植酸對腐敗希瓦氏菌的抑菌機理

謝 晶，侯偉峰，湯 毅，藍蔚青

（上海海洋大學食品學院，上海 201306）

植酸對腐敗希瓦氏菌的抑菌機理

謝 晶，侯偉峰，湯 毅，藍蔚青

（上海海洋大學食品學院，上海 201306）

結合植酸對南美白對蝦的保鮮，以蝦體優(yōu)勢腐敗菌－腐敗希瓦氏菌為研究對象，利用植酸溶液處理后，通過對細菌的抑菌效果及最小抑菌濃度、細菌生長曲線、堿性磷酸酶（AKP）等的測定研究其抑菌機理。結果表明，植酸對腐敗希瓦氏菌有較強的抑菌效果，最低抑菌濃度（體積分數(shù)）為0.2%。同對照組相比，植酸能夠影響細菌的生長規(guī)律，使細胞破損。細胞壁和細胞膜遭到破壞，AKP及電導率均增大，初步闡述了植酸對腐敗希瓦氏菌的抑菌機理。

植酸，腐敗希瓦氏菌，抑菌，機理

植酸（Phytic acid），又名肌醇六磷酸，是從植物種籽中提取的一種淡黃褐色粘稠液體，分子式：C6H18O24P6，分子量約為660.08，是一種天然存在的含磷有機酸類化合物。植酸主要以Ca、Mg及K鹽等復合形式廣泛存在于谷物、豆類等植物種子的果殼和胚芽中[1]，具有較強的絡合金屬離子的特性，是一種抗營養(yǎng)因子，此外，植酸的毒性極低[2]，廣泛應用于食品、化工和醫(yī)學等行業(yè)，是一種安全、新型的食品添加劑。在前期利用植酸保鮮南美白對蝦的實驗中發(fā)現(xiàn)，在南美白對蝦中添加0.08%的植酸溶液，能夠有效地預防黑變及由微生物污染而造成的腐敗，這與《食品添加劑衛(wèi)生標準GB2760－86增補品種》[3]中規(guī)定植酸適用于水產品對蝦保鮮參考用量以0.05%～0.1%的水溶液作為冷凍保鮮液相吻合。目前，植酸在南美白對蝦中已得到了初步的應用[4]，但關于其作用機理還沒有得到很好的闡述。本文結合植酸在南美白對蝦的保鮮作用，選取南美白對蝦中優(yōu)勢腐敗菌—腐敗希瓦氏菌[5－6]（Shewanella putrefacens）作為實驗對象，來探討植酸的保鮮機理。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefacens） 上海海洋大學微生物實驗室保存；胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、平板計數(shù)瓊脂 北京陸橋技術有限責任公司；植酸 浙江桐鄉(xiāng)鑫洋食品添加劑有限公司，50%高純度植酸液體，食品級；2.5%戊二醛水溶液 上海凌峰化學試劑有限公司，分析純；堿性磷酸酶（AKP）試劑盒 南京建成科技有限公司；無水乙醇、醋酸乙戊酯、PBS磷酸緩沖液 國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

日立E－1010離子濺射儀、HCP－2臨界點干燥儀、S－3400N掃描電子顯微鏡 日本Hitach公司；SG3電導率儀 梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；UV－3000 PC型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；TH2－82（A）氣浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市科稀儀器有限公司；stat fax－3200酶標儀 美國awareness公司；Z36HK大容量高速冷凍離心機 德國哈默（Herm Le）公司；潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；YXQ－LS－30SH全自動立式壓力蒸汽滅菌器上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；XW－80A旋渦混合器 上海青浦滬西儀器廠；DHP－9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；牛津杯（外徑7.82±0.1mm），游標卡尺，一次性無菌針筒，0.22μm水系微孔濾膜等。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化及植酸溶液的配制 菌種活化方法參照李誠[7]等對聚賴氨酸的研究，將活化后的菌種轉接到液體培養(yǎng)基TSB中，搖床內培養(yǎng)17h后用滅菌的TSB進行梯度稀釋，使菌落總數(shù)為106～107cfu/m L，作為菌懸液待用。搖床培養(yǎng)條件均為37℃、150r/m in。

