• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    哮喘兒童支氣管肺泡灌洗液IL-17、IL-8和VEGF水平測定及意義*

    2011-10-24 02:01:12趙靈芝盧美萍
    中國病理生理雜志 2011年3期
    關鍵詞:中性酸性粒細胞

    趙靈芝, 盧美萍

    (浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院呼吸科,浙江 杭州 310003)

    ·短篇論著·

    哮喘兒童支氣管肺泡灌洗液IL-17、IL-8和VEGF水平測定及意義*

    趙靈芝, 盧美萍△

    (浙江大學醫(yī)學院附屬兒童醫(yī)院呼吸科,浙江 杭州 310003)

    目的Th17細胞是以分泌IL-17為主的新型T細胞亞群,其在哮喘中的作用尚不十分清楚。本文通過觀察哮喘急性發(fā)作兒童支氣管肺泡灌洗液(BALF)IL-17、IL-8、血管內皮生長因子(VEGF)等的水平變化,探討其在哮喘急性發(fā)作兒童氣道炎癥中的作用。方法我院2009年2月-2009年12月期間行纖維支氣管鏡檢查患兒共88例,包括哮喘急性發(fā)作組(哮喘組,n=52)、非喘息組(肺炎組,n=25)及對照組(n=11),收集所有病例的BALF,進行細胞學分類,ELISA法測定BALF中細胞因子IL-17、IL-8、VEGF、IL-4、IFN-γ和IL- 4/IFN-γ水平。結果與對照組比較,哮喘組和肺炎組患兒的IL-17和IL-8水平均明顯增高(均P<0.05);哮喘組患兒的IL-8水平較肺炎組低(P<0.05),而2組IL-17水平無顯著差異(P>0.05);與肺炎組和對照組比較,哮喘組患兒VEGF水平明顯增高(均P<0.01);肺炎組與對照組患兒VEGF水平無顯著差異(P>0.05);3組患兒的IL-4,IFN-γ和IL-4/IFN-γ水平均無顯著差異(均P>0.05)。與對照組比較,哮喘組及肺炎組患兒中性粒細胞百分比明顯增高(均P<0.01),而哮喘組與肺炎組患兒的中性粒細胞百分比無顯著差異(P> 0.05)。結論IL-17、IL-8及VEGF在哮喘兒童氣道炎癥中發(fā)揮重要作用,Th17細胞可能參與兒童哮喘急性發(fā)作的發(fā)病機制。

    哮喘; 兒童; 支氣管肺泡灌洗液; 白細胞介素 17; 細胞因子類

    支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種炎癥細胞、炎癥介質及細胞因子參與的常見兒童氣道炎癥性疾病。2009GINA數據顯示,全球約有3億人口罹患哮喘,根據不同國家的不同診斷標準,患病率高達1%-18%,包括哮喘的兒童、成人以及喘息患兒。但是,關于兒童哮喘的發(fā)生機制仍未完全明了,兒童哮喘是否存在氣道重塑尚存在爭議。隨著兒童纖維支氣管鏡的開展,與血標本相比,支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)的獲得為我們的研究提供了更直接可靠的數據。Th17細胞是以分泌IL-17為主的新型T細胞亞群,近年研究發(fā)現其與過敏性疾病的炎癥反應相關;血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)過量表達可促使氣道黏膜血管的新生和數目增多,參與哮喘氣道的血管重塑過程[1],但關于其在兒童哮喘急性發(fā)作中的作用則報道較少。本研究將通過觀察哮喘急性發(fā)作患兒BALF中IL-17、VEGF、IL-8、IL-4和IFN-γ水平的變化,探討IL-17及相關細胞因子在哮喘兒童氣道炎癥中的作用。

    材 料 和 方 法

    1對象

    88例行纖維支氣管鏡檢查的患兒,均為我院2009年2月-2009年12月期間的住院患兒。病例分為3組:(1)哮喘急性發(fā)作組(哮喘組,n=52):男37例,女15例,年齡7個月-12歲8個月,平均年齡1歲11個月。均符合2008年中華醫(yī)學會兒童支氣管哮喘防治指南[2],患兒入院時均有喘息癥狀,聽診可聞及哮鳴音,既往喘息≥2次,并經纖維支氣管鏡等檢查排除支氣管異物,喉軟化、氣管支氣管狹窄等先天性氣道異常引起的喘息;(2)非喘息組(肺炎組,n=25):其中男18例,女7例,年齡11個月-12歲11個月,平均年齡2歲?;純喝朐簳r均符合肺炎診斷標準,但無喘息癥狀,聽診無哮鳴音,既往無喘息或哮喘病史,無個人及家族過敏史;(3)對照組(n=11):其中男8例,女3例,年齡10個月-9歲6個月,平均年齡2歲1個月,6例經纖維支氣管鏡檢查診斷為支氣管異物,病程均小于3 d,另5例為甲狀腺囊腫或眼瞼外翻外科手術非感染患兒,既往均無喘息或哮喘病史,無個人及家族過敏史,除外心、肝、腎、血液等系統(tǒng)的慢性疾病。各組間年齡、性別比較,差異均無顯著(P>0.05)。

