肝癌SMMC-7721細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞分選及其生物學(xué)特性的研究*

黃 濤, 周 奇， 宮東偉， 高全立， 張旭華, 呂曉東， 周進(jìn)學(xué)

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，河南省腫瘤醫(yī)院 1肝膽胰外科，4生物治療科,5中心實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000；2中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510080；3新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院普外科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

肝癌SMMC-7721細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞分選及其生物學(xué)特性的研究*

黃 濤1△, 周 奇2， 宮東偉3， 高全立4， 張旭華5, 呂曉東5， 周進(jìn)學(xué)1

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，河南省腫瘤醫(yī)院1肝膽胰外科，4生物治療科,5中心實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000；2中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510080；3新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院普外科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的分選肝癌SMMC-7721細(xì)胞中的側(cè)群(SP)細(xì)胞并分析其生物學(xué)特性。方法采用流式細(xì)胞熒光激活分選(FACS)技術(shù)將SMMC-7721細(xì)胞分為SP細(xì)胞和非側(cè)群(NSP)細(xì)胞2個(gè)亞群。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線法和平板克隆法比較SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力；Transwell法檢測(cè)SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的遷移及侵襲能力；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率；裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)比較SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的致瘤性。結(jié)果SMMC-7721細(xì)胞中分選出的SP細(xì)胞比例為(9.2±0.2)%。SP細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例高于NSP細(xì)胞，凋亡率低于NSP細(xì)胞(P<0.05)；SP細(xì)胞的增殖速度、克隆形成能力、體外遷移和侵襲能力均明顯高于NSP細(xì)胞(P<0.05)；裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示SP細(xì)胞的致瘤能力明顯高于NSP細(xì)胞。結(jié)論肝癌SMMC-7721細(xì)胞中的SP細(xì)胞可能富集了肝癌干細(xì)胞。

肝腫瘤； 側(cè)群細(xì)胞； 腫瘤干細(xì)胞； SMMC-7721細(xì)胞

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是目前死亡率位列第3的惡性腫瘤，具有手術(shù)切除率低、術(shù)后復(fù)發(fā)率高及放化療不敏感等臨床特點(diǎn)，探索新的治療方法是提高HCC患者生存率的關(guān)鍵。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為腫瘤是由分化程度不同的細(xì)胞構(gòu)成的，僅少數(shù)細(xì)胞即腫瘤干細(xì)胞有形成腫瘤的能力，是腫瘤耐藥及復(fù)發(fā)的根源[1]。如果利用特異標(biāo)記找到HCC干細(xì)胞并以此為靶點(diǎn)進(jìn)行治療，可能有望攻克HCC。側(cè)群(side population, SP)細(xì)胞是一種特殊類型的干細(xì)胞，因其能將Hoechst 33342排出細(xì)胞而呈弱染狀態(tài)[2]。在缺乏特異標(biāo)記的情況下，SP細(xì)胞分選和分析成為研究HCC干細(xì)胞的一種實(shí)用而重要的方法。本研究利用SP細(xì)胞的弱染特性將其從肝癌SMMC-7721細(xì)胞中分選出來，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為肝癌干細(xì)胞理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料與試劑

人肝癌SMMC-7721細(xì)胞來自上海中科院細(xì)胞庫，保存于河南省腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司。胎牛血清購自鄭州益康公司。胰蛋白酶粉購自鄭州寶信公司。碘化丙啶(PI)、維拉帕米(verapamil)、Hoechst33342購自Sigma。Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購自北京寶賽公司。Transwell小室購自Corning。Matrigel和FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀購自BD。CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Revco。臺(tái)式離心機(jī)購自Beckman。裸鼠購自中科院動(dòng)物研究所。

2細(xì)胞培養(yǎng)

肝癌SMMC-7721細(xì)胞以含10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、飽和濕度、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每3-4 d傳代1次。

3流式細(xì)胞熒光激活分選

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×109cells/L，實(shí)驗(yàn)組加入Hoechst33342至終濃度2.5mg/L，對(duì)照組再加入verapamil至終濃度100 mg/L，以拮抗SP細(xì)胞外排Hoechst33342的特性。 37 ℃水浴60 min，期間每隔15 min振動(dòng)混勻細(xì)胞1次。用PBS洗滌離心1次，重懸于冰冷的RPMI-1640培養(yǎng)基中，上機(jī)檢測(cè)前加入PI至終濃度1 mg/L。詳細(xì)操作及SP細(xì)胞檢測(cè)參照文獻(xiàn)[3]，在活細(xì)胞中收集SP細(xì)胞和非SP(NSP)細(xì)胞。

4生長(zhǎng)曲線繪制及克隆形成能力比較

將前1 d分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，分別接種于24孔板中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞。每隔24 h SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞各取3孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算平均值。8 d后以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

