激光多普勒血流儀評(píng)價(jià)活體大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型成功的可行性分析*

劉 宇， 孟 然△， 閆 峰， 羅玉敏， 吉訓(xùn)明△

(1北京大學(xué)第九臨床醫(yī)學(xué)院，北京世紀(jì)壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100038； 2首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院腦血管病研究所，北京 100053)

·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

激光多普勒血流儀評(píng)價(jià)活體大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型成功的可行性分析*

劉 宇1， 孟 然1△， 閆 峰2， 羅玉敏2， 吉訓(xùn)明2△

(1北京大學(xué)第九臨床醫(yī)學(xué)院，北京世紀(jì)壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100038；2首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院腦血管病研究所，北京 100053)

目的探討激光多普勒血流儀(LDF)評(píng)價(jià)活體大鼠腦缺血/再灌注損傷模型制作成功的可行性和可靠性分析。方法10只體重280-310 g的雄性SD大鼠用傳統(tǒng)線栓法制作單側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型，神經(jīng)功能評(píng)分，LDF監(jiān)測(cè)插栓前后大鼠腦血流動(dòng)態(tài)變化。于缺血2 h和再灌注24 h斷頭取腦，TTC染色檢測(cè)腦片梗死灶體積。結(jié)果基線血流均值為(224.99±75.00)PU, 局灶神經(jīng)功能障礙評(píng)分0分。插栓成功MCAO模型，缺血2 h血流均值為(67.23±6.90)PU, 與基線血流差值為157.76PU，降幅約為70%(P<0.01)，差異顯著。拔拴后血流均值為(216.01±7.30)PU，與缺血2 h血流差值為148.78PU(P<0.01)，差異顯著；與基線血流差值為-8.98PU(P>0.05)，無(wú)顯著差異。再灌注24 h后，局灶神經(jīng)功能障礙評(píng)分10.35分，腦片TTC染色顯示梗死及水腫灶。插栓不成功模型LDF監(jiān)測(cè)顯示仍有血流通過(guò)，降幅少于基線的50%，再灌注24 h后，局灶神經(jīng)功能障礙評(píng)分0分，TTC染色未見(jiàn)梗死灶。結(jié)論LDF對(duì)大鼠腦血流的監(jiān)測(cè)是除神經(jīng)功能評(píng)分以外另一種判斷活體大鼠MCAO模型制作成功的可靠而實(shí)用的方法。

模型,大腦中動(dòng)脈阻塞; 激光多普勒血流儀

1975年Ster首次報(bào)道了用激光多普勒血流測(cè)定法(laser Doppler flowmetry, LDF)監(jiān)測(cè)皮膚血流量。1987年Rosenblum將LDF用于神經(jīng)外科術(shù)中腦皮質(zhì)血流量測(cè)定。激光多普勒血流監(jiān)測(cè)是一種實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)、微創(chuàng)和敏感的微循環(huán)血流監(jiān)測(cè)技術(shù)，不僅用于神經(jīng)外科術(shù)中對(duì)局部腦血流量(regional cerebral blood flow,rCBF)的監(jiān)測(cè)[1]，自90年代起也用于監(jiān)測(cè)rCBF的實(shí)驗(yàn)研究。

大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型的制作已經(jīng)成熟[2-9]，但對(duì)活體成功模型的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)尚欠客觀，目前國(guó)內(nèi)對(duì)活體大鼠模型成功與否的評(píng)價(jià)仍無(wú)明確客觀的標(biāo)準(zhǔn)，多以大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)插栓對(duì)側(cè)前肢不能前伸、運(yùn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)追尾等表現(xiàn)評(píng)價(jià)，具有一定的主觀性。能否利用客觀可行的方法提高對(duì)模型成功與否評(píng)價(jià)的客觀性？ Schmid-Elsaesser等[2]用LDF評(píng)價(jià)MCAO模型，發(fā)現(xiàn)持續(xù)腦血流監(jiān)測(cè)可以用來(lái)證明模型制作是否成功，并認(rèn)為動(dòng)態(tài)血流監(jiān)測(cè)對(duì)發(fā)現(xiàn)術(shù)中出現(xiàn)的蛛網(wǎng)膜下腔出血高度敏感。因此本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)應(yīng)用LDF監(jiān)測(cè)大鼠MCAO模型制作過(guò)程中大鼠腦血流的動(dòng)態(tài)變化，評(píng)價(jià)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)腦血流監(jiān)測(cè)對(duì)大鼠MCAO模型制作成功與否評(píng)價(jià)的價(jià)值。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑與儀器 TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑，科海軍舟生物技術(shù)公司)、10%水合氯醛(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院)、激光多普勒血流儀(Perimed；PF5001型；瑞典)、手術(shù)顯微鏡(Carl Zeiss)、反饋式溫度調(diào)節(jié)儀(Harvard Apparatus) 、線栓(北京沙東技術(shù)有限公司；型號(hào)2838-A)。

