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    哮喘兒童支氣管肺泡灌洗液IL-17、IL-8和VEGF水平測定及意義*

    2011-10-24 02:01:12趙靈芝盧美萍
    中國病理生理雜志 2011年3期
    關鍵詞:中性酸性粒細胞

    趙靈芝, 盧美萍

    (浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院呼吸科,浙江 杭州 310003)

    ·短篇論著·

    哮喘兒童支氣管肺泡灌洗液IL-17、IL-8和VEGF水平測定及意義*

    趙靈芝, 盧美萍△

    (浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院呼吸科,浙江 杭州 310003)

    目的Th17細胞是以分泌IL-17為主的新型T細胞亞群,其在哮喘中的作用尚不十分清楚。本文通過觀察哮喘急性發(fā)作兒童支氣管肺泡灌洗液(BALF)IL-17、IL-8、血管內皮生長因子(VEGF)等的水平變化,探討其在哮喘急性發(fā)作兒童氣道炎癥中的作用。方法我院2009年2月-2009年12月期間行纖維支氣管鏡檢查患兒共88例,包括哮喘急性發(fā)作組(哮喘組,n=52)、非喘息組(肺炎組,n=25)及對照組(n=11),收集所有病例的BALF,進行細胞學分類,ELISA法測定BALF中細胞因子IL-17、IL-8、VEGF、IL-4、IFN-γ和IL- 4/IFN-γ水平。結果與對照組比較,哮喘組和肺炎組患兒的IL-17和IL-8水平均明顯增高(均P<0.05);哮喘組患兒的IL-8水平較肺炎組低(P<0.05),而2組IL-17水平無顯著差異(P>0.05);與肺炎組和對照組比較,哮喘組患兒VEGF水平明顯增高(均P<0.01);肺炎組與對照組患兒VEGF水平無顯著差異(P>0.05);3組患兒的IL-4,IFN-γ和IL-4/IFN-γ水平均無顯著差異(均P>0.05)。與對照組比較,哮喘組及肺炎組患兒中性粒細胞百分比明顯增高(均P<0.01),而哮喘組與肺炎組患兒的中性粒細胞百分比無顯著差異(P> 0.05)。結論IL-17、IL-8及VEGF在哮喘兒童氣道炎癥中發(fā)揮重要作用,Th17細胞可能參與兒童哮喘急性發(fā)作的發(fā)病機制。

    哮喘; 兒童; 支氣管肺泡灌洗液; 白細胞介素 17; 細胞因子類

    支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種炎癥細胞、炎癥介質及細胞因子參與的常見兒童氣道炎癥性疾病。2009GINA數據顯示,全球約有3億人口罹患哮喘,根據不同國家的不同診斷標準,患病率高達1%-18%,包括哮喘的兒童、成人以及喘息患兒。但是,關于兒童哮喘的發(fā)生機制仍未完全明了,兒童哮喘是否存在氣道重塑尚存在爭議。隨著兒童纖維支氣管鏡的開展,與血標本相比,支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)的獲得為我們的研究提供了更直接可靠的數據。Th17細胞是以分泌IL-17為主的新型T細胞亞群,近年研究發(fā)現其與過敏性疾病的炎癥反應相關;血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)過量表達可促使氣道黏膜血管的新生和數目增多,參與哮喘氣道的血管重塑過程[1],但關于其在兒童哮喘急性發(fā)作中的作用則報道較少。本研究將通過觀察哮喘急性發(fā)作患兒BALF中IL-17、VEGF、IL-8、IL-4和IFN-γ水平的變化,探討IL-17及相關細胞因子在哮喘兒童氣道炎癥中的作用。

