漢黃芩素對(duì)流感病毒感染肺泡巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的影響*

吳 瑩, 金葉智, 吳 珺， 于雪飛， 郝 鈺

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥防治病毒性疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029)

漢黃芩素對(duì)流感病毒感染肺泡巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的影響*

吳 瑩, 金葉智, 吳 珺， 于雪飛， 郝 鈺△

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥防治病毒性疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029)

目的研究漢黃芩素對(duì)甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/FM/1/47(H1N1)感染的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(NR8383)產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)及氧自由基的影響。方法流感病毒感染 NR8383細(xì)胞1 h后，加入含漢黃芩素的培養(yǎng)基(終濃度16 mg/L)，藥物作用后6 h、12 h和24 h，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中腫瘤壞死因子α(TNF-α)和單核細(xì)胞趨化蛋白 1(MCP-1)的含量，放射免疫測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞上清中前列腺素E2(PGE2)、磷脂酸A2(PLA2)和白三烯B4(LTB4)的含量；藥物作用后8 h、24 h、36 h和48 h，生化法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)一氧化氮(NO)含量和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)活性，4 h、8 h、18 h和24 h，生化法檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量；藥物作用后24 h，real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TNF-α和MCP-1的mRNA水平。結(jié)果漢黃芩素抑制了流感病毒感染NR8383細(xì)胞后TNF-α、MCP-1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)(P<0.01)，降低了PGE2、PLA2、LTB4和MDA的含量(P<0.05)；減少了NO和iNOS的產(chǎn)生(P<0.05)，增強(qiáng)了SOD的活性(P<0.05)。結(jié)論漢黃芩素明顯抑制了流感病毒感染后肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)各種炎癥相關(guān)因子的產(chǎn)生，具有抗炎作用。

漢黃芩素； 流感病毒A型； 巨噬細(xì)胞，肺泡； 細(xì)胞因子類

中藥黃芩是用于治療流感的復(fù)方中的常用組分(如毒熱平注射液，雙黃連口服液等)，其主要有效成分為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素[1]。研究表明，黃芩提取物及黃芩苷、黃芩素在體內(nèi)外均具有直接抗流感病毒的作用，然而，漢黃芩素在抗流感治療中的作用目前尚不清楚[2，3]。流行性感冒病毒是成年人和老人病毒性肺炎最為常見的病原體。在流感病毒性肺炎的發(fā)病機(jī)制中，除病毒感染的直接損傷外，病毒引起的免疫損傷也起著重要作用，其中，肺泡巨噬細(xì)胞是啟動(dòng)肺部炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞。流感病毒感染后刺激肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過量的炎癥因子、炎癥介質(zhì)及氧自由基，加重肺內(nèi)炎癥反應(yīng)[4，5]。因此，本研究旨在通過分析漢黃芩素對(duì)甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/FM/1/47(H1N1)感染大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(NR8383)后產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)及氧自由基的影響，明確漢黃芩素在抗流感病毒治療中發(fā)揮的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1病毒與細(xì)胞 甲型流感病毒鼠肺適應(yīng)株A/FM/1/47(H1N1)，由中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所提供，-76 ℃保存?zhèn)溆?。? d齡雞胚尿囊腔連續(xù)傳代2次后，測(cè)血凝滴度為1∶512，病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(median tissue culture infective dose,TCID50)為103.6/L。大鼠肺泡巨噬細(xì)胞系(NR8383)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，由本室傳代后使用。

1.2藥物與試劑 漢黃芩素(批號(hào)111514-200403)為中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品，配成10 g/L的原藥液。F12K干粉購(gòu)于Sigma；胎牛血清為Hyclone產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium， MTT)為Amresco產(chǎn)品。大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白 1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)ELISA試劑盒購(gòu)于BD。大鼠腫瘤壞死因子( tumor necrosis factor-alpha，TNF-α) ELISA 試劑盒購(gòu)于深圳晶美公司。白三烯B4(leukotriene B4, LT-B4)、前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)和磷脂酶A2(phospholipase A2, PLA2)放射免疫測(cè)定試劑盒購(gòu)于北京華英生物技術(shù)研究所。丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。Griess試劑由本室配制，4 ℃保存。RIPA裂解液(批號(hào)為092003)購(gòu)于北京尚柏生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Trizol試劑購(gòu)于Invitrogen。反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)于Fermentas MBI。 PCR試劑購(gòu)于大連寶生物工程有限公司。SYBR Green試劑購(gòu)于北京天根生化科技有限公司。