    2方法

    2.1病史采集 患兒入院時詳細詢問病史,包括個人及家族過敏史,既往喘息史。

    2.2BALF的收集及處理 患兒入院2-5 d內(急性期)行纖維支氣管鏡檢查。哮喘組、肺炎組及外科手術對照組患兒多選右肺中葉或左肺舌葉,或者局限性支氣管肺部病變相應的支氣管肺段進行灌洗,支氣管異物對照組患兒選擇病灶的對側肺進行灌洗,灌洗液選用37 ℃滅菌生理鹽水,每次灌洗量為0.5 mL/kg,共3次,每次回收應大于60%。將回收的灌洗液用2層紗布過濾黏液,立即置4 ℃、4 000 r/min離心15 min。離心后取上清液,凍存于-80 ℃冰箱中待檢,沉淀用于細胞學分類計數。

    2.3ELISA法檢測BALF上清液中的 IL-17、IL-8、VEGF、IL-4與IFN-γ IL-17試劑盒購自R&D。IL-8、VEGF試劑盒購自RayBiotech。IL-4和IFN-γ試劑盒購自上海明睿生物技術有限公司,采用ELISA方法按各說明書操作,單位為ng/L。

    2.4BCA法檢測BALF上清液中的蛋白含量 采用Bicinchoninic acid (BCA)法測定BALF上清中的總蛋白含量,單位為g protein/L。

    2.5BALF細胞學分類 將剩余的少許上清液及沉淀振蕩10 s混勻,取1滴置玻片上涂成均勻薄片,室溫干燥后甲醇固定2-3 min,置瑞氏姬姆薩染色劑中染色10-15 min,取出清水沖洗2-3 min,加1滴甘油后置顯微鏡下觀察計數,中性粒細胞的胞質呈無色或極淺的淡紅色,有許多彌散分布的細小的淺紅或淺紫色的特有顆粒, 細胞核呈桿狀或分葉狀;嗜酸性粒細胞的胞質充滿粗大的鮮紅色嗜酸性顆粒;巨噬細胞比前2種細胞略大,胞核較小,胞質呈嗜酸性,有明顯的吞噬小泡;淋巴細胞一般形態(tài)較小,胞核大而圓,染色深,胞質少,呈天藍色。

    3統(tǒng)計學處理

    由于數據呈偏態(tài)分布(IL-4為正態(tài)分布),IL-17、IL-8、VEGF、IL-4和IFN-γ數據以中位數(四分位差),即M(Qd)表示,單位為ng/g protein;細胞學分類數據以中位數(四分位差)表示,即M(Qd),單位為%。用SPSS統(tǒng)計軟件(16.0)進行數據處理,采用秩和檢驗。

    結 果

    1各組間BALF中IL-17水平變化

    與對照組比較,哮喘組患兒和肺炎組患兒的IL-17水平顯著增高[35.85(10.75)ng/g proteinvs42.95(24.1) ng/g protein,35.85(10.75) ng/g proteinvs42.95(16.05) ng/g protein,均P< 0.05];而哮喘組與肺炎組患兒IL-17水平無顯著差異[42.95(24.1) ng/g proteinvs42.95(16.05) ng/g protein,P>0.05],見圖1A。

    2各組間BALF中IL-8水平變化

    與對照組比較,哮喘組和肺炎組患兒IL-8水平明顯增高[515.25(508.90) ng/g proteinvs945.05(1 277.35) ng/g protein,515.25(508.90) ng/g proteinvs1 544.85(1 429.50) ng/g protein,均P< 0.05];而肺炎組IL-8水平較哮喘組增高更顯著[1 544.85(1 429.50) ng/g proteinvs945.05(1 277.35) ng/g protein,P< 0.05),見圖1B。

    3各組間BALF中VEGF水平變化

    哮喘組患兒VEGF水平較肺炎組及對照組均明顯增高[1 250.45(1353.30) ng/g proteinvs643.00(900.90) ng/g protein,1 250.45(1 353.30) ng/g proteinvs561.80(979.35) ng/g protein,均P< 0.01],而肺炎組與對照組患兒VEGF水平無顯著差異[643.00(900.90) ng/g proteinvs561.80(979.35) ng/g protein,P>0.05] ,見圖1C。

