缺血后適應(yīng)對(duì)樹鼩海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的機(jī)制研究*

湯 諹, 李樹清, 李 凡, 李 飛, 張 穎

(1昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚/醫(yī)學(xué)美容科，云南 昆明 650032；2昆明醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，云南 昆明 650031)

缺血后適應(yīng)對(duì)樹鼩海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的機(jī)制研究*

湯 諹1, 李樹清2△, 李 凡2, 李 飛2, 張 穎2

(1昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚/醫(yī)學(xué)美容科，云南 昆明 650032；2昆明醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，云南 昆明 650031)

目的了解缺血后適應(yīng)(PC)對(duì)樹鼩腦缺血時(shí)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元磷脂酰肌醇-3激酶/Akt(PI-3K/Akt)下游底物絲/蘇氨酸蛋白激酶(Akt Ser-473/Thr-308)磷酸化(Akt[pS473]/Akt[pT308])的調(diào)控，探討Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在缺血PC腦保護(hù)中的作用機(jī)制。方法以樹鼩為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用光化學(xué)誘導(dǎo)法復(fù)制局部腦缺血，并于腦缺血后3 h 30 min反復(fù)夾閉缺血側(cè)頸總動(dòng)脈3個(gè)循環(huán)(5 min 1個(gè)循環(huán))以制備后適應(yīng)模型。在光鏡、電鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷及其超微結(jié)構(gòu)變化的同時(shí)，采用免疫組化法了解腦缺血樹鼩海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Akt[pS473]/Akt[pT308]的分布及定位，并以灰度值檢測(cè)磷酸化強(qiáng)度。結(jié)果腦缺血可導(dǎo)致樹鼩海馬損傷及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的明顯異常；而缺血PC可使海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的異常明顯改善。免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組海馬CA1區(qū)Akt[pS473]及 Akt [pT308]的磷酸化為陰性。缺血PC組與缺血組在不同時(shí)點(diǎn)的胞漿、胞膜均出現(xiàn)Akt[pS473]，但缺血72h Akt[pS473]減弱(灰度值146.6±2.9)。缺血組Akt [pT308]僅在4 h明顯增強(qiáng)(灰度值135.5±2.2)，隨后則未檢測(cè)到(灰度值分別為165.3±3.7，163.3±2.5)。而缺血PC組4 h時(shí)點(diǎn)Akt [pT308]呈陰性，隨后24 h、72 h則持續(xù)顯著的陽性。結(jié)論缺血PC能明顯減輕海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的缺血性損傷，其保護(hù)機(jī)制可能與 Akt Ser-473和Thr-308 2個(gè)位點(diǎn)磷酸化導(dǎo)致PI-3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活有關(guān)。

腦缺血； 缺血后適應(yīng)； 磷脂酰肌醇-3激酶/Akt； 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)； 樹鼩

缺血后適應(yīng)(ischemic postconditioning, ischemic PC)是一種在方法上與缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning, IP)完全不同，但效果相似的細(xì)胞保護(hù)措施，缺血PC的發(fā)現(xiàn)提示：機(jī)體缺血狀態(tài)下，內(nèi)部天然的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的激活對(duì)機(jī)體的抗損傷反應(yīng)具有特殊的生物學(xué)意義[1]。2003年Zhao等[2]在首次描述缺血PC時(shí)，發(fā)現(xiàn)在心肌缺血再灌注的早期使用短暫、重復(fù)的缺血能減小再灌注的損傷。Burda等[3]隨后證實(shí)，在正確的時(shí)間應(yīng)用最佳強(qiáng)度的PC能防止遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的過程，但有關(guān)PC保護(hù)神經(jīng)元的機(jī)制尚不清楚。本研究通過比較樹鼩血栓性腦缺血及后適應(yīng)對(duì)磷脂酰肌醇-3激酶/Akt(phosphatidylinositol 3-kinase-Akt, PI-3K/Akt)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游底物-絲/蘇氨酸蛋白激酶Akt[Ser-473]和Akt[Thr-308]磷酸化的影響，以探討PI-3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在缺血PC腦保護(hù)中的病理生理機(jī)制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 采用健康成年樹鼩42只，雌雄不拘，體重(100±10)g。避光、安靜、清潔環(huán)境飼養(yǎng)，隨機(jī)分為對(duì)照組(假手術(shù)組，sham)、血栓性腦缺血4h組(ischemia 4 h)、缺血24 h組(ischemia 24 h)、缺血72 h組(ischemia 72 h)、缺血后適應(yīng)4 h組(PC 4 h)、缺血后適應(yīng)24 h組(PC 24 h)和缺血后適應(yīng)72 h組(PC 72 h)，共7組(每組n=6)。