1.3熒光定量PCR引物 MCP-1引物：上游5’-GGGTCCAGAAGTACATTAGA-3’，下游5’-GCTGAAGTCCTTAGGGTTGA-3’。TNF-α引物：上游5’-CCACGCTCTTCTGTCTACTG-3’ ，下游5’-GCTACGGGCTTGTCACTC-3’。內(nèi)參照β-actin引物：上游5’-CCACTGCCGCATCCTCTT-3’，下游5’-GCATCGGAACCGCTCATT-3’。以上引物均由北京凱諾春天生物科技有限公司合成。

2方法

2.1藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) NR8383細(xì)胞為半貼壁半懸浮細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，吹打消化細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞至5×108cells/L，將該細(xì)胞液加入96孔板中，90 μL/well，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用培養(yǎng)液將漢黃芩素用2倍稀釋法稀釋為不同濃度，加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，10 μL/well，使藥物的終濃度為0.032 g/L、0.016 g/L、0.008 g/L、0.004 g/L、0.002 g/L、0.001 g/L，每個(gè)藥物稀釋濃度平行做6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h后，用MTT(終濃度0.5 g/L)比色法檢測(cè)藥物對(duì)NR8383細(xì)胞的毒性，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%) =實(shí)驗(yàn)組吸光度值(A)/細(xì)胞對(duì)照組吸光度值(A)×100%，確定藥物最大無毒濃度(TC0)。

2.2ELISA檢測(cè)MCP-1和TNF-α 接種5×108cells/L NR8383細(xì)胞至24孔板，500 μL/cell，用100 TCID50的流感病毒感染NR8383細(xì)胞后，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中吸附1 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入0.16 g/L的漢黃芩素藥液，500 μL/cell，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照。置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h后，1 000 r/min 離心5 min，吸取上清，按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)上清中MCP-1和TNF-α含量。

2.3熒光定量PCR檢測(cè)MCP-1和TNF-α mRNA水平 藥物作用于流感病毒感染的NR8383細(xì)胞后24 h，吹打消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞樣品，用PBS溶液洗滌3次后，加入1 mL Trizol試劑，混勻，按試劑操作說明書提取細(xì)胞總RNA。取2 μg 總RNA為模板，以寡核苷酸Oligo(dT)為引物，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為25 μL，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

PCR擴(kuò)增按SYBR green試劑說明書進(jìn)行：反應(yīng)體系為40 μL，含2×mixture 20.0 μL，模板 1.0 μL，上游引物(20 μmol/L)1.0 μL，下游引物(20 μmol/L)1.0 μL，無菌水17.0 μL。擴(kuò)增條件為：50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min,然后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，讀板，共40個(gè)循環(huán)。

2.4放射免疫測(cè)定法(RIA)檢測(cè)PGE2、PLA2和LTB4樣品準(zhǔn)備方法同2.2所示，按試劑盒說明書檢測(cè)上清中PGE2、PLA2和LTB4含量。

2.5生化法檢測(cè)細(xì)胞MDA、NO含量和SOD、iNOS活性 SOD活性的檢測(cè)采用黃嘌呤氧化酶法，MDA的檢測(cè)采用TBA法，樣品準(zhǔn)備方法同2.2所示。用藥后4 h、8 h、18 h和24 h，吸取細(xì)胞上清，按試劑盒說明書檢測(cè)上清中MDA含量和SOD活性。NO的檢測(cè)采用Griess試劑，用藥后8 h、24 h、36 h和48 h，取細(xì)胞上清100 μL，加入Griess 試劑，100 μL/well，室溫顯色10 min，酶標(biāo)儀530 nm下測(cè)定各孔的A值。iNOS活性的檢測(cè)采用比色法，用藥后8 h、24 h、36 h、48 h，1 000 r/min離心5 min，棄細(xì)胞上清，加入200 μL細(xì)胞裂解液，吹打混勻后，12 000 r/min離心4 min，取上清100 μL，按試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)iNOS活性。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1漢黃芩素對(duì)NR8383細(xì)胞的毒性測(cè)定