    4各組間BALF中IL-4、IFN-γ和IL-4/IFN-γ水平變化

    對照組、哮喘組及肺炎組患兒的IL-4水平分別為77.95(17.75) ng/g protein、80.30(16.45) ng/g protein 和78.40(12.80) ng/g protein,3組之間比較無顯著差異,均P>0.05;IFN-γ水平分別為36.50(15.75) ng/g protein、41.25(6.90) ng/g protein和 42.65(20.15) ng/g protein,3組之間比較無顯著差異,均P>0.05;IL-4/IFN-γ比值分別為0.46(0.25)、0.54(0.15)和0.57(0.19),3組之間比較無顯著差異,均P>0.05 ,見圖1D。

    Figure 1. The levels of IL-17, IL-8, VEGF, IL-4 and IFN-γ in BALF in children. Compared with the control, levels of IL-17 and IL-8 were significantly elevated in asthma and pneumonia group (allP<0.05). Compared with pneumonia, there was a lower level of IL-8(P<0.05) in patients with asthma (Fig 1A, 1B). Compared with pneumonia or control group, the level of VEGF was significantly increased in asthma group (bothP<0.01)(Fig 1C). There was no statistical difference in the levels of IL-4 or IFN-γ among groups(Fig 1D). Each bar represents the M(Qd).Control:n=11;asthma:n=52; pneumonia:n=25.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vspneumonia group.

    圖1各組BALF中細胞因子IL-17、IL-8、VEGF、IL-4和IFN-γ表達水平

    5各組BALF細胞學分類

    與對照組比較,哮喘組和肺炎組患兒BALF中性粒細胞百分比明顯增高[1.91(1.64) %vs22.38(25.22) %,1.91(1.64) %vs29.12(25.15) %,均P<0.01],而哮喘組與肺炎組患兒比較差異無顯著[22.38(25.22) %vs29.12(25.15) %,P>0.05];與對照組比較,哮喘組和肺炎組患兒BALF巨噬細胞百分比顯著降低[88.64(2.42) %vs64.12(25.46) %,88.64(2.42) %vs50.36(25.99) %,均P< 0.01],而哮喘組患兒巨噬細胞百分比高于肺炎組 [50.36(25.99) %vs64.12(25.46) %,P<0.05];與肺炎組比較,哮喘組和對照組患兒BALF淋巴細胞百分比均明顯降低[18.76(19.40) %vs11.75(8.24) %,18.76(19.40) %vs9.09(2.47) %,均P<0.05],哮喘組與對照組比較差異無顯著[11.75(8.24) %vs9.09(2.47) %,P>0.05];對照組、哮喘組和肺炎組患兒BALF嗜酸性細胞百分比分別為0.27(0.47) %、1.94(4.79) %和1.76(2.28) %,3組之間比較均無顯著差異,見圖2。

    討 論

    以往研究者認為,哮喘是由Th2細胞和IgE介導的Ⅰ型變態(tài)反應性慢性氣道疾病,其特點是嗜酸性粒細胞浸潤的氣道炎癥[3],小鼠哮喘模型的BALF中嗜酸性細胞比例可達60%-70%,而中性粒細胞不足5%-10%[4]。但目前越來越多的學者致力于中性粒細胞參與為主的“非Th2型哮喘”的研究,認為中性粒細胞參與哮喘的急性發(fā)病及惡化過程[5]。本研究結果也顯示,與對照組比較,哮喘組兒童BALF的中性粒細胞顯著增高,而嗜酸性粒細胞變化不明顯,表明中性粒細胞而非嗜酸性粒細胞參與的氣道炎癥可能是導致兒童哮喘急性發(fā)作的主要原因之一。另一方面,感染而非過敏可能是兒童哮喘急性發(fā)作的誘因。

    Figure 2. The percentage of cells in BALF in children. Compared with the control, there were higher percentages of neutrophil and lymphocyte but lower percentage of macrophage in BALF in asthma and pneumonia group (P<0.05 orP< 0.01). There was no statistical difference between asthma and pneumoniae groups(P>0.05). Each bar represents the M(Qd). Control:n=11;asthma:n=52;pneumonia:n=25.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vspneumonia group.