1.2主要儀器 本室研制的SQ-Ⅲ型光化學(xué)誘導(dǎo)腦血栓形成裝置，由電源(含濾波電路及觸發(fā)器)，光源、散熱裝置組成。光學(xué)系統(tǒng)主要由干涉濾鏡及聚光鏡組成。光源中心波長(zhǎng)(λ=560 nm)，帶寬(Δλ=60 nm)，光強(qiáng)度(10 W/cm2)，用時(shí)間繼電器控制照射時(shí)間。Leica RM 2135石蠟切片機(jī)。奧林巴斯光學(xué)顯微鏡BX50 。HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術(shù)有限公司)。Nikon-MiVnt顯微圖像分析系統(tǒng)(Nikon)。

1.3主要試劑 注射用硫噴妥鈉(thiopental sodium for injection)為上海新亞藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；孟加拉紅(rose Bengal)為Fluka產(chǎn)品；甲醛溶液(formaldehyd solution)為汕頭市達(dá)濠精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液pH7.4(phosphate buffer saline, PBS)為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；多聚賴氨酸(poly-L-lysine)為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品； Tween-20和EDTA Na2北京索來寶科技有限公司產(chǎn)品；10%山羊血清(goat serum)為晶美生物工程有限公司；Ⅰ抗 phospho-Akt(Ser473)mouse mAb及Ⅰ抗 phospho-Akt(Thr308)rabbit mAb購自Cell Signaling Technology； Ⅱ抗 MaxVisionTM即用型試劑、快速型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物及DAB顯色液為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

2方法

2.1光化學(xué)誘導(dǎo)法復(fù)制血栓性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ蚚2]將動(dòng)物腹腔注射1%硫噴妥鈉溶液(5 mL/kg BW)麻醉固定，自舌下靜脈注入1.5 g/L 孟加拉紅溶液(1.33 mL/kg BW)，常規(guī)消毒后，自右耳屏前至右眼外眥作切口，切開皮膚、顳肌、顯露樹鼩顱骨，透過樹鼩顱骨可見清晰的顱內(nèi)血管影像，將動(dòng)物置于SQ-Ⅲ型腦血栓形成實(shí)驗(yàn)裝置下，經(jīng)特殊波長(zhǎng)的光束(強(qiáng)度為1.0 W/cm2)透過樹鼩半透明顱骨照射腦血管15 min，復(fù)制血栓性腦缺血模型，照射結(jié)束后，縫合動(dòng)物頭顱部創(chuàng)口，保暖入籠。

2.2樹鼩海馬缺血PC模型的建立 在光化學(xué)法制備血栓性腦缺血模型基礎(chǔ)上，在既定時(shí)點(diǎn)(4 h)前40 min，用1%硫噴妥鈉(2.5 mL/kg BW)重新麻醉動(dòng)物，動(dòng)物仰臥固定，頸部正中作縱形切口，切開皮膚、皮下組織、頸闊肌，在右側(cè)胸鎖乳突肌前緣分離進(jìn)入頸鞘，保護(hù)迷走神經(jīng)與頸內(nèi)靜脈，分離頸總動(dòng)脈，過線，在既定時(shí)點(diǎn)(4 h)前30 min以無創(chuàng)動(dòng)脈夾在甲狀軟骨上緣平面夾閉頸總動(dòng)脈5 min后去除動(dòng)脈夾再灌5 min，重復(fù)3次以復(fù)制缺血PC模型，術(shù)后縫合動(dòng)物頸部創(chuàng)口，保暖入籠。