1.2動(dòng)物 SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠10只，體重280-310 g，由維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證為SCXK(京)2006-0009。

2方法

2.1模型制作 參照改良線栓法制作MCAO模型[10，11]，大鼠稱重后，用10%水合氯醛350 mg/kg，腹腔注射麻醉，大鼠俯臥，頭部備皮，矢狀位剪開額頂部皮膚2 cm，暴露皮下筋膜，用浸滿雙氧水的棉簽?zāi)Σ帘┞兜慕钅?，直至暴露出顱骨前囟及右側(cè)半顱骨，應(yīng)用立體定位儀以前囟為起點(diǎn)向右5 mm，向后3 mm，在該處用牙科鉆打孔，至穿透顱骨但未打破硬腦膜為宜。將激光多普勒血流儀的探頭固定于孔上，開始記錄右側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)域血流變化值，當(dāng)所示數(shù)值平穩(wěn)，開始制作MCAO模型。頸部備皮，正中剪皮開口，鈍性分離腺體和筋膜，術(shù)中小心分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，頸外動(dòng)脈(ECA)，電凝ECA上的2個(gè)小分支，將ECA近頭端結(jié)扎并剪斷，近心端緊貼分叉處穿線打松結(jié)，于CCA和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)上各置一動(dòng)脈夾，然后用顯微剪在ECA游離端剪一小口，將線栓由此插入動(dòng)脈，去除ICA上的動(dòng)脈夾，將線栓慢慢插入ICA，當(dāng)激光多普勒血流儀顯示腦血流量下降至基礎(chǔ)值的20%-30%時(shí)停止插栓[1]，將松結(jié)系緊，去除CCA上的動(dòng)脈夾，縫合皮膚。缺血2 h，拔栓，血流恢復(fù)至基線為模型成功。

2.2神經(jīng)功能評(píng)分 采用12分評(píng)分法[12-14]。 (1)提尾懸空試驗(yàn)：無(wú)明顯神經(jīng)功能缺失為0分，梗死對(duì)側(cè)肢體屈曲為1分，梗死對(duì)側(cè)肢體外展為2分。(2)肢體放置試驗(yàn)：(a)視覺(jué)試驗(yàn)(前方)：實(shí)驗(yàn)者將動(dòng)物握于手中，使其前爪懸空，自桌面上方向桌面緩慢斜線靠近此時(shí)桌子位于大鼠前方，正常大鼠反應(yīng)為前肢即刻抓向桌面，損傷大鼠則表現(xiàn)為肢體反應(yīng)延遲。正常為0分；反應(yīng)延遲但不超過(guò)2 s為1分；反應(yīng)延遲且超過(guò)2 s為2分。(b)視覺(jué)試驗(yàn)(側(cè)方)，此時(shí)桌子位于動(dòng)物側(cè)方,其余實(shí)驗(yàn)方法及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)同前。(c)觸覺(jué)試驗(yàn)(前方)，將動(dòng)物雙眼遮住，并使其前爪懸空，此時(shí)大鼠應(yīng)該既看不見(jiàn)，也不能用胡須觸及桌面，用其前爪背側(cè)輕觸桌面，刺激深度僅達(dá)到皮膚和毛發(fā)。動(dòng)物反應(yīng)及評(píng)分同視覺(jué)實(shí)驗(yàn)。(d)觸覺(jué)試驗(yàn)(側(cè)方)評(píng)分同前。(e)本體覺(jué)試驗(yàn)，按壓動(dòng)物前爪，刺激深達(dá)肌肉及關(guān)節(jié)，評(píng)分同前。

