劉莎莎, 高維娟
(承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,河北 承德 067000)
c-Jun氨基末端激酶在腦缺血再灌注損傷中的作用*
劉莎莎, 高維娟△
(承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室,河北 承德 067000)
在生物體內(nèi),絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是信號(hào)從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者,是一類絲/蘇氨酸殘基的蛋白激酶。目前在真核生物細(xì)胞中,已明確了4條MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[1],即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinases,ERK)通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路、p38通路及ERK5通路。JNK信號(hào)通路作為MAPK信號(hào)通路中重要的通路之一,參與了多種生理、病理過程,目前諸多研究表明其在腦缺血/再灌注損傷過程中尤其是程序性細(xì)胞死亡過程中起著重要的調(diào)控作用[2],本文就近年來對(duì)JNK通路的研究及JNK在腦缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制作一綜述。
1.1JNK及編碼JNK的基因 JNKs家族是1990年發(fā)現(xiàn)的MAPKs家族成員之一,屬于進(jìn)化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。在脊椎動(dòng)物,編碼JNK的基因包括jnk1、jnk2和jnk3[3,4],其相應(yīng)的編碼產(chǎn)物JNK1和JNK2在各種組織細(xì)胞中廣泛表達(dá),而JNK3則僅在腦、心臟、睪丸等組織中表達(dá)[5]。這3種JNK基因都能編碼46 kD和54 kD 2種蛋白產(chǎn)物[6],它們通過不同的剪接及不同的外顯子形成了10種不同的JNK剪接變體,這10種不同的剪接變體亞型均含有“Thr-Pro-Tyr (TPY)”這一特征性模塊結(jié)構(gòu)[7]。
1.2JNK的上游激活物和下游分子 JNK通路作為 MAPK信號(hào)通路之一也符合多級(jí)蛋白激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng),其中包括3種關(guān)鍵的激酶:MAPK、MAPK的激酶(MAPKK)和MAPK激酶的激酶(MAPKKK)。MAPKKK對(duì)MAPKK的絲氨酸、蘇氨酸雙位點(diǎn)磷酸化而將其活化;進(jìn)而MAPKK對(duì)MAPK進(jìn)行絲氨酸、蘇氨酸雙位點(diǎn)磷酸化活化[8]。JNK的上游激酶是MKK4和MKK7。目前發(fā)現(xiàn)的MAPKKK至少有20種,其中至少有14種能夠激活MKK4/MKK7-JNK/MAPK通路[3],主要包括MAPK/ERK激酶的激酶(MEKK1、2、3、4)、凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(apoptosis signal-regulating kinases, ASK)、混合連接激酶(mixed lineage kinase, MLKs)和TGF-β激活的蛋白激酶(TGF-β-activated protein kinases, TAK)等。JNK最初被發(fā)現(xiàn)是一種特異性磷酸化核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的激酶,并因此被命名為c-Jun氨基末端激酶,隨后發(fā)現(xiàn)其它一些核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子如Ets-like protein 1 (Elk-1)、激活轉(zhuǎn)錄因子2 (activating transcription factor 2,ATF2)、DPC4、激活T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT4)以及ets-2等也是其下游底物,但一直對(duì)JNK的胞漿底物知之甚少。近年來一些研究顯示胞漿中的某些成分(如細(xì)胞骨架蛋白)可能也是其作用底物。此外,He等[9]研究還發(fā)現(xiàn)角蛋白8及角蛋白18分子上均含有c-Jun、ATF-2等分子上決定JNK作用特異性和效率的特定錨著點(diǎn),免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)也表明JNK能夠與角蛋白8/18直接結(jié)合,因此角蛋白8/18是一個(gè)新的JNK胞漿靶分子。此類JNK胞漿底物的發(fā)現(xiàn)具有重要的病理生理意義,它表明JNK信號(hào)通路的激活不僅具有調(diào)節(jié)核內(nèi)基因表達(dá)的作用,還可能通過影響胞漿底物分子的結(jié)構(gòu)與功能而直接、迅速地發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。