MTT的檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)漢黃芩素的濃度分別

為0.032 g/L、0.016 g/L、0.008 g/L、0.004 g/L、0.002 g/L和0.001 g/L時(shí)，對(duì)應(yīng)NR8383細(xì)胞存活率為70.66%、94.25%、99.83%、95.08%、93.64%和99.82%，漢黃芩素對(duì)NR8383細(xì)胞的的最大無毒濃度為0.016 g/L。

2漢黃芩素抑制流感病毒感染NR8383細(xì)胞后MCP-1和TNF-α的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)

流感病毒感染肺泡巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞上清中MCP-1的含量明顯增加，在各時(shí)點(diǎn)與正常細(xì)胞組比較均有顯著差異(P<0.01)。漢黃芩素作用后，降低了巨噬細(xì)胞分泌的MCP-1含量，用藥后6 h、12 h和24 h，與病毒組比較均有顯著差異(P<0.01)，見圖1A。而病毒感染后TNF-α的含量在 12 h和24 h升高，與正常細(xì)胞組比較有顯著差異(P<0.01)，漢黃芩素作用后，降低了巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α含量，與病毒組比較有顯著差異(P<0.01)，見圖1B。漢黃芩素抑制了流感病毒感染后肺泡巨噬細(xì)胞MCP-1和TNF-α的轉(zhuǎn)錄，與病毒組比較差異顯著(P<0.01)，見表1。

圖1漢黃芩素對(duì)流感病毒感染NR8383細(xì)胞后MCP-1和TNF-α分泌的影響

表1漢黃芩素對(duì)流感病毒感染NR8383細(xì)胞后MCP-1和TNF-α轉(zhuǎn)錄的影響

GroupMCP-1mRNA/β-actinmRNATNF-αmRNA/β-actinmRNANormal0．1577±0．0224??0．0304±0．0006??Virus0．4767±0．11000．3746±0．0505Virus+wogonin0．2775±0．0807??0．1704±0．0203??

**P<0.01vsvirus group.

3漢黃芩素對(duì)流感病毒感染NR8383細(xì)胞后PGE2、PLA2和LTB4分泌的影響

流感病毒感染肺泡巨噬細(xì)胞后，培養(yǎng)上清液中PGE2的含量在6 h時(shí)有明顯增加，與正常細(xì)胞組相比有顯著差異(P<0.05)，隨后降低，與正常細(xì)胞組相比無顯著差異(P>0.05)，漢黃芩素作用后PGE2的分泌有一定的降低，但作用不明顯，與病毒組相比無顯著差異(P>0.05)，見圖2A。病毒組PLA2的含量在24 h時(shí)升高，與正常細(xì)胞組相比有顯著差異(P<0.05)，而漢黃芩素在用藥后6 h明顯降低了PLA2的含量，與正常細(xì)胞組、病毒組相比均有顯著差異(P<0.01)，其它時(shí)點(diǎn)則未表現(xiàn)出對(duì)PLA2的抑制作用，見圖2B。病毒組LTB4的含量在6 h、12 h時(shí)升高，與正常細(xì)胞組相比有顯著差異(P<0.05)，漢黃芩素在用藥后12 h對(duì)LTB4分泌的抑制作用最明顯，與病毒組相比有顯著差異(P<0.01)，見圖2C。

圖2漢黃芩素對(duì)流感病毒感染NR8383細(xì)胞后PGE2、PLA2和LTB4含量的影響

4漢黃芩素降低流感病毒感染NR8383細(xì)胞后NO含量和iNOS活性

肺泡巨噬細(xì)胞受流感病毒感染刺激后，NO分泌逐漸增多，漢黃芩素作用后明顯降低了病毒刺激后細(xì)胞NO的分泌至幾乎與正常細(xì)胞相同水平。用藥后24 h、36 h和48 h，漢黃芩素組的NO含量與病毒組相比有顯著差異(P<0.01),見圖3A。而細(xì)胞內(nèi)iNOS活性的變化與上清中NO的變化一致，用藥后24 h、36 h和48 h，漢黃芩素組iNOS活性與病毒組相比有顯著差異(P<0.05)，見圖3B。