2.3腦梗死體積的測(cè)定 大鼠缺血2 h，再灌注24 h后斷頭取腦，將鼠腦放在連續(xù)模具內(nèi)進(jìn)行冠狀等距切片，片厚約2 mm，共切6片，用TTC染色，多聚甲醛固定，數(shù)碼相機(jī)攝片。使用Image-Pro Plus軟件，計(jì)算腦梗死體積[13,15]。梗死體積百分率=(正常側(cè)大腦半球體積-梗塞側(cè)非梗塞區(qū)腦組織體積)/正常側(cè)大腦半球體積。

2.4腦血流監(jiān)測(cè) 用Perimed公司提供的LDF數(shù)據(jù)記錄軟件(PSW)，記錄并分析監(jiān)測(cè)期間腦血流變化情況。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1LDF監(jiān)測(cè)MCAO模型的腦血流圖

MCAO模型成功的大鼠插栓時(shí)腦血流降幅距基線達(dá)到70%以上(圖1)，且拔栓后血流迅速恢復(fù)接近基線，模型成功率為88%。成功的MCAO模型更多的腦血流圖特點(diǎn)見(jiàn)圖1。有1只麻醉意外，被排除。有1只出現(xiàn)缺血期間局部血流不能完全阻斷，腦血流平均降幅僅達(dá)到基線的50%，見(jiàn)圖2，此時(shí)線栓已插入深度達(dá)18 mm且線栓插入和拔出均困難，血流阻斷不完全的腦血流圖特點(diǎn)見(jiàn)圖2。

如圖1顯示，區(qū)域1為基線，此階段是制作大腦中動(dòng)脈缺血模型的過(guò)程，手術(shù)中碰觸血管時(shí)有血流波動(dòng)情況發(fā)生，基線平均血流值為(224.99±75.00)PU。區(qū)域2為缺血階段，第一個(gè)標(biāo)簽表示，將線栓插入大腦中動(dòng)脈，此時(shí)血流量迅速降低，下降幅度約為基線區(qū)域的70.12%，插線后平均血流值為(67.23±6.90)PU。區(qū)域3為再灌注的起始階段，第2個(gè)標(biāo)簽表示，將線栓拔除后，血流迅速恢復(fù)至基線水平，拔栓后平均血流值為(216.01±7.30)PU，恢復(fù)至基線血流的96.10%。

Figure 1. Dynamic changes of cerebral blood flow during MCAO (successful).Horizontal axis: time(min); vertical axis: the relative value of blood flow (PU).Area 1: baseline=(224.99±75.00)PU;Area 2: cerebral blood flow after filament inserted =(67.23±6.90)PU;Area 3: restored cerebral blood flow after filament removed =(216.01±7.30)PU.

圖1MCAO過(guò)程中血流動(dòng)態(tài)變化(成功)

Figure 2. Dynamic changes of cerebral blood flow during MCAO (unsuccessful).Horizontal axis: time (min); vertical axis: the relative value of blood flow (PU).

圖2MCAO過(guò)程中血流動(dòng)態(tài)變化(不成功)

如圖2及表1所示,在缺血期間，插栓局部血管呈現(xiàn)不規(guī)則的收縮狀態(tài)。最大血流為177.34 PU，最小值為57.01 PU，均值為99.67 PU，標(biāo)準(zhǔn)差為22.62，血流呈蠕動(dòng)樣波動(dòng)，雖變化幅度較顯著，但插栓后降幅不超過(guò)基線的50%，也不體現(xiàn)明確的插栓缺血/拔栓再灌注的規(guī)律。本圖所示的情況發(fā)生在缺血期間，可能為線栓在血管內(nèi)有滑動(dòng)，造成的非持續(xù)性阻斷血流；另有一些沒(méi)有完全阻斷血流的情況，發(fā)生在插栓的過(guò)程中，可能由于線栓刺激血管壁導(dǎo)致局部血管發(fā)生痙攣，此時(shí)線栓已不能再插入，過(guò)去常誤認(rèn)為模型成功，只有經(jīng)TTC染色方能排除。應(yīng)用LDF持續(xù)動(dòng)態(tài)腦血流監(jiān)測(cè)，可以通過(guò)腦血流曲線的降幅及波動(dòng)特點(diǎn)及時(shí)發(fā)現(xiàn)MCAO模型沒(méi)有成功。

2MCAO模型LDF監(jiān)測(cè)腦血流動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù)