將植酸溶液配制成體積分數(shù)為2%的水溶液作為母液，用0.22μm的微孔濾膜進行物理滅菌[8]后，用無菌水進行稀釋，使其體積分數(shù)分別為：1%、0.8%、0.4%、0.2%、0.1%、0.05%，以無菌水代替植酸溶液作為對照組（CK）。

1.2.2 植酸對腐敗希瓦氏菌的抑菌效果實驗及最低抑菌濃度（M IC）的測定 取0.1m L制備好的菌懸液進行涂布，制成含菌平板。參考倪清艷[9]等的方法，利用牛津杯方法進行植酸抑菌效果的實驗。

取植酸溶液0.5m L與同體積106cfu/m L的菌液混合，使其最終濃度分別為2%、1%、0.8%、0.4%、0.2%、0.1%、0.05%，搖床培養(yǎng)16h后，倒入平板中進行培養(yǎng)，通過觀察，以不生長細菌的最小濃度作為最低抑菌濃度，平行兩次，以無菌水代替植酸作為對照組。

1.2.3 植酸對腐敗希瓦氏菌生長曲線的影響 取106cfu/m L菌懸液5m L與用TSB稀釋的植酸溶液等體積混合，使其最終濃度為1倍MIC、1/2MIC濃度，搖床培養(yǎng)，分別取樣，利用分光光度計，調整波長為630nm處進行菌液OD值的測定[10]，實驗平行3次，結果取其平均值。

1.2.4 植酸對腐敗希瓦氏菌菌體細胞壁的影響 取106cfu/m L菌懸液5m L與配制好的植酸溶液等體積混合，使其最終濃度為1倍M IC、1/2M IC濃度，搖床培養(yǎng)后，按照劉蔚[11]等的方法并稍作改進，測定菌液AKP的含量，從而間接反映細菌細胞壁的變化情況，實驗平行3次，結果以平均值表示。

1.2.5 植酸對腐敗希瓦氏菌菌體細胞膜通透性的影響 將菌懸液濃度調至108cfu/m L，取該菌懸液5m L與配制好的植酸溶液等體積混合，使其最終濃度為1倍M IC、1/2M IC濃度，搖床培養(yǎng)后，按照Lee[12]的方法測定培養(yǎng)液的電導率值，同時做對照組。

1.2.6 植酸對腐敗希瓦氏菌菌體超微結構的影響 植酸對細菌細胞超微結構的影響通過掃描電鏡進行觀察。具體操作方法為：取生長至對數(shù)期的腐敗希瓦氏菌菌液與等體積植酸溶液混合，使其最終濃度為1倍M IC濃度，搖床培養(yǎng)10h后，取此菌液1.5m L，6500r/m in離心4m in，PBS清洗菌體后，用2.5%戊二醛固定，于4℃條件下過夜。過夜后取出溶液，于6500r/min離心后，PBS清洗兩次，再用1%鋨酸固定6h，經PBS清洗2～3次后，分別用30%、50%、70%乙醇梯度脫水，過夜后經90%、100%、100%乙醇脫水，即用乙酸異戊酯或丙酮處理2次，每次約20m in，將處理好的樣品在CO2臨界條件下干燥4～6h，上銅臺，噴金，于掃描電鏡下觀察形態(tài)結構變化[13－15]，同時做對照組，操作方法相同。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS17.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，結果以平均值±平均偏差表示，利用t－檢驗進行組間分析，當P＜0.01時為極顯著差異，0.01＜P＜0.05時為顯著性差異，P＞0.05時為不顯著差異，并采用Excel進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 植酸對腐敗希瓦氏菌抑菌效果及最低抑菌濃度（MIC）

抑菌效果可以通過抑菌圈的方法進行判定，一般來說，抑菌物質濃度越高，抑菌圈直徑就越大。腐敗希瓦氏菌經不同濃度植酸溶液處理后，由表1可知，當植酸濃度較低時，同對照組相比，基本上沒有抑菌圈，但隨著植酸濃度的增高，抑菌效果變得明顯，其抑菌圈直徑逐漸變大，這說明植酸對希瓦氏菌具有明顯的抑菌作用，并且隨著濃度的增大，抑菌效果逐漸增強。

最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）是測量抗菌藥物抗菌活性大小的指標，對于保鮮劑保鮮機理的研究及保鮮劑在食品中的應用具有重要的意義。通過最低抑菌濃度實驗可知，當植酸濃度為0.2%時已沒細菌生長，因此可以確定其最低抑菌濃度為0.2%。