    圖2各組BALF中細胞分類情況

    有研究顯示,輕中型哮喘多以嗜酸性粒細胞浸潤為主,而重型哮喘氣道中性粒細胞比例顯著增高[6],而且氣道中性粒細胞比例與病變程度呈正相關。已知IL-8對中性粒細胞具有很強的趨化和激活作用, IL-8可選擇性趨化中性粒細胞,誘導和增強其脫顆粒及殺菌作用,同時活化的中性粒細胞也能產生IL-8,形成正反饋,進一步加重氣道炎癥,導致組織破壞[7]。最新研究還發(fā)現,另一新型的細胞因子,Th17細胞分泌的IL-17也參與哮喘氣道中性粒細胞的增殖、成熟和趨化,且IL-17的表達與中性粒細胞性炎癥程度呈正相關[8]。與之相反,在OVA致敏的小鼠模型中,IL-17對氣道嗜酸性粒細胞募集所起的作用不大[9],而且,在Th2細胞介導的哮喘激發(fā)期,IL-17能有效減少嗜酸性粒細胞的浸潤[10]。因此,IL-17可能參與了“非嗜酸性哮喘”的致病過程,成為區(qū)分“Th2型哮喘”和“非Th2型哮喘”的重要標志。另外,IL-17還誘導人類氣道上皮細胞產生IL-8,加強TNF介導IL-8的產生,間接參與氣道的中性粒細胞炎癥[11]。本研究結果顯示,哮喘急性發(fā)作患兒BALF的中性粒細胞、IL-17和IL-8均明顯增高,表明氣道中性粒細胞浸潤與兒童哮喘急性發(fā)作關系密切,IL-17和IL-8均在兒童氣道炎癥中發(fā)揮重要作用,可能參與哮喘急性發(fā)作兒童氣道中性粒細胞而非嗜酸性粒細胞的趨化與浸潤,本研究結果還顯示,肺炎組患兒IL-17水平和中性粒細胞百分比也明顯增高,而且肺炎組患兒IL-8水平顯著高于哮喘組和對照組,表明IL-17和IL-8也參與非哮喘兒童的氣道炎癥。

    氣道黏膜下血管數目的增多、管徑增粗以及新血管的形成是哮喘氣道重塑的一個重要特征和關鍵環(huán)節(jié)。已知轉化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)蛋白家族和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)在哮喘的氣道重塑作用中發(fā)揮重要作用,但關于VEGF在哮喘氣道重塑中的作用報道較少。Ribatti等[1]研究表明,VEGF過量表達可促使氣道黏膜血管的新生和數目增多,導致血管容積及氣道壁厚度的增加。Siddiqui等[12]研究還顯示,VEGF不但參與了哮喘患者的血管重塑過程,而且上調Th2型氣道炎癥反應,黏液腺增生,誘導MMP-9的表達,趨化中性粒細胞及嗜酸性細胞,參與氣道水腫和氣道高反應性。本組數據表明,哮喘組VEGF水平顯著高于肺炎組及對照組,提示在哮喘急性發(fā)作兒童中可能存在氣道重塑,VEGF在其中發(fā)揮重要作用。另外,Kim等[13]研究發(fā)現,用含LPS致敏原致敏的非嗜酸性哮喘模型中,VEGF升高可通過上調Th1和Th17細胞分化因子,促使幼稚T細胞向Th1和Th17細胞分化。

    盡管以往研究表明,Th2細胞優(yōu)勢應答在哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用,并且有動物研究表明哮喘模型的血或BALF中IL-4及IL-4/IFN-γ比值明顯上升[14]。但最新有研究表明,Th2細胞主要參與嗜酸性哮喘的免疫應答,而Th1和Th17細胞參與非嗜酸性哮喘的免疫應答[13]。本研究結果顯示,在哮喘急性發(fā)作兒童BALF中Th2型細胞因子IL-4、Th1型細胞因子IFN-γ以及IL-4/IFN-γ比值未見明顯上升,可能與本組病例年齡偏小(大多在3歲以內)、而且嬰幼兒喘息大多為感染誘發(fā)有關,也進一步說明哮喘可能存在Th2介導的嗜酸性哮喘以外的、如Th17介導的非嗜酸粒細胞性哮喘的炎癥反應。

    綜上所述,IL-17和IL-8在哮喘急性發(fā)作兒童氣道炎癥中發(fā)揮重要作用,Th17細胞可能參與兒童哮喘急性發(fā)作的發(fā)病機制,作用機制可能與其誘導氣道中性粒細胞浸潤有關。同時,VEGF參與哮喘急性發(fā)作患兒的氣道重塑。

    [1] Ribatti D, Puxeddu I, Crivellato E, et al. Angiogenesis in asthma[J]. Clin Exp Allergy, 2009, 39(12): 1815-1821.

    [2] 中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組,《中華兒科雜志》編輯委員會.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南[J]. 中華兒科雜志, 2008,46(10):745-753.

    [3] Bogaert P, Tournoy KG, Naessens T, et al. Where asthma and hypersensitivity pneumonitis meet and differ: noneosinophilic severe asthma [J]. Am J Pathol, 2009, 174(1): 3-13.

    [4] Nakae S, Lunderius C, Ho LH, et al. TNF can contribute to multiple features of ovalbumin-induced allergic inflammation of the airways in mice[J]. J Allergy Clin Immun, 2007, 119(3): 680-686.