1.3JNK信號(hào)通路的激活 JNK信號(hào)通路可被應(yīng)激刺激(如紫外線、熱休克、高滲、缺血再灌注等)、細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)及某些G蛋白偶聯(lián)受體激活。細(xì)胞外刺激可通過Ras依賴或非Ras依賴的2條途徑激活JNK;小分子G蛋白R(shí)as超家族的成員之一Rho可能也是JNK激活的上游信號(hào)[10]。Rho蛋白R(shí)ac可能是與p21激活的絲/蘇氨酸激酶(p21-activating kinase,PAK)結(jié)合,使其自身磷酸化而被激活,活化的PAK進(jìn)一步使JNK激活。激活的JNK經(jīng)過核轉(zhuǎn)位,可激活核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子如c-Jun、Jun-B、Elk-1、DPC4等,再調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的靶基因如及早基因、后期效應(yīng)基因和熱休克基因等的表達(dá),促進(jìn)有關(guān)蛋白的合成和通道的改變,完成對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)。
2.1JNK與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制 在大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12的培養(yǎng)過程中,去除神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF),JNK和p38持續(xù)激活,ERKs的活性被抑制,PC-12細(xì)胞發(fā)生凋亡。而用反義轉(zhuǎn)染特異地抑制JNK和p38的激活,可阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生,從而在神經(jīng)元中首次發(fā)現(xiàn)了JNK的促凋亡作用[11]。另外敲除jnk3基因的小鼠能抵抗興奮毒性谷氨酸受體激動(dòng)劑紅藻氨酸(kainic acid)誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作反應(yīng)和海馬神經(jīng)元興奮毒性凋亡,同時(shí)伴有c-Jun磷酸化和轉(zhuǎn)錄激活蛋白(activator protein-1,AP-1)轉(zhuǎn)錄活性的明顯減低,也說明JNK信號(hào)通路參與了細(xì)胞凋亡。
近期,諸多動(dòng)物模型的研究也證實(shí)了JNK信號(hào)通路參與了腦缺血再灌注后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡,并對(duì)JNK通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了探討。腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡是一個(gè)極其復(fù)雜的過程,細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性路徑(又稱線粒體凋亡途徑)和外源性路徑(又稱死亡受體途徑)均參與了腦缺血后神經(jīng)元的凋亡過程。JNK信號(hào)通路通過調(diào)控線粒體途徑和死亡受體途徑在腦缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡中起重要作用[12],見圖1。(1)線粒體途徑: 腦缺血再灌注期間應(yīng)激反應(yīng)、缺血缺氧、自由基、興奮性氨基酸以及鈣超載等多種刺激因素可激活JNK通路的關(guān)鍵激酶,即MAPK/ERK激酶類的MKK4、MKK7和MAPK/ERK激酶的激酶類的MEKK1、2、3、4。最終導(dǎo)致JNK三肽區(qū)的酪氨酸與蘇氨酸雙磷酸化,從而使其活化并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核[13]。激活的JNK通過刺激其下游底物改變線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(permeability transition pore,PTP)的通透性,促使細(xì)胞色素C(cytochrome C, Cyt C)釋放入胞漿,Cyt C由線粒體釋放出后,與胞漿的凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease-activating factor-1, Apaf-1)以及caspase-9前體(pro-caspase-9)結(jié)合,在ATP存在條件下形成“凋亡體”復(fù)合物(Cyt C+Apaf-1+pro-caspase-9),并由此激活caspase-9[14],活性caspase-9裂解并激活caspase-3,caspase-3激活后一方面直接作為蛋白酶直接降解底物,另一方面激活其它的caspase蛋白酶類,如caspase-6、caspase-7等,共同參與底物的降解,它們是凋亡的直接執(zhí)行者。細(xì)胞凋亡的特征性形態(tài)學(xué)變化,如染色體凝聚和DNA片段化等,均與caspase-3的降解作用直接相關(guān)[15]。Okuno等[16]利用大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occulsion,MCAO)模型,檢測(cè)到腦缺血后60 min MCA區(qū)JNK活性及磷酸化的JNK增加;通過TUNEL 染色及凋亡相關(guān)DNA 片段分析,發(fā)現(xiàn)JNK特異性抑制劑SP600125可阻斷細(xì)胞凋亡因子Bax從胞漿轉(zhuǎn)入線粒體,并進(jìn)一步探討,推測(cè)JNK是通過刺激其可能的下游底物BimL,從而將信號(hào)轉(zhuǎn)到Bax,Bax可引起線粒體通透性改變,釋放Cyt C,釋放的Cyt C和胞漿蛋白Apaf-1結(jié)合,引起Apaf-1寡聚,激活caspase-9,進(jìn)一步激活caspase-3,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。