2.3腦恒壓灌流與內(nèi)固定 在腦缺血后不同時(shí)點(diǎn)(4 h、24 h和72 h)以及缺血后適應(yīng)后不同時(shí)點(diǎn)(4 h、24 h和72 h)麻醉動(dòng)物，用手術(shù)剪剪開腹腔，結(jié)扎降主動(dòng)脈，開胸并剪開心包，左心室插入聚乙烯管，使其進(jìn)入升主動(dòng)脈，扎閉主動(dòng)脈根部以防回流，剪開右心耳，灌注預(yù)冷的生理鹽水300 mL，待肝臟呈現(xiàn)蠟黃色時(shí)在120 mmHg 壓力下緩慢滴注(25 gtt/min)固定液10%甲醛100 mL行內(nèi)固定，滴注持續(xù)1 h，隨后將腦組織取出，浸泡于10%甲醛溶液中行后固定30 min，將腦組織移至新鮮配制的10%甲醛溶液中繼續(xù)固定至24 h，于視交叉后1.7-4.0 mm(海馬齒狀回互包平面)行冠狀切片，取中間切塊遞級(jí)脫水、透明、浸蠟，常規(guī)石蠟包埋制成蠟塊標(biāo)本，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱備用。

2.4Akt [pS473]和Akt [pT308]免疫組織化學(xué)檢測(cè) 蠟塊標(biāo)本連續(xù)切片，切片厚度5μm，貼片于多聚賴氨酸原液預(yù)處理的載玻片上，切片移至55 ℃恒溫箱內(nèi)烤片4-6 h，將組織切片脫蠟，置入100%二甲苯中室溫孵育3次，每次5 min；將切片置入100%乙醇溶液內(nèi)洗片2次，95%乙醇溶液內(nèi)洗片2次后，將切片移入去離子水內(nèi)5 min再水化，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)1 000 mL內(nèi)煮沸15 min，進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至40 ℃后用去離子水洗切片3次，3% H2O2室溫孵育10 min；去離子水洗切片2次，1×PBST工作液洗切片5 min；每樣本加入200μl，置濕盒內(nèi)室溫封閉1 h，甩干封閉液，加入以封閉液(5%山羊血清)配制的Ⅰ抗100 μL，置濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，1×PBST工作液洗切片3次，每次5 min，加入Ⅱ抗置濕盒內(nèi)室溫孵育25 min，1×PBST洗切片3次，每次5 min，新鮮配制DAB顯色8 min，去離子水沖洗終止顯色，蘇木素核復(fù)染4 min，遞級(jí)乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。奧林巴斯BX50光學(xué)顯微鏡下觀察，陽性反應(yīng)部位呈現(xiàn)棕黃色(DAB顯色)，利用Nikon-MiVnt顯微圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)灰度值，進(jìn)行Akt [pS473]和Akt [pT308]表達(dá)強(qiáng)度分析。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組用PBS代替I抗，其余步驟相同。制作完成的切片儲(chǔ)存于避光干燥之處，各組動(dòng)物同時(shí)切片，并同時(shí)進(jìn)行免疫組化染色。以保證實(shí)驗(yàn)條件的一致性。

2.5電鏡取材及組織固定 在血栓性腦缺血后不同時(shí)點(diǎn)及缺血后適應(yīng)不同時(shí)點(diǎn)麻醉動(dòng)物，快速斷頭取腦，取缺血側(cè)及對(duì)側(cè)海馬CA1區(qū)組織，置于3.5%

戊二醛內(nèi)固定，固定瓶置4 ℃冰箱內(nèi)保存，用磷酸緩沖液沖洗后，丙酮酸逐級(jí)脫水，1%四氧鋨酸固定24 h，LKB5型超薄切片機(jī)半薄切片定位，隨后作檸檬酸鉛醋酸鈾雙染色，在JEM-100CX型電子顯微鏡下觀察。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1缺血PC對(duì)樹鼩血栓性腦缺血海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響

1.1正常對(duì)照及腦缺血組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué) 對(duì)照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)正常，排列正常；線粒體形態(tài)正常，偶爾可見線粒體輕度腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列規(guī)則，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體清晰完整，高爾基體結(jié)構(gòu)正常，分布均勻，見圖1 A、B。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，血栓性腦缺血后海馬超微結(jié)構(gòu)的改變以腦缺血后24 h最為明顯，可見海馬CA1區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)固縮，在海馬周圍固縮細(xì)胞增多，線粒體腫脹，線粒體嵴消失或呈空泡狀，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、池形成,見圖1 C、D；腦缺血后72 h超微結(jié)構(gòu)的改變減輕，線粒體輕度腫脹、嵴部分消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張(圖略)。