    [5] Oboki K, Ohno T, Saito H, et al. Th17 and allergy[J]. Allergol Int, 2008, 57(2): 121-134.

    [6] Kim YK, Oh SY, Jeon SG, et al. Airway exposure levels of lipopolysaccharide determine type 1 versus type 2 experimental asthma[J]. J Immunol, 2007, 178(8): 5375-5382.

    [7] 謝 華,何韶衡,魏繼福,等. 哮喘患者痰中IL-18、IL-16、IL-8、嗜酸性粒細胞趨化因子水平和類糜蛋白酶活性的測定[J]. 中國病理生理雜志,2005,21(11):2201-2204.

    [8] Wakashin H, Hirose K, Iwamoto I, et al. Role of IL-23-Th17 cell axis in allergic airway inflammation[J]. Int Arch Allergy Immunol, 2009, 149 (Suppl 1): 108-112.

    [9] He R, Oyoshi MK, Jin H, et al. Epicutaneous antigen exposure induces a Th17 response that drives airway inflammation after inhalation challenge[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(40): 15817-15822.

    [10]Schnyder-Candrian S, Togbe D, Couillin I, et al. Interleukin-17 is a negative regulator of established allergic asthma[J]. J Exp Med, 2006, 203(12): 2715-2725.

    [11]van den Berg A, Kuiper M, Snoek M, et al. Interleukin-17 induces hyperresponsive interleukin-8 and interieukin-6 production to tumor necrosis factor-alpha in structural lung cells[J]. Am J Resp Cell Mol, 2005, 33(1): 97-104.

    [12]Siddiqui S, Sutcliffe A, Shikotra A, et al. Vascular remodeling is a feature of asthma and nonasthmatic eosinophilic bronchitis[J]. J Allergy Clin Immunol, 2007, 120(4): 813-819.

    [13]Kim YS, Hong SW, Choi JP, et al. Vascular endothelial growth factor is a key mediator in the development of T cell priming and its polarization to type 1 and type 17 T helper cells in the airways[J]. J Immunol, 2009, 183(8): 5113-5120.

    [14]潘世秀,曾天舒,崔天盆,等. 地塞米松對實驗性哮喘小鼠Th1/Th2細胞因子的影響及其機制的探討[J]. 中國病理生理雜志, 2007,23(6):1141-1144.

    LevelsofIL-17,IL-8andVEGFinbronchoalveolarlavagefluidinasthmachildren

    ZHAO Ling-zhi, LU Mei-ping

    (Children’sHospital,ZhejiangUniversitySchoolofMedicine,Hangzhou310003,China.E-mail:meipinglu@126.com)

    AIM: To investigate the mechanism of airway inflammation in children with asthma by determining the levels of IL-17, IL-8 and vascular endothelial growth factor(VEGF) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF).METHODSEighty-eight children were enrolled in the study and divided into asthma group (n=52), pneumonia group (n=25) and control group (n=11). BALF were collected from all 88 cases. The levels of IL-17, IL-8, VEGF, IL-4 and IFN-γ in BALF were measured by ELISA. The cell types in BALF were determined.RESULTSCompared with the control, the levels of IL-17 and IL-8 were significantly elevated in asthma group and pneumonia group (allP<0.05). The level of IL-8 (P<0.05) in the patients with asthma was lower than that in the pneumonia patients. No statistical difference of the IL-17 level between asthma group and pneumoniae group was observed (P>0.05). Compared with pneumonia group and control group, the level of VEGF was significantly increased in asthma group (allP<0.01), and the VEGF level among control group and pneumonia groups was almost similar (P>0.05). The levels of IL-4 and IFN-γ, and ratio of IL-4/IFN-γ among groups were not statistically different. The percentage of neutrophils in BALF was significantly higher in asthma group and pneumonia group than that in control group (allP<0.01).CONCLUSIONIL-17, IL-8 and VEGF play important roles in airway inflammation in children with asthma. Th17 cells may participate in the pathogenesis of asthma in children.

    Asthma; Child; Bronchoalveolar lavage fluid; Interleukin-17; Cytokines

    R562.2+5

    A

    1000-4718(2011)03-0577-04

    2010-09-27

    2010-12-20

    國家自然科學基金資助項目(No. 81070012);浙江省自然科學基金資助項目(No.Y2090339 )