(2)死亡受體途徑:外源性凋亡路徑與細(xì)胞表面死亡受體激活有關(guān),也稱為死亡受體路徑。細(xì)胞表面死亡受體屬于TNF受體家族,包括TNF受體-1(tumor necrosis factor receptor-1,TNFR-1)、Fas受體和p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)。JNK通過磷酸化c-Jun和ATF-2激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1(AP-1是Jun-Jun、Jun-Fos或Jun-ATF的二聚體)[17],從而進(jìn)一步促進(jìn)多種促凋亡蛋白的表達(dá),如p53、Bax、FasL、TNF等。例如,F(xiàn)as配體與Fas受體結(jié)合,這一結(jié)合觸發(fā)了胞內(nèi)Fas相關(guān)性受體蛋白死亡結(jié)構(gòu)域(Fas -associated death domain protein,F(xiàn)ADD)的募集。FADD的N末端包含有死亡效應(yīng)區(qū)域,能與caspase-8前體的死亡效應(yīng)區(qū)域結(jié)合,從而形成“FasL Fas FADD procaspase-8”復(fù)合結(jié)構(gòu),這一復(fù)合結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物,能催化caspase-8前體反式激活,導(dǎo)致自身裂解,形成并釋放活性caspase-8[18]。活性caspase-8從復(fù)合物中釋放出來進(jìn)入胞漿,其既可以直接裂解激活下游的caspase-3,也可間接方式通過線粒體依賴性機(jī)制激活caspase-3,最終導(dǎo)致凋亡。
Figure 1. Mechanism of JNK-mediated neuronal apoptosis in brain ischemia reperfusion injury.Different extracellular stimuli can activate the JNK signalling pathway.The activated JNK mediates neuronal apoptosis in cerebral ischemia/reperfusion-induced brain injury through controlling both the death receptor pathway and the mitochondrial-dependent pathway.
圖1JNK介導(dǎo)腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡機(jī)制
目前JNK在腦缺血再灌注過程中是否參與損傷DNA的修復(fù)功能越來越受到人們的關(guān)注。最近研究發(fā)現(xiàn)[19]建立大鼠全腦缺血再灌注模型后,腦缺血區(qū)p-JNK表達(dá)上調(diào),DNA修復(fù)蛋白XRCC1和Ku70 表達(dá)下調(diào), JNK抑制劑SP600125可減少p-JNK的表達(dá),并使XRCC1和Ku70表達(dá)上調(diào),減輕了全腦缺血再灌注損傷,DNA的修復(fù)功能得到改善,提示JNK可使全腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元DNA修復(fù)功能受損,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與下調(diào)DNA修復(fù)蛋白XRCC1和Ku70的表達(dá)有關(guān)。全腦缺血再灌注時(shí),大量的DNA受到損傷使細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期(S期),損傷的DNA開始進(jìn)行修復(fù),一旦修復(fù)失敗則導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。XRCC1 是一種DNA修復(fù)蛋白,在堿基切除修復(fù)中起整體支架作用,對(duì)氧化劑導(dǎo)致的DNA單鏈斷裂和堿基損傷修復(fù)起重要作用[20]Ku70是DNA依賴蛋白激酶的催化亞單位,能夠啟動(dòng)DNA雙鏈的修復(fù)過程。研究表明,XRCC1和Ku70表達(dá)下調(diào)先于DNA斷裂的發(fā)生。全腦缺血再灌注大鼠大量DNA斷裂與細(xì)胞凋亡有關(guān),XRCC1和Ku70表達(dá)下調(diào)是DNA斷裂無法修復(fù)的機(jī)制之一。然而,JNK下調(diào)XRCC1和Ku70表達(dá)的具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步探討。
2.2JNK與非神經(jīng)細(xì)胞凋亡的關(guān)系 在腦缺血再灌注過程中,非神經(jīng)元性細(xì)胞和神經(jīng)元都處于缺血缺氧的環(huán)境中,因而理論上非神經(jīng)元性細(xì)胞和神經(jīng)元一樣也可發(fā)生缺血再灌注損傷,包括凋亡和壞死。腦組織中非神經(jīng)元性細(xì)胞包括構(gòu)成血管的細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞)、浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。目前大部分的研究并未將缺血后受累腦組織區(qū)域可能存在的非神經(jīng)元性細(xì)胞的凋亡從神經(jīng)元凋亡中區(qū)分開來。事實(shí)上,已經(jīng)有越來越多的研究明確了腦缺血后非神經(jīng)元性細(xì)胞凋亡的存在。