    材 料 和 方 法

    1對象

    88例行纖維支氣管鏡檢查的患兒,均為我院2009年2月-2009年12月期間的住院患兒。病例分為3組:(1)哮喘急性發(fā)作組(哮喘組,n=52):男37例,女15例,年齡7個月-12歲8個月,平均年齡1歲11個月。均符合2008年中華醫(yī)學會兒童支氣管哮喘防治指南[2],患兒入院時均有喘息癥狀,聽診可聞及哮鳴音,既往喘息≥2次,并經纖維支氣管鏡等檢查排除支氣管異物,喉軟化、氣管支氣管狹窄等先天性氣道異常引起的喘息;(2)非喘息組(肺炎組,n=25):其中男18例,女7例,年齡11個月-12歲11個月,平均年齡2歲?;純喝朐簳r均符合肺炎診斷標準,但無喘息癥狀,聽診無哮鳴音,既往無喘息或哮喘病史,無個人及家族過敏史;(3)對照組(n=11):其中男8例,女3例,年齡10個月-9歲6個月,平均年齡2歲1個月,6例經纖維支氣管鏡檢查診斷為支氣管異物,病程均小于3 d,另5例為甲狀腺囊腫或眼瞼外翻外科手術非感染患兒,既往均無喘息或哮喘病史,無個人及家族過敏史,除外心、肝、腎、血液等系統(tǒng)的慢性疾病。各組間年齡、性別比較,差異均無顯著(P>0.05)。

    2方法

    2.1病史采集 患兒入院時詳細詢問病史,包括個人及家族過敏史,既往喘息史。

    2.2BALF的收集及處理 患兒入院2-5 d內(急性期)行纖維支氣管鏡檢查。哮喘組、肺炎組及外科手術對照組患兒多選右肺中葉或左肺舌葉,或者局限性支氣管肺部病變相應的支氣管肺段進行灌洗,支氣管異物對照組患兒選擇病灶的對側肺進行灌洗,灌洗液選用37 ℃滅菌生理鹽水,每次灌洗量為0.5 mL/kg,共3次,每次回收應大于60%。將回收的灌洗液用2層紗布過濾黏液,立即置4 ℃、4 000 r/min離心15 min。離心后取上清液,凍存于-80 ℃冰箱中待檢,沉淀用于細胞學分類計數。

    2.3ELISA法檢測BALF上清液中的 IL-17、IL-8、VEGF、IL-4與IFN-γ IL-17試劑盒購自R&D。IL-8、VEGF試劑盒購自RayBiotech。IL-4和IFN-γ試劑盒購自上海明睿生物技術有限公司,采用ELISA方法按各說明書操作,單位為ng/L。

    2.4BCA法檢測BALF上清液中的蛋白含量 采用Bicinchoninic acid (BCA)法測定BALF上清中的總蛋白含量,單位為g protein/L。

    2.5BALF細胞學分類 將剩余的少許上清液及沉淀振蕩10 s混勻,取1滴置玻片上涂成均勻薄片,室溫干燥后甲醇固定2-3 min,置瑞氏姬姆薩染色劑中染色10-15 min,取出清水沖洗2-3 min,加1滴甘油后置顯微鏡下觀察計數,中性粒細胞的胞質呈無色或極淺的淡紅色,有許多彌散分布的細小的淺紅或淺紫色的特有顆粒, 細胞核呈桿狀或分葉狀;嗜酸性粒細胞的胞質充滿粗大的鮮紅色嗜酸性顆粒;巨噬細胞比前2種細胞略大,胞核較小,胞質呈嗜酸性,有明顯的吞噬小泡;淋巴細胞一般形態(tài)較小,胞核大而圓,染色深,胞質少,呈天藍色。

    3統(tǒng)計學處理

    由于數據呈偏態(tài)分布(IL-4為正態(tài)分布),IL-17、IL-8、VEGF、IL-4和IFN-γ數據以中位數(四分位差),即M(Qd)表示,單位為ng/g protein;細胞學分類數據以中位數(四分位差)表示,即M(Qd),單位為%。用SPSS統(tǒng)計軟件(16.0)進行數據處理,采用秩和檢驗。