5漢黃芩素降低MDA的含量，增強(qiáng)SOD的活性

流感病毒感染后，NR8383細(xì)胞中MDA含量增加，而漢黃芩素降低了病毒刺激后細(xì)胞MDA的含量，用藥后4 h和8 h，漢黃芩素組MDA的含量與病毒組相比有顯著差異(P<0.05)。流感病毒感染后細(xì)胞內(nèi)SOD的活性降低，表明細(xì)胞清楚氧自由基的能力降低，而漢黃芩素作用后增強(qiáng)了SOD活性，用藥后4 h、8 h，與病毒組相比有顯著差異(P<0.05，P<0.01)。

圖3漢黃芩素對(duì)流感病毒感染NR8383細(xì)胞內(nèi)NO含量和iNOS活性的影響

圖4漢黃芩素對(duì)流感病毒感染NR8383細(xì)胞中MDA含量及SOD活性的影響

討 論

病毒性肺炎是流感病毒感染后最嚴(yán)重的并發(fā)癥，導(dǎo)致較高的死亡率[6]。流感病毒性肺炎的病理變化，是由病毒復(fù)制引起感染細(xì)胞的直接損傷與宿主的免疫反應(yīng)共同作用的結(jié)果[7]。研究表明，小鼠流感病毒感染致命的后果更多的是取決于宿主的免疫病理?yè)p傷，而非病毒復(fù)制所致的直接細(xì)胞損傷[8]。

既往研究表明，黃芩提取物在小鼠流感病毒感染模型上能起到抗流感病毒的作用[2]。我們的前期研究對(duì)黃芩的主要單體成分黃芩苷、黃芩素及漢黃芩素的體外抗流感病毒的作用進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，黃芩苷在體外抗流感病毒作用最強(qiáng)，而漢黃芩素在體外無明顯的抗病毒作用[9]。

然而，近期研究表明，漢黃芩素具有明顯的抗炎、抗氧化作用，能明顯抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)巨噬細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞)活化后IL-6、NO、MCP-1以及調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(regulated upon activation,normal T-cell expressed and secreted,RANTES)等炎癥相關(guān)因子的分泌，起到神經(jīng)保護(hù)作用[10,11]。因此，我們?cè)O(shè)想，漢黃芩素可能通過抑制流感病毒感染后與宿主的免疫反應(yīng)，減輕免疫損傷，從而起到抗流感病毒感染后炎癥反應(yīng)的作用。本研究以流感病毒鼠肺適應(yīng)株感染的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(NR8383)細(xì)胞為模型，從3個(gè)方面分析了漢黃芩素對(duì)病毒感染后NR8383細(xì)胞分泌的炎癥相關(guān)因子的影響。

1漢黃芩素對(duì)流感病毒感染NR8383細(xì)胞后TNF-α和MCP-1轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的影響

TNF-α是病毒感染后最早釋放的前炎癥介質(zhì)之一，是肺部炎癥病變中最主要的促進(jìn)因子，主要由肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。過量的TNF-α能誘導(dǎo)肺內(nèi)皮細(xì)胞活化、白細(xì)胞遷移、粒細(xì)胞脫顆粒和毛細(xì)血管滲漏等，從而誘發(fā)并進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，炎性細(xì)胞在趨化因子作用下向病灶游走。其中CC家族趨化因子MCP-1主要參與單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)[12]。研究表明，巨噬細(xì)胞受流感病毒感染刺激后， MCP-1和TNF-α的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)明顯增強(qiáng)，漢黃芩素抑制了流感病毒感染后肺泡巨噬細(xì)胞MCP-1、TNF-α的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，與病毒組比較差異顯著(P<0.01)。