Lennmyr等[21]在大鼠MCAO模型中采用免疫組化方法發(fā)現(xiàn)缺血后活化的JNK未在神經(jīng)元中表達(dá),僅在損傷側(cè)的動(dòng)脈血管和膠質(zhì)細(xì)胞中出現(xiàn),提示JNK可能參與了腦缺血再灌注后的非神經(jīng)源性細(xì)胞凋亡。另有研究報(bào)道[22]大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞后星形細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞caspase-3和其它多種caspase蛋白水平都上調(diào)了。JNK信號(hào)通路介導(dǎo)的非神經(jīng)元性細(xì)胞凋亡的研究資料目前仍然較少,其機(jī)制是否與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡機(jī)制一致尚無足夠證據(jù),其在腦缺血再灌注后神經(jīng)系統(tǒng)損傷及預(yù)后中的重要性應(yīng)當(dāng)逐漸受到重視。
大量研究表明JNK信號(hào)通路參與了腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,抑制JNK通路可保護(hù)神經(jīng)元免受損傷。但是Yun等[23]報(bào)道,JNK通路在抗凋亡過程中起到了重要的作用,其機(jī)制與激活蛋白酶活化受體-1(protease-activated receptor-1,PAR-1)從而使神經(jīng)細(xì)胞免受毒素的損傷有關(guān)。且最新研究表明[24]腦缺血再灌注后JNK/c-Jun/AP-1通路可引起14-3-3-γ表達(dá)上調(diào),而14-3-3 -γ表達(dá)上調(diào)可抑制腦缺血再灌注引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡,說明JNK信號(hào)通路可間接起到神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。另有研究表明JNK在腦缺血再灌注損傷過程中具有雙向作用,缺血早期JNK的激活促進(jìn)細(xì)胞生存,而晚期JNK的激活則導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。然而諸多實(shí)驗(yàn)卻仍表明腦缺血再灌注后JNK/c-Jun/AP-1通路的激活與細(xì)胞凋亡有關(guān)。目前對(duì)JNK通路在腦缺血再灌注損傷中到底是起到促凋亡還是抗凋亡作用還存在爭(zhēng)議,但毋庸置疑,JNK通路在各種原因引起的腦缺血再灌注損傷機(jī)制中起著重要的作用。因此,JNK通路的組成及調(diào)節(jié)機(jī)制為相關(guān)疾病的治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)。
[1] Kim EK, Choi EJ. Pathological roles of MAPK signaling pathways in human diseases[J]. Biochim Biophys Acta, 2010, 1802(4): 396-405.
[2] Kuan CY, Whitmarsh AJ, Yang DD, et al. A critical role of neural specific JNK3 for ischemia apoptosis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(25): 15184-15189.
[3] Johnson GL, Nakamura K. The c-jun kinase / stress-activated pathway: regulation function and role in hunman disease[J]. Biochim Biophys Acta, 2007, 1773(8): 1341-1348.
[4] Bogoyevitch MA. The isform-specific functions of the c-Jun N- terminal kinases (JNKs): differences revealed by gene targeting[J]. Bioessays, 2006, 28(9): 923-934.
[5] Ye DQ, Gao WJ, Yan FX, et al. Astregalus injection inhibits c-Jun N terminal kinase mRNA expression following oxygen-glucose deprivation and reintroduction in rat hippocampal neurons[J]. Neural Regen Res, 2009,4(11):879-884.
[6] Praveen KR, Farzana R, Jack B, et al. Role of the JNK signal transduction pathway in inflammatory bowel disease[J]. World J Gastroenterol, 2008, 14(2): 200-202.
[7] 王 寧,薛榮亮,c-Jun氨基末端激酶(JNKs)與腦缺血性損傷[J].國(guó)際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志,2007, 28(2): 166-169.
[8] 張雅麗,高維娟. c-Jun氨基末端激酶與caspase在細(xì)胞凋亡中的作用及相互關(guān)系[J].中國(guó)病理生理雜志, 2009,25(3): 607-609、613.