將分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞分別接種于6孔板，每孔200個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)14 d后進(jìn)行Giemsa染色并計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的克隆，計(jì)算克隆形成率(colony fformation efficiency，CFE)，CFE=克隆形成數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

5Transwell小室遷移侵襲實(shí)驗(yàn)

采用帶有8 μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)。按5×108cells/L的濃度將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液。上室各孔中加入100 μL細(xì)胞懸液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，孵箱中培養(yǎng)48 h后自24孔板中取出上室，用棉簽擦去微孔膜上室面的細(xì)胞，然后將小室置于95%乙醇中固定15 min，蘇木素染色15 min，于200倍光鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，取平均值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)中按1∶3的比例混合matrigel和無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，于上室加入50 μL混合液，37 ℃孵育2 h使其凝固，制成人工基底膜。其它步驟同Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。

6細(xì)胞周期檢測(cè)

胰酶消化并離心收集前1 d分選出的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次后懸于0.5 mL PBS中。將0.5 mL細(xì)胞懸液緩緩滴加入4 mL預(yù)冷的75%乙醇中，于4 ℃固定2 h以上。離心收集固定后的細(xì)胞，PBS洗細(xì)胞1次，加入1 mL PI染色液，室溫避光孵育30 min，然后直接上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。計(jì)數(shù)2-3萬個(gè)細(xì)胞，用細(xì)胞周期分析軟件計(jì)算處于G0/G1、S和G2/M期的細(xì)胞比例。

7細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將前1 d分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，分別制成單個(gè)細(xì)胞懸液，然后收集細(xì)胞，用PBS 洗滌2 次。將細(xì)胞重懸于200 μL 結(jié)合緩沖液。加入10 μL Annexin V-FITC 輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min。加入300 μL 結(jié)合緩沖液和5 μL PI，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。用細(xì)胞凋亡分析軟件計(jì)算Annexin V+細(xì)胞的比例。

8裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

將裸鼠隨機(jī)分組，每組6只。將分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞按1×105、1×104和1×103的數(shù)量分別注射到裸鼠背部皮下，每3 d觀察1次腫瘤形成情況，連續(xù)4周。

9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1人肝癌SMMC-7721細(xì)胞中SP細(xì)胞的分選

SP細(xì)胞能排出熒光染料Hoechst33342而呈弱染狀態(tài)，位于流式圖的左下角熒光弱染區(qū)。SMMC-7721細(xì)胞中SP細(xì)胞的比例為(9.2±0.2)%，對(duì)照組加verapamil，抑制了細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，從而改變了SP細(xì)胞外排熒光染料的特性，使SP細(xì)胞比例減少至(0.0±0.0)%，見圖1。用離心管收集分選的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞備用。

Figure 1. Analysis of side population (SP) cells among SMMC-7721 cells by fluorescence-activated cell sorter (FACS). A: Hoechst 33342; B: Hoechst 33342+ verapamil.

圖1流式細(xì)胞儀分析SMMC-7721細(xì)胞中的SP細(xì)胞

2SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的體外增殖能力和克隆形成能力

SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線顯示，SP細(xì)胞快速增殖至指數(shù)增長(zhǎng)期，相對(duì)而言非SP細(xì)胞增殖異常緩慢，在1周時(shí)點(diǎn)尚未達(dá)到平臺(tái)期，見圖2。SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞生長(zhǎng)速度差異顯著(n=3,P<0.05)。

Figure 2. Proliferation curves of SP cells and NSP cells.

圖2肝癌SP細(xì)胞與NSP細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖

與NSP細(xì)胞相比，SP細(xì)胞形成的克隆較密集且直徑較大，見圖3。計(jì)算SP細(xì)胞的CFE為(35.5±5.6)%，而NSP細(xì)胞的CFE為(13.8±4.1)%，二者差異顯著(n=3,P<0.05)。

Figure 3. Colony formation assay of SP cells and NSP cells.

圖3SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞克隆形成能力的比較

3SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力

Transwell小室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的遷移和侵襲能力存在明顯差異,見圖4。Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)中SP細(xì)胞穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)為(203.6±24.3)個(gè)，而NSP細(xì)胞僅為(71.5±12.4)個(gè)；Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)中SP細(xì)胞穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)為(67.6±9.6)個(gè)，而NSP細(xì)胞僅為(27.6±10.7)個(gè)，兩組比較均差異顯著(n=3,P<0.05)。

4SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的細(xì)胞周期檢測(cè)

細(xì)胞周期分析結(jié)果表明，SP細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例為(64.06%±1.21)%， NSP 細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例為(53.14±1.06)%，SP細(xì)胞中處于靜止期的細(xì)胞較NSP細(xì)胞多，見圖5，差異顯著(n=3,P<0.05)。

Figure 4. Invisive ability of SP cells and NSP cells detected by Transwell invation assay. A: SP cells; B: NSP cells.