表1 植酸對腐敗希瓦氏菌的抑菌效果

2.2 植酸對腐敗希瓦氏菌生長曲線的影響結果

菌液的光密度值可以用來衡量細菌的生長情況，一般來說，在液體培養(yǎng)基中，細菌呈現(xiàn)S型生長規(guī)律。如圖1所示，細菌的對照組具有典型的細菌生長規(guī)律。當在菌液中添加1倍M IC（0.2%）和1/2M IC濃度（0.1%）的植酸時，細菌的生長曲線具有不同程度的變化，沒有典型的生長規(guī)律，菌液在630nm的OD值明顯低于對照組（P＜0.05），尤其是在菌液中添加較高濃度的植酸時，細菌菌液的OD值始終處于一個較低的平穩(wěn)狀態(tài)。但在1/2MIC濃度下，細菌菌液OD值盡管有所上升，但上升趨勢處于不規(guī)則的狀態(tài)，并始終低于對照組。這說明較高濃度的植酸能夠將細菌完全抑制或殺滅，從而導致生長曲線始終處于較低的平穩(wěn)狀態(tài)。而低濃度的植酸能夠有效抑制部分細菌活性，使細菌生長呈現(xiàn)不規(guī)則的趨勢，并且由于植酸的抑制作用，從而導致其OD值始終低于對照組。

圖1 植酸處理后腐敗希瓦氏菌的抑菌曲線變化

2.3 植酸對腐敗希瓦氏菌菌體細胞壁的影響結果

細菌細胞壁位于細胞最外層，能夠有效地保持菌體形狀及抗?jié)B透壓能力。堿性磷酸酶（AKP）是存在于細胞壁與細胞膜之間的一種酶，當細胞壁處于完整狀態(tài)時，AKP不能透過細胞壁，因此正常情況下在胞外不能檢出。但當細胞壁遭到破壞后，細菌不能保持良好的形狀和抗?jié)B透壓能力，AKP大量滲透到胞外，因此通過測定AKP的變化情況可以間接反映植酸對細菌細胞壁的影響[16]。

圖2 植酸對腐敗希瓦氏菌細胞壁的影響

植酸對腐敗希瓦氏菌細胞壁的影響情況如圖2所示，由圖2可知，對照組AKP含量基本上始終處于一個較低的平穩(wěn)狀態(tài)，在胞外很難檢測出其含量，但經不同濃度植酸處理的菌液，在最初的2h內AKP含量迅速上升至較高的含量，以后基本上處于平穩(wěn)趨勢，并且植酸溶液濃度越高，AKP含量越高。這說明植酸溶液能夠破壞細菌細胞壁的完整性，濃度越高，破壞程度越大，并且在較短的時間內能夠造成菌體細胞壁通透性的增加。

2.4 植酸對腐敗希瓦氏菌細胞膜通透性的影響結果

細菌細胞膜是細菌的保護屏障，具有流動性和半透性等功能，但當細菌細胞膜遭到破壞后，細胞膜所固有的功能將會喪失，導致細菌細胞膜的流動性降低和通透性增大，從而對菌體的保護作用被打破，細胞內部電解質大量外泄至液體培養(yǎng)基中，導致培養(yǎng)液的電導率上升，因此，細菌細胞膜通透性的變化可由菌液電導率的變化情況來反映[17]。

腐敗希瓦氏菌經植酸處理后其菌液電導率的變化情況如圖3所示。由圖3可知，對照組菌液的電導率呈現(xiàn)穩(wěn)定的上升趨勢，這可能與菌液細菌菌體濃度的增大有一定的關系。但當在菌液中添加1倍M IC濃度的植酸時，菌液的電導率值明顯高于對照組（P＜0.05），這說明高濃度的植酸對細菌細胞膜的影響作用較大，導致細胞膜遭到嚴重破壞，通透性增大，原生質及電解質外滲嚴重，從而起到抑菌作用。而在菌液中添加1/2M IC濃度的植酸時，菌液的電導率反而明顯低于對照組（P＜0.01），其原因可能是由于植酸濃度較低，對細菌細胞膜作用較小，反而由于靜電作用，使菌液中其他的金屬離子與細胞膜結合[18]，同時由于植酸具有較強的金屬離子螯合作用[19]，從而導致菌液電導率的降低。