    結 果

    1各組間BALF中IL-17水平變化

    與對照組比較,哮喘組患兒和肺炎組患兒的IL-17水平顯著增高[35.85(10.75)ng/g proteinvs42.95(24.1) ng/g protein,35.85(10.75) ng/g proteinvs42.95(16.05) ng/g protein,均P< 0.05];而哮喘組與肺炎組患兒IL-17水平無顯著差異[42.95(24.1) ng/g proteinvs42.95(16.05) ng/g protein,P>0.05],見圖1A。

    2各組間BALF中IL-8水平變化

    與對照組比較,哮喘組和肺炎組患兒IL-8水平明顯增高[515.25(508.90) ng/g proteinvs945.05(1 277.35) ng/g protein,515.25(508.90) ng/g proteinvs1 544.85(1 429.50) ng/g protein,均P< 0.05];而肺炎組IL-8水平較哮喘組增高更顯著[1 544.85(1 429.50) ng/g proteinvs945.05(1 277.35) ng/g protein,P< 0.05),見圖1B。

    3各組間BALF中VEGF水平變化

    哮喘組患兒VEGF水平較肺炎組及對照組均明顯增高[1 250.45(1353.30) ng/g proteinvs643.00(900.90) ng/g protein,1 250.45(1 353.30) ng/g proteinvs561.80(979.35) ng/g protein,均P< 0.01],而肺炎組與對照組患兒VEGF水平無顯著差異[643.00(900.90) ng/g proteinvs561.80(979.35) ng/g protein,P>0.05] ,見圖1C。

    4各組間BALF中IL-4、IFN-γ和IL-4/IFN-γ水平變化

    對照組、哮喘組及肺炎組患兒的IL-4水平分別為77.95(17.75) ng/g protein、80.30(16.45) ng/g protein 和78.40(12.80) ng/g protein,3組之間比較無顯著差異,均P>0.05;IFN-γ水平分別為36.50(15.75) ng/g protein、41.25(6.90) ng/g protein和 42.65(20.15) ng/g protein,3組之間比較無顯著差異,均P>0.05;IL-4/IFN-γ比值分別為0.46(0.25)、0.54(0.15)和0.57(0.19),3組之間比較無顯著差異,均P>0.05 ,見圖1D。

    Figure 1. The levels of IL-17, IL-8, VEGF, IL-4 and IFN-γ in BALF in children. Compared with the control, levels of IL-17 and IL-8 were significantly elevated in asthma and pneumonia group (allP<0.05). Compared with pneumonia, there was a lower level of IL-8(P<0.05) in patients with asthma (Fig 1A, 1B). Compared with pneumonia or control group, the level of VEGF was significantly increased in asthma group (bothP<0.01)(Fig 1C). There was no statistical difference in the levels of IL-4 or IFN-γ among groups(Fig 1D). Each bar represents the M(Qd).Control:n=11;asthma:n=52; pneumonia:n=25.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vspneumonia group.

    圖1各組BALF中細胞因子IL-17、IL-8、VEGF、IL-4和IFN-γ表達水平

    5各組BALF細胞學分類

    與對照組比較,哮喘組和肺炎組患兒BALF中性粒細胞百分比明顯增高[1.91(1.64) %vs22.38(25.22) %,1.91(1.64) %vs29.12(25.15) %,均P<0.01],而哮喘組與肺炎組患兒比較差異無顯著[22.38(25.22) %vs29.12(25.15) %,P>0.05];與對照組比較,哮喘組和肺炎組患兒BALF巨噬細胞百分比顯著降低[88.64(2.42) %vs64.12(25.46) %,88.64(2.42) %vs50.36(25.99) %,均P< 0.01],而哮喘組患兒巨噬細胞百分比高于肺炎組 [50.36(25.99) %vs64.12(25.46) %,P<0.05];與肺炎組比較,哮喘組和對照組患兒BALF淋巴細胞百分比均明顯降低[18.76(19.40) %vs11.75(8.24) %,18.76(19.40) %vs9.09(2.47) %,均P<0.05],哮喘組與對照組比較差異無顯著[11.75(8.24) %vs9.09(2.47) %,P>0.05];對照組、哮喘組和肺炎組患兒BALF嗜酸性細胞百分比分別為0.27(0.47) %、1.94(4.79) %和1.76(2.28) %,3組之間比較均無顯著差異,見圖2。