圖4Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的侵襲能力

5SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的凋亡率檢測(cè)

細(xì)胞凋亡分析結(jié)果顯示，SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞中Annexin V+細(xì)胞比例分別為(15.70±4.92)%和(50.20±7.72)%，兩者差異顯著(n=3,P<0.05)，見圖6。

6裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1×103數(shù)量的SP細(xì)胞可在4周后形成明顯的皮下移植瘤。NSP細(xì)胞則至少需1×105才能成瘤。

Figure 5. Cell cycle analysis of SP cells and NSP cells. The left panel shows the result of SP cells and the right one exhibit the result of NSP cells.

圖5SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞周期分析結(jié)果

Figure 6. Apoptosis detection of SP cells and NSP cells by flow cytometry and Annexin V-FITC/PI.

圖6AnnexinV-FITC/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)SP與NSP細(xì)胞凋亡

討 論

腫瘤干細(xì)胞是存在于腫瘤組織中一小群具有自我更新和無限增殖潛能的細(xì)胞，它們可以分化成異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞，是腫瘤形成的根源，也是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移、化療耐受、復(fù)發(fā)的主導(dǎo)因素[4,5]。腫瘤干細(xì)胞理論可以更好地解釋腫瘤的生物學(xué)特性，也改變了傳統(tǒng)的腫瘤治療觀念。如果找到腫瘤干細(xì)胞并以此為治療靶點(diǎn)，可能從根本上治愈腫瘤。目前缺乏特異性的標(biāo)記物是腫瘤干細(xì)胞研究的難題，更多的觀點(diǎn)只是基于現(xiàn)象的理論推測(cè)。

Goodell等[6]在用DNA染料Hoechst33342為細(xì)胞染色的流式細(xì)胞儀分析中發(fā)現(xiàn)，有一群細(xì)胞染色偏低，與其它大部分細(xì)胞不一樣，遂命名為SP細(xì)胞。這群細(xì)胞對(duì)多種染料和藥物具有排斥作用，可能是其細(xì)胞表面的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)載體將Hoechst33342泵出細(xì)胞體外的緣故[2]。包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞株都存在SP細(xì)胞，提示SP細(xì)胞是存在于惡性腫瘤中的一個(gè)普遍現(xiàn)象[7-10]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，從腫瘤細(xì)胞中分選出的SP細(xì)胞比NSP細(xì)胞具有更高的惡性行為，SP細(xì)胞可能代表了一群原始的干細(xì)胞[11,12]。目前，分選具有干細(xì)胞特性的SP細(xì)胞已成為多種腫瘤干細(xì)胞深入研究的有力工具。本研究利用流式細(xì)胞熒光激活分選技術(shù)分選肝癌SMMC-7721細(xì)胞中的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞，結(jié)果顯示SMMC-7721細(xì)胞中SP細(xì)胞的比例為(9.2±0.2)%，加入鈣離子通道阻滯劑verapamil后SP細(xì)胞比例為(0.0±0.0)%，證明肝癌SMMC-7721細(xì)胞中也存在一定比例的SP細(xì)胞。

細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，肝癌SP細(xì)胞中處于靜止期的細(xì)胞較NSP細(xì)胞多，差異顯著。這與Benchaouir等[13]的研究結(jié)果一致。他們對(duì)SP細(xì)胞的細(xì)胞周期研究中發(fā)現(xiàn)，多數(shù)SP細(xì)胞是處于G0期的靜止細(xì)胞，采用DNA芯片技術(shù)對(duì)SP細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄能力與主群細(xì)胞相比大幅降低，細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞周期停滯相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，而與細(xì)胞周期運(yùn)行的相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，符合干細(xì)胞的慢周期特征。抗凋亡是腫瘤干細(xì)胞的特性之一，腫瘤組織中大多數(shù)腫瘤細(xì)胞經(jīng)過有限增殖和更新后凋亡，而極少數(shù)腫瘤干細(xì)胞則成為腫瘤生長(zhǎng)的“種子”[14]。本研究細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，肝癌SMMC-7721細(xì)胞中的NSP細(xì)胞凋亡率顯著高于SP細(xì)胞。

