馬魚組織切片中原位雜交檢測(cè)結(jié)果對(duì)今后研究IHNV的治病機(jī)理提供了基礎(chǔ)資料。

[1]何玉英, 李健, 劉萍, 等. 原位雜交技術(shù)及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J]. 海洋水產(chǎn)研究.2005, 26(1): 74-79

[2]GB/T 15805. 2-2008[S]

[3]蘇慧慈. 原位雜交[M]. 北京: 中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社. 1994

[4]徐云遠(yuǎn), 種康, 許智宏, 等. RNA原位雜交使用技術(shù)[J]. 植物學(xué)通報(bào).2002, 19(2): 234-238

[5]陳曉艷, 何建國(guó). 原位雜交技術(shù)在斜帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒檢測(cè)中的應(yīng)用[J].海洋科學(xué). 2008, 32(6): 1-4

10.3969/j.issn.1001-8972.2011.07.128

國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2010IK003）