[9] He T, Stepulak A, Holmstr?m TH, et al. The intermediate filament protein keratin 8 is a novel cytoplasmic substate for c-Jun N-terminal kinase[J]. J Biol Chem, 2002, 277(13): 10767-10774.
[10]Minden A, Lin A, Claret FX, et al. Selective activation of the JNK signaling cascade and c-Jun transcriptional activity by the small GTPases Rac and Cdc-42Hs[J]. Cell, 1995, 81(7): 1147-1157.
[11]Xia Z, Dickens M, Raingeaud JI, et al. Opposing effects of ERK and JNK-P38 MAP kinases on apoptosis[J]. Science, 1995, 270(5240): 1326-1331.
[12]Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death[J]. Toxicol Pathol, 2007, 35(4): 495-516.
[13]Verna L, Ganda C, Stemerman MB.Invivolow-density lipoprotein exposure induces intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 correlated with activator protein-1 expression[J]. Arterioscler Thromb Vasl Bid, 2006, 26 (6): 1344-1349.
[14]Love S. Apoptosis and brian ischaemia[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2003, 27(2):267-282.
[15]Poter AG, Janicke RU. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis[J]. Cell Death Differ, 1999, 6(2): 99-104.
[16]Okuno S, Saito A,Hayashi T, et al. The c-Jun N-terminal protein kinase signaling pathway mediates Bax activation and subsequent neuronal apoptosis through interaction with Bim after transient focal cerebral ischemia[J]. J Neurosci, 2004, 24(36): 7879-7887.
[17]李 勇, 鄧小龍, 邵勝敏, 等.c-Jun氨基末端激酶在慢性低O2高CO2大鼠海馬損傷中的作用[J].中國(guó)病理生理雜志, 2009, 25(5): 914-918.
[18]吉康祥,李 捷,邱彩霞,等.腦缺血后細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)卒中雜志,2010, 5(1): 66-72.
[19]Wang N, Rong LX, Feng ZY, et al. Neuronal effects of SP600125 pretreatment in a rat model of cerebral ischemia/referfusion injury:inhibited down-regulation f DNA repair protein[J]. Neural Regen Res, 2009, 4(12):1055-1061.
[20]Horton JK, Watson M, Stefanick DF, et al. XRCC1 and DNA polymerase β in cellular protection against cytotoxic DNA single-strand breaks[J]. Cell Res, 2008, 18(1): 48-63.
[21]Lennmyr F, Karlsson S, Gerwins P, et al. Activation of mitogen-activated protein kinases in experimental cerebral ischemia[J]. Acta Neurol Scand, 2002, 106(6): 333-340.
[22]Krupinski J, Lopez E, Marti E, et al. Expression of caspases and their substrates in the rat model of focal cerebral ischemia[J]. Neurobiol Dis, 2000, 7(4):332-342.
[23]Yun H, Kim HS, Lee S, et al. AMP kinase signaling determines whether c-Jun N-terminal kinase promotes survival or apoptosis during glucose deprivation[J]. Carcinogenesis, 2009, 30(3): 529-537.
[24]Dong Y, Liu HD, Zhao R, et al. Ischemia activaties JNK/c-Jun/AP-1 pathway to up-regulate 14-3-3γ in astrocyte[J]. J Neurochem, 2009,109(Suppl 1): 182-188.
Roleofc-JunN-terminalkinaseinbrainischemiareperfusioninjury
LIU Sha-sha, GAO Wei-juan
(DepartmentofPathophysiology,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China.E-mail:gwj6088@163.com)
c-Jun N-terminal kinase (JNK), a member of the mitogen-activated protein kinase family, is activated in response to a number of extracellular stimuli, including inflammatory cytokines, UV irradiation and ischaemia. A large amount of evidence supports the key role for JNK signaling in stress-induced apoptosis. Recent studies suggest that JNK signaling pathway is involved in neuron death by controlling both the death receptor pathway and the mitochondrial-dependent pathway after transient ischemia. The role of the JNK signaling pathway in brain ischemia reperfusion injury is overviewed in this article.
JNK通路; 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo); 腦缺血再灌注; 細(xì)胞凋亡
JNK pathway; Signal transduction; Brain ischemia reperfusion; Apoptosis
R363
A
1000-4718(2011)03-0607-04
2010-06-09
2010-10-16
教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.NCET-06-0258);河北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(No.C2006000865)
△通訊作者 Tel:0311-85110168;E-mail:gwj6088@163.com
10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.038