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明，SP細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯快于NSP細(xì)胞；平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示SP細(xì)胞的克隆形成率高于NSP細(xì)胞，且SP細(xì)胞形成的克隆較密集且直徑較大。這可能是因?yàn)镾P細(xì)胞中含有更多的干細(xì)胞，干細(xì)胞分化為祖細(xì)胞后增殖速度加快，形成更多更大的克隆。但即便是SP細(xì)胞，克隆形成率也只有35.5%左右，這一方面可能因?yàn)榉诌x出的SP細(xì)胞中只有一部分是肝癌干細(xì)胞，另一個(gè)原因可能是熒光染料Hoechst 33342的細(xì)胞毒性以及分選過程中機(jī)械損傷導(dǎo)致細(xì)胞在培養(yǎng)過程中死亡。

侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的生物學(xué)特性之一[15]，腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性同樣表現(xiàn)在這一復(fù)雜、多級(jí)過程中。在轉(zhuǎn)移過程中，大約有90%侵入循環(huán)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移細(xì)胞可以到達(dá)腫瘤轉(zhuǎn)移灶，有2%的散在細(xì)胞可以組成微小轉(zhuǎn)移，而只有0.02%或是更少的細(xì)胞可以發(fā)育成血管，形成轉(zhuǎn)移灶的微環(huán)境[16]。從這一現(xiàn)象可以推測(cè)參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的可能是腫瘤干細(xì)胞。本研究中Transwell小室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SP細(xì)胞48 h穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)多于NSP細(xì)胞，提示SP細(xì)胞中可能存在參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的腫瘤干細(xì)胞亞群。

裸鼠是細(xì)胞免疫缺陷動(dòng)物，免疫力極低，是干細(xì)胞研究較好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。我們把分選出的SP細(xì)胞移植到裸鼠身上，觀察SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞的致瘤性，結(jié)果顯示SP細(xì)胞成瘤能力明顯高于NSP細(xì)胞。經(jīng)過1次粗篩的SP細(xì)胞只需要1×103個(gè)細(xì)胞即可成瘤，而NSP細(xì)胞成瘤性顯著減弱，但1×105NSP細(xì)胞組中也有腫瘤形成，其原因可能是分選的SP細(xì)胞亞群并不能代表所有的腫瘤干細(xì)胞，也可能是分選出的NSP細(xì)胞中可能含有少量的SP細(xì)胞。

綜上所述，本研究證實(shí)肝癌SMMC-7721細(xì)胞中存在SP細(xì)胞，而且SP細(xì)胞的增殖、克隆形成、抗凋亡、遷移侵襲能力和成瘤能力均高于NSP細(xì)胞，SP細(xì)胞可能富集了腫瘤干細(xì)胞。研究結(jié)果將為我們后續(xù)針對(duì)SP表型治療肝癌提供理論依據(jù)。

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BiologicalcharacteristicsofsidepopulationcellssortedfromhepatomaSMMC-7721cellline

HUANG Tao1, ZHOU Qi2, GONG Dong-wei3, GAO Quan-li4, ZHANG Xu-hua5, Lü Xiao-dong5, ZHOU Jin-xue1

(1DepartmentofHepatopancreatobiliarySurgery,4DepartmentofCancerBiotherapy,5CentralLaboratory,TheAffiliatedTumorHospital,ZhengzhouUniversity,HenanTumorHospital,Zhengzhou450000,China;2DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;3DepartmentofGeneralSurgery,TheThirdAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China;E-mail:hbht68@163.com)

AIM: To study the biological characteristics of side population (SP) cells sorted from hepatoma SMMC-7721 cell line.METHODSFluorescence-activated cell sorter (FACS) was used to sort SP cells and non-SP (NSP) cells from SMMC-7721 cell line. The colony-formation ability and proliferation ability between SP cells and NSP cells were compared in terms of plate colony assay and growth curve. The migratory and invasive properties of SP cells and NSP cells were tested by Transwell method. The cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry. The oncogenicity of the cells was analyzed by nude mouse transplantation tumor experimentinvivo.RESULTSThe results of FACS analysis indicated that (9.2±0.2)% of the SMMC-7721 cells were SP cells. The proportion of G0/G1phase of SP cells was higher, and the apoptotic rate was lower than those of NSP cells (P<0.05). The proliferation ability and colony-forming ability and migratory and invasive properties of SP cells were significantly higher than those of NSP cells (P<0.05). The nude mouse transplantation tumor experiment displayed that the oncogenicity of SP cells was higher than that of NSP cells.CONCLUSIONThe SP cells sorted from SMMC-7721 cell line may enrich tumor stem cells.

Liver neoplasms; Side population cells; Tumor stem cells; SMMC-7721 cells

R735.7

A

1000-4718(2011)03-0523-05

2010-10-20

2010-11-30

河南省科技廳基礎(chǔ)與前沿研究資助項(xiàng)目(No.082300450100)

△通信作者 Tel: 0371-65587025; E-mail: hbht68@163.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.020