如表2所示，9只大鼠插栓后區(qū)域血流量平均值比基線區(qū)域下降幅度≥70%，拔栓后區(qū)域血流量平均值基本恢復(fù)至基線水平，無(wú)顯著差異,P>0.05。

3TTC染色驗(yàn)證MCAO模型成功

于缺血2 h再灌注24 h后將大鼠斷頭取腦，冠狀等距切片制成腦片，TTC染色病理組織學(xué)驗(yàn)證MCAO模型成功見(jiàn)圖3, TTC染色顯示的白色區(qū)域?yàn)樾迈r梗死病灶。 本研究中模型成功大鼠的腦梗死平均體積為48.4%。24 h后神經(jīng)功能評(píng)分平均值為10.35分。模型不成功,則沒(méi)有顯示白色的局灶梗死損害，見(jiàn)圖4。24 h后神經(jīng)功能評(píng)分平均值為0分。

表1 血流變化數(shù)據(jù)(不成功)

表2 腦血流動(dòng)態(tài)變化情況

*P<0.05vsbaseline.

Figure 3. Brain slices stained with TTC (2 h ischemia followed by 24 h reperfusion).

圖3TTC染色結(jié)果

Figure 4. Brain slices with TTC staining(Blood flow was blocked incompletely，without local infarction).

圖4TTC染色結(jié)果

討 論

國(guó)內(nèi)以往對(duì)制作MCAO模型是否成功的評(píng)價(jià)主要依靠對(duì)動(dòng)物存活時(shí)神經(jīng)功能缺陷的評(píng)分，這種方法不完全可靠，常因摻雜主觀因素造成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)誤差。MCAO模型制作過(guò)程中常會(huì)出現(xiàn)干擾評(píng)價(jià)模型是否成功的因素，如血管痙攣，此時(shí)雖然線栓已經(jīng)不能再插入，但血流量下降程度遠(yuǎn)沒(méi)有達(dá)到形成模型成功的標(biāo)準(zhǔn)，如果不使用腦血流監(jiān)測(cè)，就此判斷模型成功，會(huì)使實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。另有一些大鼠造模成功后的臨床神經(jīng)功能評(píng)分仍達(dá)不到入組標(biāo)準(zhǔn)，處死大鼠后才發(fā)現(xiàn)梗塞側(cè)腦梗死體積已經(jīng)達(dá)標(biāo)，產(chǎn)生假陰性結(jié)果，造成實(shí)驗(yàn)中人力物力和時(shí)間的浪費(fèi)。為提高對(duì)MCAO活體模型制作成功評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性，我們?cè)谘芯恐袊L試使用LDF監(jiān)測(cè)腦血流動(dòng)態(tài)變化來(lái)評(píng)價(jià)MCAO活體模型制作是否成功。研究結(jié)果顯示：LDF監(jiān)測(cè)結(jié)果與TTC染色證實(shí)了的腦梗死病灶具有很高的一致性，符合率達(dá)到88%。LDF監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)比TTC染色評(píng)價(jià)更有優(yōu)勢(shì)之處是前者不僅提高了對(duì)模型成功評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性，同時(shí)可以對(duì)活體模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，為對(duì)同一MCAO活體模型梗死后再灌注的研究提供了可能。

另外LDF監(jiān)測(cè)可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)大鼠血管的個(gè)體差異，可以個(gè)體化選擇用于栓塞的栓子直徑，達(dá)到與血管腔直徑更好地吻合。有報(bào)道顯示[11]體重偏小的大鼠，血管管徑偏細(xì)，用同樣的線栓無(wú)法插入大腦中動(dòng)脈，而體重稍大的大鼠血管管徑偏大，用同樣的線栓不能有效阻斷血流達(dá)到栓塞滿意的效果，對(duì)于實(shí)驗(yàn)的可比性造成影響。而通過(guò)LDF血流量降低程度的監(jiān)測(cè)來(lái)控制梗死體積，使每個(gè)MCAO模型更具有可比性。國(guó)外已采用激光多普勒血流儀評(píng)價(jià)MCAO模型是否成功[2]，而國(guó)內(nèi)在模型制作上尚未見(jiàn)廣泛采用這一客觀的評(píng)價(jià)手段，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性。本研究顯示，把腦血流監(jiān)測(cè)作為評(píng)價(jià)模型是否成功的指標(biāo)，不僅不需處死動(dòng)物就能直接評(píng)價(jià)活體模型，而且可以提高M(jìn)CAO模型的可比性，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更有說(shuō)服力。