    討 論

    以往研究者認為,哮喘是由Th2細胞和IgE介導的Ⅰ型變態(tài)反應性慢性氣道疾病,其特點是嗜酸性粒細胞浸潤的氣道炎癥[3],小鼠哮喘模型的BALF中嗜酸性細胞比例可達60%-70%,而中性粒細胞不足5%-10%[4]。但目前越來越多的學者致力于中性粒細胞參與為主的“非Th2型哮喘”的研究,認為中性粒細胞參與哮喘的急性發(fā)病及惡化過程[5]。本研究結果也顯示,與對照組比較,哮喘組兒童BALF的中性粒細胞顯著增高,而嗜酸性粒細胞變化不明顯,表明中性粒細胞而非嗜酸性粒細胞參與的氣道炎癥可能是導致兒童哮喘急性發(fā)作的主要原因之一。另一方面,感染而非過敏可能是兒童哮喘急性發(fā)作的誘因。

    Figure 2. The percentage of cells in BALF in children. Compared with the control, there were higher percentages of neutrophil and lymphocyte but lower percentage of macrophage in BALF in asthma and pneumonia group (P<0.05 orP< 0.01). There was no statistical difference between asthma and pneumoniae groups(P>0.05). Each bar represents the M(Qd). Control:n=11;asthma:n=52;pneumonia:n=25.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vspneumonia group.

    圖2各組BALF中細胞分類情況

    有研究顯示,輕中型哮喘多以嗜酸性粒細胞浸潤為主,而重型哮喘氣道中性粒細胞比例顯著增高[6],而且氣道中性粒細胞比例與病變程度呈正相關。已知IL-8對中性粒細胞具有很強的趨化和激活作用, IL-8可選擇性趨化中性粒細胞,誘導和增強其脫顆粒及殺菌作用,同時活化的中性粒細胞也能產生IL-8,形成正反饋,進一步加重氣道炎癥,導致組織破壞[7]。最新研究還發(fā)現,另一新型的細胞因子,Th17細胞分泌的IL-17也參與哮喘氣道中性粒細胞的增殖、成熟和趨化,且IL-17的表達與中性粒細胞性炎癥程度呈正相關[8]。與之相反,在OVA致敏的小鼠模型中,IL-17對氣道嗜酸性粒細胞募集所起的作用不大[9],而且,在Th2細胞介導的哮喘激發(fā)期,IL-17能有效減少嗜酸性粒細胞的浸潤[10]。因此,IL-17可能參與了“非嗜酸性哮喘”的致病過程,成為區(qū)分“Th2型哮喘”和“非Th2型哮喘”的重要標志。另外,IL-17還誘導人類氣道上皮細胞產生IL-8,加強TNF介導IL-8的產生,間接參與氣道的中性粒細胞炎癥[11]。本研究結果顯示,哮喘急性發(fā)作患兒BALF的中性粒細胞、IL-17和IL-8均明顯增高,表明氣道中性粒細胞浸潤與兒童哮喘急性發(fā)作關系密切,IL-17和IL-8均在兒童氣道炎癥中發(fā)揮重要作用,可能參與哮喘急性發(fā)作兒童氣道中性粒細胞而非嗜酸性粒細胞的趨化與浸潤,本研究結果還顯示,肺炎組患兒IL-17水平和中性粒細胞百分比也明顯增高,而且肺炎組患兒IL-8水平顯著高于哮喘組和對照組,表明IL-17和IL-8也參與非哮喘兒童的氣道炎癥。