    △通訊作者 Tel: 0571-87061007-70411; E-mail: meipinglu@126.com

    10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.030

    猜你喜歡
    中性酸性粒細胞
    酸性高砷污泥穩(wěn)定化固化的初步研究
    云南化工(2021年10期)2021-12-21 07:33:28
    經方治療粒細胞集落刺激因子引起發(fā)熱案1則
    英文的中性TA
    論證NO3-在酸性條件下的氧化性
    檸檬是酸性食物嗎
    高橋愛中性風格小配飾讓自然相連
    嗜酸性脂膜炎1例與相關文獻淺析
    FREAKISH WATCH極簡中性腕表設計
    嗜酸性粒細胞增多綜合征的治療進展
    誤診為嗜酸粒細胞增多癥1例分析
    国产福利在线免费观看视频| 国产男人的电影天堂91| 窝窝影院91人妻| 亚洲三区欧美一区| 久久毛片免费看一区二区三区| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲精品乱久久久久久| 人妻人人澡人人爽人人| 一个人免费看片子| 成在线人永久免费视频| 亚洲免费av在线视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 狂野欧美激情性bbbbbb| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 亚洲av片天天在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 深夜精品福利| 波多野结衣一区麻豆| 成人影院久久| 亚洲三区欧美一区| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲天堂av无毛| 久久国产精品人妻蜜桃| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品久久久人人做人人爽| 精品免费久久久久久久清纯 | 久久精品国产亚洲av高清一级| 99久久精品国产亚洲精品| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 1024香蕉在线观看| 两性夫妻黄色片| 中国国产av一级| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美精品高潮呻吟av久久| 黄色视频,在线免费观看| 日韩有码中文字幕| 亚洲av成人一区二区三| 无遮挡黄片免费观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 91成人精品电影| 久久女婷五月综合色啪小说| 桃花免费在线播放| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 日韩精品免费视频一区二区三区| 电影成人av| 各种免费的搞黄视频| 99九九在线精品视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩三级视频一区二区三区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| www.精华液| a级毛片黄视频| videos熟女内射| 老司机影院毛片| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 丁香六月欧美| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 超色免费av| av天堂久久9| 麻豆乱淫一区二区| 91精品三级在线观看| 成人手机av| 9色porny在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 99国产综合亚洲精品| 首页视频小说图片口味搜索| 9热在线视频观看99| 搡老岳熟女国产| 成年美女黄网站色视频大全免费| 免费av中文字幕在线| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 日韩大片免费观看网站| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲精华国产精华精| 欧美少妇被猛烈插入视频| 九色亚洲精品在线播放| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久9热在线精品视频| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 99香蕉大伊视频| 久久 成人 亚洲| 成人国产一区最新在线观看| 国产成人精品久久二区二区91| 老司机福利观看| 欧美激情久久久久久爽电影 | 国产黄色免费在线视频| 国产99久久九九免费精品| 亚洲精品国产av蜜桃| 成人免费观看视频高清| 国产麻豆69| 中文字幕精品免费在线观看视频| 两个人免费观看高清视频| 亚洲精品自拍成人| 亚洲 欧美一区二区三区| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产三级黄色录像| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 中文字幕最新亚洲高清| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 韩国高清视频一区二区三区| 精品国产一区二区三区四区第35| 美女高潮到喷水免费观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 性少妇av在线| a级毛片黄视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 青草久久国产| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 黄色视频,在线免费观看| 精品久久蜜臀av无| 日韩一区二区三区影片| 午夜福利免费观看在线| 一级片'在线观看视频| 九色亚洲精品在线播放| videosex国产| 欧美另类亚洲清纯唯美| 日韩一区二区三区影片| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 在线av久久热| 男人爽女人下面视频在线观看| 欧美午夜高清在线| 黄色片一级片一级黄色片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产黄频视频在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 午夜两性在线视频| 丝瓜视频免费看黄片| 90打野战视频偷拍视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久人人爽人人片av| 男女床上黄色一级片免费看| 桃花免费在线播放| 另类精品久久| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 一级毛片电影观看| 韩国精品一区二区三区| 美女大奶头黄色视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 飞空精品影院首页| 51午夜福利影视在线观看| 高清av免费在线| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲久久久国产精品| 三级毛片av免费| 成年人午夜在线观看视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| av福利片在线| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲久久久国产精品| 99热网站在线观看| 手机成人av网站| 亚洲国产精品999| 免费在线观看黄色视频的| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产主播在线观看一区二区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 人妻久久中文字幕网| 国产黄频视频在线观看| 不卡av一区二区三区| 午夜福利一区二区在线看| 国产一区二区三区av在线| 精品少妇内射三级| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲国产av新网站| 久久人人爽人人片av| 色94色欧美一区二区| 国产成人欧美在线观看 | 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美性长视频在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产精品国产三级国产专区5o| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产精品久久久久成人av| 欧美亚洲日本最大视频资源| 另类亚洲欧美激情| 老司机影院毛片| 午夜老司机福利片| 成人国语在线视频| 