激光多普勒血流測(cè)定法是一種準(zhǔn)確反映微循環(huán)灌注的測(cè)量手段，在神經(jīng)外科領(lǐng)域應(yīng)用較多。臨床常用的另一種超聲經(jīng)顱多普勒技術(shù)(TCD)主要用于判斷顱內(nèi)較大血管的血流情況，間接反映血管功能及腦組織的灌注狀態(tài)，但無(wú)法探查腦組織微循環(huán)情況。將二者結(jié)合優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，共同評(píng)價(jià)腦血流灌注狀態(tài)將會(huì)促進(jìn)對(duì)缺血性腦血管動(dòng)物模型的缺血/再灌注損傷整個(gè)過(guò)程中的每個(gè)不同病理階段的腦血管血流動(dòng)力學(xué)的變化情況和藥物干預(yù)后的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行觀察。本研究結(jié)果再次證明LDF對(duì)于活體MCAO模型制作成功與否的評(píng)價(jià)是可靠而實(shí)用的。

(致謝:感謝首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院腦血管病研究所的閆峰老師及羅玉敏教授、吉訓(xùn)明教授等對(duì)模型制作和應(yīng)用LDF儀對(duì)動(dòng)物模型腦血流監(jiān)測(cè)等工作中提供的儀器、設(shè)備和技術(shù)指導(dǎo)。)

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EvaluationofratMCAOmodelbylaserDopplerflowmetry

LIU Yu1, MENG Ran1, YAN Feng2, LUO Yu-min2, JI Xun-ming2

(1DepartmentofNeurology,BeijingShijitanHospital,TheNinthClinicalMedicalCollegeofPekingUniversity,Beijing100038,China;2CerebrovascularDiseasesResearchInstitute,XuanwuHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China.E-mail:victor65@126.com；E-mail:jixm70@hotmail.com)

AIM: To investigate the feasibility and reliability of using laser Doppler flowmetry (LDF) to evaluate the animal model of cerebral ischemia and reperfusion injuryinvivo.METHODSTen Sprague-Dawley (SD) male rats, weighing 280-310 g, were subject to unilateral middle cerebral artery occlusion (MCAO) with the routine method of line-embolism, and the cortical blood flow was continuously monitored by LDF during ischemia and reperfusion in the rats. Meanwhile, the degree of injury induced by cerebral ischemia and reperfusion was evaluated after MCAO by the nervous scoring of rat criteria. Brain slices were obtained by the method of neck end breaking and brain autopsy at the time point of ischemia for 2 h and reperfusion for 24 h. The volumes of infarction in the brain slices were determined by TTC staining.RESULTS(1) In the successful MCAO rats, the average local blood flow remarkably decreased from the baseline value of (224.99±75.00)PU to (67.23±6.90)PU in the ischemic period. The mean difference was 157.76 PU and decreasing amplitude of local blood flow was more than 70% by MCAO. In the reperfusion period, the average local blood flow was rapidly recovered to (216.01±7.30)PU after the embolus was pulled out, which was only slightly lower than that of the baseline level without statistical significance. However, the mean difference of 148.78 PU between the local blood flow of reperfusion and local blood flow of cerebral ischemia for 2 h was found (P<0.01). The average local nervous score was 10.35 at 24 h after cerebral ischemia and reperfusion,higher than that of the baseline (0 point). The infracted evidence with remarkable brain edema in the brain slices was clearly observed with TTC staining. (2) In the unsuccessful MCAO rats, the decrease in local blood flow was less than 50%. The local nervous score was 0 point at 24 h, which was equal to the baseline value. No local infraction and brain edema was observed in the brain slices.CONCLUSIONBesides using the local nervous functional scoring, continuously monitoring of blood flow by LDFinvivois a reliable and useful method to confirm the successful establishment of rat MCAO model.

Models,middle cerebral artery occlusion; Laser-Doppler flow meter

R331

A

1000-4718(2011)03-0620-05

2010-09-12

2010-12-17

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30770741)；北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才資助項(xiàng)目(No.2009-03-02)

△通訊作者 孟然Tel:010-63926650; E-mail:victor65@126.com；吉訓(xùn)明 Tel: 010-83548256; E-mail:jixm70@hotmail.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.041