Figure 1. The neuronal ultrastructure in hippocampus CA1 area under the electronic microscope. A:the normal neuron in hippocampus with regular arrangement(×8 000);B:the normal mitochondria in intracytoplasm and the clear cell spaces(×25 000);C:obviously mitochondria swelling and partly disruption and vanishing of mitochondrial cristae 24 h after thrombotic cerebral ischemia(×30 000); D:the intensive Golgi’s body and the vague limit between subcellular structure 24 h after thrombotic cerebral ischemia(×20 000);E:the extenuation of mitochondria swelling and some normal mitochondria 24 h after ischemic PC(×25 000);F:lightly expanding of endoplasmic reticulum 24 h after ischemic PC(×25 000).

圖1電鏡下神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)

1.2缺血PC對(duì)樹鼩血栓性腦缺血海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響 在缺血后適應(yīng)24 h可見海馬CA1區(qū)少量神經(jīng)元出現(xiàn)固縮改變，部分細(xì)胞可見異染色質(zhì)增多，殘?bào)w出現(xiàn)；線粒體腫脹、嵴部分消失，但多數(shù)線粒體形態(tài)正常；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列基本正常，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，見圖1 E、F；缺血后適應(yīng)72 h線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)接近正常(圖略)。

2缺血PC對(duì)樹鼩血栓性腦缺血海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Akt[pS473]及Akt[pT308]表達(dá)的影響

2.1海馬CAI區(qū)神經(jīng)元Akt[pS473]及[pS473]及Akt[pT308]的免疫組化檢測(cè) 對(duì)照組海馬CA1區(qū)Akt[pS473]及 Akt [pT308]的表達(dá)均為陰性，見圖2、3。在缺血PC組與缺血組在不同時(shí)點(diǎn)均出現(xiàn)Akt[pS473]的胞漿、胞膜表達(dá)，見圖2、3。但缺血組72 h Akt[pS473]的表達(dá)減弱。缺血組Akt [pT308]僅4 h呈陽性表達(dá)，隨后則為陰性表達(dá)。而缺血PC組Akt [pT308]4 h呈陰性表達(dá)，隨后24 h和72 h則持續(xù)陽性表達(dá)。

2.2海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Akt[pS473]及Akt[pT308]灰度值測(cè)定 腦缺血4 h、24 h和72 h海馬 Akt[pS473]的灰度值分別為133.5±3.3、133.5±3.1和146.6±2.9，均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，但各時(shí)點(diǎn)之間的灰度值無顯著差異(P>0.05)；缺血PC組4 h的灰度值高于缺血組(P<0.01)，但低于對(duì)照組，見表1。腦缺血4 h、24 h和72 h海馬 Akt[pT308]灰度值分別為135.5±2.2、165.3±3.7和163.3±2.5，除缺血組4 h顯著低于對(duì)照組外(P<0.01)，缺血組24 h及72 h的灰度值與對(duì)照組比較無顯著差異。缺血PC組4 h的灰度值明顯高于缺血組(P<0.01)，但缺血PC 24 h和72 h則明顯低于缺血組(P<0.01)，見表2。

Figure 2. Distribution of Akt[pS473] in pyramid cells of hippocampus in CA1 area (immunohistochemical staining, ×400). The Akt[pS473] in sham group was negative. The Akt[pS473] was positive in cytoplasm and membrane of pyramid cells after cerebral ischemia and cerebral ischemic PC，but the intensity of Akt[pS473] decreased 72 h after ischemia.

圖2海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞Akt[pS473]的分布

Figure 3. Distribution of Akt[pT308] in pyramid cells of hippocampus in CA1 area (immunohistochemical staining, ×400). The Akt[pT308] in sham group was negative. The Akt[pT308] was positive 4 h after cerebral ischemia, but negative at 24 h and 72 h. The Akt[pT308] in ischemic PC group was negative at 4 h, but obviously positive at 24 h and 72 h.

圖3海馬CA1區(qū)Akt[pT308]的分布

表1缺血PC對(duì)腦缺血樹鼩海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Akt[pS473]灰度值的影響

Groups4h24h72hSham162．8±3．8NDNDIschemia133．5±3．3??133．5±3．1??146．6±2．9??IschemicPC154．5±2．9△△132．5±2．7134．7±3．0

ND: not detected.**P<0.01vssham;△△P<0.01vsischemia.