圖3 植酸處理后腐敗希瓦氏菌菌液電導率的變化

2.5 植酸對腐敗希瓦氏菌超微結構的影響結果

圖4 未經植酸處理腐敗希瓦氏菌的掃描電鏡圖（37℃培養(yǎng)10h，15000×，30000×）

圖5 植酸處理后腐敗希瓦氏菌的掃描電鏡圖（37℃培養(yǎng)10h，15000×，30000×）

經植酸處理腐敗希瓦氏菌，通過掃描電鏡對其微觀形態(tài)進行觀察，結果如圖4、圖5所示。由圖4可知，未經植酸處理的腐敗希瓦氏菌，形態(tài)比較完整，呈現(xiàn)狹長狀，表面比較光滑，顏色鮮亮，折光性好，沒有出現(xiàn)細胞破損和內容物溢出現(xiàn)象，菌體生長良好，沒有聚集現(xiàn)象。而經過植酸處理后的希瓦氏菌，如圖5所示，菌體開始皺縮、無飽滿感，部分細胞出現(xiàn)了斷裂和破損現(xiàn)象，菌體表面粗糙，同時，細胞原生質的外泄明顯，細菌細胞由于原生質的粘稠性而導致細胞聚集在一起，產生嚴重的重疊現(xiàn)象。由此表明，植酸對細菌的細胞具有破壞損傷作用，能夠通過細胞壁和細胞膜的破壞，造成細胞內原生質和電解質的外滲，這與菌液吸光度、AKP及電導率的變化具有一致性。

3 結論

通過植酸處理腐敗希瓦氏菌實驗，結果表明：植酸對腐敗希瓦氏菌具有較強的抑制和殺滅作用，且隨著植酸濃度的增大，抑菌作用逐漸增強；植酸對腐敗希瓦氏菌的最低抑菌濃度為0.2%；在腐敗希瓦氏菌菌液中添加1倍M IC濃度的植酸，對生長曲線、堿性磷酸酶和菌液電導率的影響較大，細菌細胞壁和細胞膜的完整性遭到破壞，滲透性增加，從而菌體細胞質外滲，導致堿性磷酸酶含量和電導率較大；當植酸濃度為1/2MIC時，植酸沒有造成細菌的破裂，細菌未被完全抑制，反而由于靜電作用和植酸金屬離子螯合作用，造成菌液電導率偏??；通過對掃描電鏡實驗，直觀地表明了植酸對細菌形態(tài)變化的影響，不僅使細菌表面開始皺縮，變得粗糙，同時還使細菌因原生質和電解質的外滲發(fā)生聚集現(xiàn)象，細菌正常的生理代謝受到影響。為深入研究植酸的保鮮機理，期望下一步能開展對其抑菌譜的研究，選取不同類型的微生物，如細菌、霉菌、酵母等，進一步探明植酸的抑菌保鮮機理。

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Antimicrobial mechanism s of phytic acid against Shewanella putrefacens

XIE Jing,HOU Wei-feng,TANG Yi,LAN Wei-qing

（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai201306,China）

Combined with phytic acid on the preservation of Penaeus Vanmamei，advantage corruption bacteria of Penaeus Vanmamei-Shewanella putrefacens was selected as the sample to investigate the antimicrobial mechanisms of phytic acid by inhibition effects，minimum inhibitory concentration(MIC)，bacterial curve，alkaline phosphatase(AKP)and so on.Results showed that phytic acid had a strong inhibition function against the bacteria，the MIC(volume fraction)of Shewanella putrefacens was 0.2%.Com pared with the controlled，phytic acid can change bacterial curve，destroyed the cells.Cellmembrane and wall were destroyed，then，AKP and electric conductivity were increased.The antimicrobial mechanisms of phytic acid against Shewanella putrefacens were proposed.

phytic acid；Shewanella putrefacens；antim icrobial；mechanisms

TS201.2

A

1002－0306（2011）10－0085－04

2011－08－05

謝晶（1968－），女，教授，博士，研究方向：食品冷鏈技術與裝備，食品保鮮。

“十二五”國家支撐計劃項目（2011BAD24B02）；上海市教育委員會重點學科建設項目（J50704）。