淫妇啪啪啪对白视频 | av天堂在线播放| 亚洲久久久国产精品| tocl精华| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品国产av在线观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产精品一区二区免费欧美 | 亚洲av男天堂| 亚洲成人免费电影在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲精华国产精华精| 男男h啪啪无遮挡| 在线观看人妻少妇| 伊人亚洲综合成人网| 国产免费视频播放在线视频| 成年动漫av网址| 国产色视频综合| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | a在线观看视频网站| 午夜91福利影院| 热99久久久久精品小说推荐| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 精品少妇内射三级| 十八禁网站网址无遮挡| 国产精品 欧美亚洲| 午夜视频精品福利| 久久精品成人免费网站| 国产成+人综合+亚洲专区| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产麻豆69| 麻豆乱淫一区二区| 天天操日日干夜夜撸| 精品熟女少妇八av免费久了| 丰满饥渴人妻一区二区三| 免费高清在线观看日韩| 伦理电影免费视频| 自线自在国产av| 交换朋友夫妻互换小说| 在线观看舔阴道视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 老司机午夜福利在线观看视频 | 一个人免费看片子| 三级毛片av免费| 99热全是精品| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 91精品国产国语对白视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 亚洲欧美精品自产自拍| 美女福利国产在线| 亚洲,欧美精品.| 99热国产这里只有精品6| 国产精品久久久久久精品电影小说| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 极品人妻少妇av视频| 一级a爱视频在线免费观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 制服人妻中文乱码| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 青草久久国产| 亚洲欧美激情在线| 亚洲欧美精品自产自拍| 午夜福利影视在线免费观看| 大香蕉久久网| 国产人伦9x9x在线观看| avwww免费| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 热re99久久精品国产66热6| 交换朋友夫妻互换小说| 老司机亚洲免费影院| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产区一区二久久| 成年av动漫网址| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲情色 制服丝袜| 天天影视国产精品| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲精品中文字幕在线视频| 青草久久国产| 国产精品一二三区在线看| 亚洲欧美精品自产自拍| 9191精品国产免费久久| 日韩,欧美,国产一区二区三区| av网站在线播放免费| 美女视频免费永久观看网站| 视频在线观看一区二区三区| 老司机亚洲免费影院| 亚洲av电影在线进入| 国产成人av激情在线播放| 在线观看一区二区三区激情| 日韩有码中文字幕| 老熟妇仑乱视频hdxx| 黄片大片在线免费观看| 一二三四在线观看免费中文在| 叶爱在线成人免费视频播放| 精品高清国产在线一区| 成人免费观看视频高清| 91精品国产国语对白视频| 亚洲av美国av| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 男人舔女人的私密视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久精品国产综合久久久| 男女床上黄色一级片免费看| 91老司机精品| 男女床上黄色一级片免费看| 青青草视频在线视频观看| 考比视频在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 免费黄频网站在线观看国产| 欧美黄色淫秽网站| 午夜免费成人在线视频| 在线观看免费午夜福利视频| 蜜桃国产av成人99| 一区在线观看完整版| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 无限看片的www在线观看| 在线天堂中文资源库| 精品第一国产精品| 深夜精品福利| 久久久久久久精品精品| 一区福利在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 国产xxxxx性猛交| 亚洲国产av新网站| 97在线人人人人妻| 亚洲免费av在线视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| av网站免费在线观看视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 久久中文看片网| 国产高清videossex| 无遮挡黄片免费观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 成人国产一区最新在线观看| 精品久久久久久电影网| 91成人精品电影| 免费不卡黄色视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 极品人妻少妇av视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 桃红色精品国产亚洲av| 搡老熟女国产l中国老女人| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲国产av新网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 黄网站色视频无遮挡免费观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 女人久久www免费人成看片| 天堂8中文在线网| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 精品人妻在线不人妻| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 午夜影院在线不卡| 国产男女内射视频| h视频一区二区三区| 少妇的丰满在线观看| videos熟女内射| 女人精品久久久久毛片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 99久久人妻综合| 国产国语露脸激情在线看| 12—13女人毛片做爰片一| 国产色视频综合| 热re99久久精品国产66热6| 两性夫妻黄色片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 麻豆国产av国片精品| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品秋霞免费鲁丝片| av线在线观看网站| 一本色道久久久久久精品综合| 十八禁高潮呻吟视频| 桃花免费在线播放| 欧美97在线视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 蜜桃在线观看..| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 久久久久久久精品精品| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 91av网站免费观看| a 毛片基地| 亚洲一区二区三区欧美精品| 不卡一级毛片| 一区在线观看完整版| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 精品国产一区二区久久| 国产野战对白在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频 | 国产一区二区三区综合在线观看| 丁香六月欧美| 国产有黄有色有爽视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 一级片免费观看大全| 亚洲精品国产av成人精品| 免费观看人在逋| 五月天丁香电影| 满18在线观看网站| 一边摸一边做爽爽视频免费| 午夜福利在线观看吧| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产精品久久久久久精品古装| 1024视频免费在线观看| 少妇 在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 黄色 视频免费看| 免费观看a级毛片全部| 男人舔女人的私密视频| 各种免费的搞黄视频| 日韩电影二区| 亚洲国产精品一区三区| 国产在线视频一区二区| 亚洲欧美一区二区三区久久| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品一二三区在线看| 国产熟女午夜一区二区三区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产成人av教育| 免费黄频网站在线观看国产| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲国产精品999| 日日爽夜夜爽网站| 最近中文字幕2019免费版| 老司机亚洲免费影院| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 激情视频va一区二区三区| 国产色视频综合| 亚洲 国产 在线| 成人国语在线视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 天堂8中文在线网| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲av成人一区二区三| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲五月色婷婷综合| 久久精品亚洲av国产电影网| 99久久人妻综合| 亚洲国产欧美在线一区| 在线永久观看黄色视频| 黄色怎么调成土黄色| 90打野战视频偷拍视频| 色老头精品视频在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 精品福利观看| 日韩大码丰满熟妇| 欧美 日韩 精品 国产| 99热网站在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美精品av麻豆av| 亚洲精品美女久久av网站| 美女福利国产在线| 99国产精品一区二区蜜桃av | 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 天天添夜夜摸| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲人成电影免费在线| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲中文av在线| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产精品国产三级国产专区5o| 操出白浆在线播放| 涩涩av久久男人的天堂| av一本久久久久| 在线精品无人区一区二区三| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲一码二码三码区别大吗| 天堂俺去俺来也www色官网| 日韩有码中文字幕| 国产真人三级小视频在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 亚洲欧美一区二区三区久久| 色精品久久人妻99蜜桃| 一区二区三区激情视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产淫语在线视频| 国产成人av激情在线播放| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美成人午夜精品| 国产国语露脸激情在线看| 欧美97在线视频| 91老司机精品| 免费观看av网站的网址| 热re99久久精品国产66热6| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品人妻在线不人妻| 国产av国产精品国产| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲av男天堂| 18禁国产床啪视频网站| 国产1区2区3区精品| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美日韩黄片免| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产欧美日韩一区二区三 | 久久久精品免费免费高清| av在线播放精品| 99国产综合亚洲精品| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲伊人久久精品综合| kizo精华| 精品高清国产在线一区| 中亚洲国语对白在线视频| 999久久久国产精品视频| 2018国产大陆天天弄谢| 国产一卡二卡三卡精品| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产精品影院久久| 国产高清国产精品国产三级| 国产av精品麻豆| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 精品国产一区二区久久| 久久毛片免费看一区二区三区| 丝袜美足系列| 18在线观看网站| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久影院123| 99国产综合亚洲精品| 亚洲欧美激情在线| 在线av久久热| 在线精品无人区一区二区三| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 亚洲熟女毛片儿| av片东京热男人的天堂| 国产伦理片在线播放av一区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产av又大| 国产xxxxx性猛交| av国产精品久久久久影院| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 精品久久久久久电影网| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 自线自在国产av| 黑人猛操日本美女一级片| 91成年电影在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久中文看片网| 高清欧美精品videossex| 国产av又大| 精品视频人人做人人爽| 精品少妇内射三级| 这个男人来自地球电影免费观看| av线在线观看网站| 久久热在线av| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 动漫黄色视频在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产在线免费精品| 一二三四在线观看免费中文在| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲av美国av| 成年人午夜在线观看视频| 黄色片一级片一级黄色片| 久久久欧美国产精品| 丁香六月欧美| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久久国产欧美日韩av| 久久青草综合色| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 嫩草影视91久久| 国产片内射在线| 色94色欧美一区二区| 亚洲三区欧美一区| 91麻豆av在线| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产精品一二三区在线看| 777米奇影视久久| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 狠狠精品人妻久久久久久综合| 男女国产视频网站| 国产男女超爽视频在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 日本wwww免费看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲欧美清纯卡通| 嫁个100分男人电影在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久综合国产亚洲精品| 最近中文字幕2019免费版| 欧美亚洲日本最大视频资源| 黑人猛操日本美女一级片| 国产有黄有色有爽视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产片内射在线| 欧美xxⅹ黑人| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产高清videossex| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 免费在线观看影片大全网站| 久久久久精品国产欧美久久久 | 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲五月婷婷丁香| 精品视频人人做人人爽| netflix在线观看网站| 波多野结衣一区麻豆| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 国产精品免费大片| 一个人免费在线观看的高清视频 | 美女脱内裤让男人舔精品视频| 妹子高潮喷水视频| 最新在线观看一区二区三区|