2漢黃芩素對(duì)流感病毒感染NR8383細(xì)胞后炎癥介質(zhì)PGE2、PLA2和LTB4分泌的影響

PGE2是花生四烯酸代謝過程中產(chǎn)生的1個(gè)重要炎癥介質(zhì)，可通過其強(qiáng)大的擴(kuò)血管促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展。病毒刺激是導(dǎo)致PLA2激活的原因之一，激活的PLA2作用于細(xì)胞膜磷脂，產(chǎn)生花生四烯酸，其代謝產(chǎn)物L(fēng)TB4具有很強(qiáng)的嗜中性粒細(xì)胞趨化活性和淋巴細(xì)胞增殖作用，是目前已知最強(qiáng)的中性粒細(xì)胞催化因子和活化因子之一[13,14]。本研究表明，流感病毒感染肺泡巨噬細(xì)胞后，上清中PGE2、PLA2和LTB4的含量均有所增加。漢黃芩素能明顯降低PLA2和LTB4的含量(P<0.05)，對(duì)PGE2的分泌有一定的降低，但作用不明顯，與病毒組相比無顯著差異(P>0.05)。

3漢黃芩素對(duì)流感病毒感染NR8383細(xì)胞后NO、iNOS、SOD和MDA產(chǎn)生的影響。

NO 是重要的炎癥介質(zhì)，高水平NO導(dǎo)致細(xì)胞毒性作用，介導(dǎo)免疫損傷。iNOS主要在各種炎癥情況下表達(dá)，NO的大量產(chǎn)生可能來源于iNOS誘導(dǎo)表達(dá)[15]。MDA的水平反映脂質(zhì)過氧化程度，而SOD是機(jī)體重要的抗氧化酶，可清除自由基，減輕氧化損傷[16,17]。MDA間接反映細(xì)胞損傷程度，SOD活性反映機(jī)體清除氧自由基的能力。本研究表明，肺泡巨噬細(xì)胞受流感病毒感染刺激后，iNOS和NO的含量逐漸增多，漢黃芩素作用后明顯降低了病毒刺激后細(xì)胞NO和iNOS的水平。NR8383細(xì)胞中MDA的含量在流感病毒感染后增加，表明細(xì)胞膜產(chǎn)生了脂質(zhì)過氧化損傷，而漢黃芩素降低了病毒刺激后細(xì)胞MDA的含量，增強(qiáng)了SOD活性。

綜上，本研究證實(shí)了漢黃芩素對(duì)流感病毒感染后肺泡巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)因子的產(chǎn)生具有明顯的抑制作用，明確了漢黃芩素在抗流感治療中發(fā)揮了抗炎的作用，為漢黃芩素的藥理作用增加了新的內(nèi)容。我們?cè)O(shè)想，黃芩主要通過黃芩苷、黃芩素直接抗流感病毒，而通過漢黃芩素抑制流感病毒感染后的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而起到既抗病毒又抗炎的作用，這為黃芩臨床治療流感病毒性肺炎提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)與基礎(chǔ)。

[1] 宋旦哥，孟慶剛. 黃芩藥理作用研究述評(píng)[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009，27(8)：1619-1621.

[2] 初 明,初正云,王丹丹. 復(fù)方黃芩提取物對(duì)小鼠體內(nèi)流感病毒mRNA復(fù)制和干擾素(IFN)表達(dá)的影響[J]. 中藥材,2007,30 (1):63-65.

[3] 吳修華，劉 妮，楊 麗，等. 黃芩素體內(nèi)抗甲型流感病毒作用的研究[J]. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，26(2):157-159、200.

[4] Seo SH, Webby R, Webster RG. No apoptotic deaths and different levels of inductions of inflammatory cytokines in alveolar macrophages infected with influenza viruses[J]. Virology, 2004,329(2):270-279.

[5] Snelgrove RJ, Edwards L, Rae AJ,et al. An absence of reactive oxygen species improves the resolution of lung influenza infection[J]. Eur J Immunol, 2006, 36(6):1364-1373.

[6] Wang J, Oberley-Deegan R, Wang S, et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-λ1) in response to influenza A infection[J]. J Immunol, 2009, 182(3):1296-1304.

[7] Kim HM, Lee YW, Lee KJ, et al. Alveolar macrophages are indispensable for controlling influenza viruses in lungs of pigs[J]. J Virol, 2008， 82(9):4265-4274.

[8] Shimomura E, Suzuki F, Ishida N. Characterization of cells infiltrating the lungs of x-irradiated and nude mice after influenza virus infection[J]. Microbiol Immunol, 1982, 26(2): 129-138.

[9] 吳 瑩, 金葉智, 吳 珺，等. 黃芩主要成分體外抗甲型流感病毒作用的研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 33(8)：541-545.