表2缺血PC對(duì)腦缺血樹鼩海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Akt[pT308]灰度值的影響

Group4h24h72hSham165．5±2．7NDNDIschemia135．5±2．2??165．3±3．7163．3±2．5IschemicPC163．5±2．3△△137．7±3．1△△132．0±3．2△△

ND: not detected.**P<0.01vssham;△△P<0.01vsischemia.

討 論

腦缺血PC是近年新興的探索領(lǐng)域，有關(guān)PI-3K /Akt在缺血狀態(tài)下的細(xì)胞生存分子機(jī)制的研究且備受關(guān)注。業(yè)已證明，磷脂酰肌醇3激酶/Akt (phosphatidylinositol 3-kinase /Akt，PI-3K /Akt)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是細(xì)胞生存的重要途徑之一，在促進(jìn)細(xì)胞生存，抑制細(xì)胞凋亡過程中具有重要作用。Akt是PI-3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的靶激酶，在PI-3K介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過對(duì)凋亡的調(diào)節(jié)作用促進(jìn)細(xì)胞的生存。

本研究應(yīng)用免疫組化檢測(cè)了缺血組與缺血后適應(yīng)組海馬神經(jīng)元Akt[pS473]及Akt[pT308]表達(dá)的定位及半定量改變，并對(duì)照電鏡超微結(jié)構(gòu)相應(yīng)的結(jié)果分析Akt[pS473]及Akt[pT308]表達(dá)是否與細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)。

免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組海馬CA1區(qū)Akt[pS473]的表達(dá)為陰性，而大腦皮質(zhì)可觀察到Akt[pS473]在胞漿的弱陽性表達(dá)(另文)。比較缺血后適應(yīng)組與缺血組，雖然二者在不同時(shí)點(diǎn)都出現(xiàn)Akt[pS473]的胞漿、胞膜表達(dá)，但在缺血組72 h Akt[pS473]的表達(dá)已經(jīng)減弱(灰度值146.6±2.9)。正如Pignataro等[4]報(bào)道缺血后適應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)部分源于Akt的磷酸化。Wang等[5]和Scartabelli等[6]通過使用Akt激酶的抑制劑，間接證實(shí)了PI-3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在缺血后適應(yīng)對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)機(jī)制中可能起著關(guān)鍵作用。

Akt 的完全激活受到雙重調(diào)控[10-12]：(1)Akt轉(zhuǎn)位到質(zhì)膜上；(2)Akt的Thr-308和Ser-473磷酸化。Akt信號(hào)通路的完全激活，應(yīng)包括Akt Ser-473和Thr-308兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)磷酸化，而既往研究主要集中在Akt[pS473]，而對(duì)Akt [pT308]的狀況報(bào)道不多，本文的數(shù)據(jù)顯示，缺血組Akt [pT308]僅在4 h有陽性表達(dá)(灰度值135.5±2.2)，隨后24 h、72 h則表達(dá)為陰性(灰度值分別為165.3±3.7、163.3±2.5)。而后適應(yīng)組則不同，4 h時(shí)點(diǎn)Akt[pS473]開始表達(dá)，但強(qiáng)度有限(灰度值154.5±2.9低于對(duì)照組，與缺血72 h無顯著差異)。隨后的24 h及72 h則表達(dá)增強(qiáng)并持續(xù)(灰度值分別為132.5±2.7和134.7±3.0)。相應(yīng)的電鏡下細(xì)胞結(jié)構(gòu)顯示，在缺血組24 h時(shí)點(diǎn)，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)固縮，海馬周圍固縮細(xì)胞增多，線粒體腫脹，嵴消失或呈空泡狀，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池形成，胞漿水腫；海馬周圍組織水腫、變性、壞死和出血，見圖1 C、D。而在缺血后適應(yīng)組24 h時(shí)點(diǎn)，電鏡下僅見海馬CA1區(qū)少量神經(jīng)元出現(xiàn)固縮改變，部分細(xì)胞可見異染色質(zhì)增多，殘?bào)w出現(xiàn)；線粒體腫脹、嵴部分消失，但多數(shù)線粒體形態(tài)正常；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列基本正常，見圖1 E、F。根據(jù)以上現(xiàn)象分析，短暫性腦缺血活化了細(xì)胞死亡和細(xì)胞生存激酶途徑，Akt[Ser-473和Thr-308個(gè)位點(diǎn)的磷酸化，使得Akt信號(hào)通路完全激活，多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子通過激活PI-3K/Akt信號(hào)途徑而抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用，這一機(jī)制在其他學(xué)者的研究中也得到相應(yīng)共識(shí)[7-9]。