    氣道黏膜下血管數目的增多、管徑增粗以及新血管的形成是哮喘氣道重塑的一個重要特征和關鍵環(huán)節(jié)。已知轉化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)蛋白家族和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)在哮喘的氣道重塑作用中發(fā)揮重要作用,但關于VEGF在哮喘氣道重塑中的作用報道較少。Ribatti等[1]研究表明,VEGF過量表達可促使氣道黏膜血管的新生和數目增多,導致血管容積及氣道壁厚度的增加。Siddiqui等[12]研究還顯示,VEGF不但參與了哮喘患者的血管重塑過程,而且上調Th2型氣道炎癥反應,黏液腺增生,誘導MMP-9的表達,趨化中性粒細胞及嗜酸性細胞,參與氣道水腫和氣道高反應性。本組數據表明,哮喘組VEGF水平顯著高于肺炎組及對照組,提示在哮喘急性發(fā)作兒童中可能存在氣道重塑,VEGF在其中發(fā)揮重要作用。另外,Kim等[13]研究發(fā)現,用含LPS致敏原致敏的非嗜酸性哮喘模型中,VEGF升高可通過上調Th1和Th17細胞分化因子,促使幼稚T細胞向Th1和Th17細胞分化。

    盡管以往研究表明,Th2細胞優(yōu)勢應答在哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用,并且有動物研究表明哮喘模型的血或BALF中IL-4及IL-4/IFN-γ比值明顯上升[14]。但最新有研究表明,Th2細胞主要參與嗜酸性哮喘的免疫應答,而Th1和Th17細胞參與非嗜酸性哮喘的免疫應答[13]。本研究結果顯示,在哮喘急性發(fā)作兒童BALF中Th2型細胞因子IL-4、Th1型細胞因子IFN-γ以及IL-4/IFN-γ比值未見明顯上升,可能與本組病例年齡偏小(大多在3歲以內)、而且嬰幼兒喘息大多為感染誘發(fā)有關,也進一步說明哮喘可能存在Th2介導的嗜酸性哮喘以外的、如Th17介導的非嗜酸粒細胞性哮喘的炎癥反應。

    綜上所述,IL-17和IL-8在哮喘急性發(fā)作兒童氣道炎癥中發(fā)揮重要作用,Th17細胞可能參與兒童哮喘急性發(fā)作的發(fā)病機制,作用機制可能與其誘導氣道中性粒細胞浸潤有關。同時,VEGF參與哮喘急性發(fā)作患兒的氣道重塑。

    [1] Ribatti D, Puxeddu I, Crivellato E, et al. Angiogenesis in asthma[J]. Clin Exp Allergy, 2009, 39(12): 1815-1821.

    [2] 中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組,《中華兒科雜志》編輯委員會.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[J]. 中華兒科雜志, 2008,46(10):745-753.

    [3] Bogaert P, Tournoy KG, Naessens T, et al. Where asthma and hypersensitivity pneumonitis meet and differ: noneosinophilic severe asthma [J]. Am J Pathol, 2009, 174(1): 3-13.

    [4] Nakae S, Lunderius C, Ho LH, et al. TNF can contribute to multiple features of ovalbumin-induced allergic inflammation of the airways in mice[J]. J Allergy Clin Immun, 2007, 119(3): 680-686.

    [5] Oboki K, Ohno T, Saito H, et al. Th17 and allergy[J]. Allergol Int, 2008, 57(2): 121-134.

    [6] Kim YK, Oh SY, Jeon SG, et al. Airway exposure levels of lipopolysaccharide determine type 1 versus type 2 experimental asthma[J]. J Immunol, 2007, 178(8): 5375-5382.