[10]樸花子，于兆霞，樸日龍，等. 漢黃芩素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)一氧化氮和單核細(xì)胞趨化蛋白-1的影響[J]. 中藥藥理與臨床, 2007, 23(3)：20-21.

[11]樸花子，鄭善子，崔萬(wàn)善. 漢黃芩素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)細(xì)胞因子IL-6和趨化因子RANTES的影響[J].中藥藥理與臨床, 2008, 24(6)：34-36.

[12]沈 燕，熊思東.MCP-1結(jié)構(gòu)與功能的分子基礎(chǔ)[J].生命的化學(xué), 2002,22(1)：58-60.

[13]Lin WW,Chen BC. Pharmacology comparison of UTP-and thapsigargin-induced acid release in mouse RAW 264.7 macrophages[J]. Br J Pharmacol, 1998, 123(6):1173-1181.

[14]Sampson SE, Costello JF, Sampson AP. The effect of inhaled leukotriene B4 in normal and in asthmatic subjects[J]. Am J Respir Crit Care Med, 1997, 155(5):1789-1799.

[15]Michel T，F(xiàn)eron O.Nitric oxide synthase：which，where，how，and why?[J].J Clin Invest,1997, 100(9):2146-2152.

[16]李建強(qiáng)，高曉玲，劉卓拉，等.膽紅素對(duì)抗脂多糖誘導(dǎo)致大鼠急性肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)病理生理雜志, 2005, 21(4)：780-783.

[17]王秋林，王浩毅，王樹人.氧化應(yīng)激狀態(tài)的評(píng)價(jià)[J].中國(guó)病理生理雜志, 2005, 21(10)：2069-2074.

Effectsofwogoninoninflammation-relatedfactorsinalveolarmacrophagesinfectedwithinfluenzavirus

WU Ying, KIM Ye-ji, WU Jun, YU Xue-fei, HAO Yu

(KeyLaboratoryofChineseMedicineonViralDisease,MinistryofEducation,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China.E-mail:yuhao64@sina.com)

AIM: To study the effects of wogonin on A inflammatory cytokines, inflammatory mediators and oxygen free radical generated from rat alveolar macrophages (NR8383) infected with influenza A virus adapted to mouse A/FM/1/47(H1N1).METHODSAfter 1 h adsorption of the influenza virus, the medium containing 16 mg/L wogonin was added to NR8383 cells. At 6 h, 12 h and 24 h of wogonin exposure, the cultured supernatants were collected and the concentrations of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) were measured by ELISA. The concentrations of inflammatory mediators prostaglandin E2(PGE2), phospholipase A2(PLA2) and leukotriene B4(LTB4) were detected by radioimmunoassay (RIA). At 8 h, 24 h, 36 h and 48 h after wogonin exposure, the concentration of nitric oxide(NO) and the activity of inducible nitric oxide synthase(iNOS) were determined by biochemical detection. At 4 h, 8 h, 18 h and 24 h after wogonin exposure, biochemical detection was also used to measure the activity of superoxide dismutase(SOD) and the concentration of malondialdehyde(MDA). The mRNA levels of TNF-α and MCP-1 were determined 24 h after drug application by real-time PCR.RESULTSWogonin inhibited the transcription and expression of TNF-α and MCP-1 in NR8383 cells infected with the influenza virus (P<0.01), and reduced the concentrations of PGE2, PLA2, LTB4and MDA (P<0.05). Wogonin also reduced the production of NO and the activity of iNOS (P<0.05), and increased the activity of SOD (P<0.05).CONCLUSIONWogonin obviously inhibits the production of various inflammation-related factors in alveolar macrophages infected with influenza virus, indicating its anti-inflammatory mechanism on influenza virus infection.

Wogonin; Influenza A virus; Macrophages,alveolar; cytokines

R285.5

A

1000-4718(2011)03-0533-06

2010-09-08

2010-11-22

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 30772871)

△通訊作者 Tel：010-64286973； E-mail: yuhao64@sina.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.022

本文獲2010年中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)炎癥發(fā)熱感染低溫專業(yè)委員會(huì)和中醫(yī)專業(yè)委員會(huì)第12屆聯(lián)合學(xué)術(shù)交流會(huì)青年優(yōu)秀論文一等獎(jiǎng)