業(yè)已證明，通過反復(fù)3次夾閉頸總動(dòng)脈可使海馬局部腦血流量(regional cerebral blood flow,rCBF)在不輸液、不用藥的前提下逐步得以回升達(dá)正常時(shí)海馬rCBF的56%以上水平。其PC機(jī)制可能包括“機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”和體內(nèi)血液重新分布兩方面。前者可能與夾閉血管及開夾時(shí)血流沖擊所產(chǎn)生的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)；后者則由于腹腔內(nèi)臟與腦血管α-受體分布不同，以及夾閉頸動(dòng)脈引起減壓反射的加壓效應(yīng)的結(jié)果[1]。細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化結(jié)果提示，腦缺血可直接導(dǎo)致海馬神經(jīng)元亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，其損傷的程度與Akt活化水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，Akt活化水平高，則亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷程度減輕。缺血PC通過活化Akt，在緩解海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的損傷而促進(jìn)細(xì)胞生存中起著重要作用。

由于PI-3K/Akt途徑涉及的下游靶激酶較為復(fù)雜，許多問題仍有待探討。在下一步研究中，擬通過更精確的定量研究方法對(duì)照Akt[pS473]和Akt[pT308]在缺血和缺血后適應(yīng)時(shí)的動(dòng)力學(xué)變化，分析這種動(dòng)力學(xué)變化是否與海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡存在因果關(guān)系。

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EffectsofischemicpostconditioningonneuronalAktsignalingpathwaysinhippocampusCA1areaaftercerebralischemiaintreeshrews

TANG Yang1, LI Shu-qing2, LI Fan2, LI Fei2, ZHANG Ying2

(1DepartmentofDermatology&MedicalCosmetology,TheFirstAffiliatedHospital,KunmingMedicalCollege,Kunming650032,China;2DepartmentofPathophysiology,KunmingMedicalCollege,Kunming650031,China.E-mail:shuqing591@hotmail.com)

AIM: To investigate the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt (PI-3K/Akt) Ser-473/Thr-308/ phosphorylation (Akt[pS473]/Akt[pT308]) and the intensity of the neurons in happocampus CA1 area under the conditions of thrombotic cerebral ischemia and postconditioning in tree shrews.METHODSThe thrombotic focal cerebral ischemia was induced by photochemical reaction in tree shrews. Two hundred and ten minutes after cerebral ischemia, ischemic postconditioning was established by repeated cliping of ipsilateral carotid. The distribution of Akt[pS473] and Akt[pT308], and neuronal ultrastructure in hippocampus CA1 area were observed by the methods of electronic microscopy and immunohistochemistry. The phosphorylation intensity was measured by determining the optical gray value.RESULTSThe photochemical reaction induced cerebral ischemia and resulted in obvious lesions in hippocampus CA1 neurons. The damages of ultrastructure in the hippocampus were diminished by postconditioning. Correspondingly, in ischemia group, although the Akt[pS473] showed positive during 72 h, the positive Akt[pT308] was only observed at the time point of 4 h, and went negative at the time points of 24 h and 72 h. In postconditioning group, Akt[pS473] at the time points of 4 h, 24 h and 72 h were positive,and Akt[pT308] at the time points of 24 h and 72 h was also positive.CONCLUSIONCerebral ischemia leads to neuron lesions in tree shrew hippocampus and the postconditioning decreases the damage. The Akt[pS473] and Akt[pT308] may play important roles in the protective mechanism.

Brain ischcemia; Ischmic postconditioning; Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt; Signal transduction; Tree shrew

R363

A

1000-4718(2011)03-0560-06

2010-08-23

2010-12-06

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30660056;No.30971171)；昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院院內(nèi)基金資助項(xiàng)目(No.2009BS09)

△通訊作者Tel：0871-5338591;E-mail: shuqing591 @hotmail.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.027