    [7] 謝 華,何韶衡,魏繼福,等. 哮喘患者痰中IL-18、IL-16、IL-8、嗜酸性粒細胞趨化因子水平和類糜蛋白酶活性的測定[J]. 中國病理生理雜志,2005,21(11):2201-2204.

    [8] Wakashin H, Hirose K, Iwamoto I, et al. Role of IL-23-Th17 cell axis in allergic airway inflammation[J]. Int Arch Allergy Immunol, 2009, 149 (Suppl 1): 108-112.

    [9] He R, Oyoshi MK, Jin H, et al. Epicutaneous antigen exposure induces a Th17 response that drives airway inflammation after inhalation challenge[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(40): 15817-15822.

    [10]Schnyder-Candrian S, Togbe D, Couillin I, et al. Interleukin-17 is a negative regulator of established allergic asthma[J]. J Exp Med, 2006, 203(12): 2715-2725.

    [11]van den Berg A, Kuiper M, Snoek M, et al. Interleukin-17 induces hyperresponsive interleukin-8 and interieukin-6 production to tumor necrosis factor-alpha in structural lung cells[J]. Am J Resp Cell Mol, 2005, 33(1): 97-104.

    [12]Siddiqui S, Sutcliffe A, Shikotra A, et al. Vascular remodeling is a feature of asthma and nonasthmatic eosinophilic bronchitis[J]. J Allergy Clin Immunol, 2007, 120(4): 813-819.

    [13]Kim YS, Hong SW, Choi JP, et al. Vascular endothelial growth factor is a key mediator in the development of T cell priming and its polarization to type 1 and type 17 T helper cells in the airways[J]. J Immunol, 2009, 183(8): 5113-5120.

    [14]潘世秀,曾天舒,崔天盆,等. 地塞米松對實驗性哮喘小鼠Th1/Th2細胞因子的影響及其機制的探討[J]. 中國病理生理雜志, 2007,23(6):1141-1144.

    LevelsofIL-17,IL-8andVEGFinbronchoalveolarlavagefluidinasthmachildren

    ZHAO Ling-zhi, LU Mei-ping

    (Children’sHospital,ZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310003,China.E-mail:meipinglu@126.com)

    AIM: To investigate the mechanism of airway inflammation in children with asthma by determining the levels of IL-17, IL-8 and vascular endothelial growth factor(VEGF) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF).METHODSEighty-eight children were enrolled in the study and divided into asthma group (n=52), pneumonia group (n=25) and control group (n=11). BALF were collected from all 88 cases. The levels of IL-17, IL-8, VEGF, IL-4 and IFN-γ in BALF were measured by ELISA. The cell types in BALF were determined.RESULTSCompared with the control, the levels of IL-17 and IL-8 were significantly elevated in asthma group and pneumonia group (allP<0.05). The level of IL-8 (P<0.05) in the patients with asthma was lower than that in the pneumonia patients. No statistical difference of the IL-17 level between asthma group and pneumoniae group was observed (P>0.05). Compared with pneumonia group and control group, the level of VEGF was significantly increased in asthma group (allP<0.01), and the VEGF level among control group and pneumonia groups was almost similar (P>0.05). The levels of IL-4 and IFN-γ, and ratio of IL-4/IFN-γ among groups were not statistically different. The percentage of neutrophils in BALF was significantly higher in asthma group and pneumonia group than that in control group (allP<0.01).CONCLUSIONIL-17, IL-8 and VEGF play important roles in airway inflammation in children with asthma. Th17 cells may participate in the pathogenesis of asthma in children.

    Asthma; Child; Bronchoalveolar lavage fluid; Interleukin-17; Cytokines

    R562.2+5

    A

    1000-4718(2011)03-0577-04

    2010-09-27

    2010-12-20

    國家自然科學基金資助項目(No. 81070012);浙江省自然科學基金資助項目(No.Y2090339 )

    △通訊作者 Tel: 0571-87061007-70411; E-mail: meipinglu@126.com

    10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.030

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