量子點免疫熒光技術檢測EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白在人肺癌組織中的表達意義*

潘 琦， 陳福春， 武百強， 鮑 軍， 薛潔皓， 陳洪雷

(1溫嶺市中醫(yī)院胸外科， 浙江 溫嶺 317500； 2武漢大學基礎醫(yī)學院病理學與病理生理學系，湖北 武漢 430071)

量子點免疫熒光技術檢測EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白在人肺癌組織中的表達意義*

潘 琦1， 陳福春1， 武百強1， 鮑 軍1， 薛潔皓1， 陳洪雷2△

(1溫嶺市中醫(yī)院胸外科， 浙江 溫嶺 317500；2武漢大學基礎醫(yī)學院病理學與病理生理學系，湖北 武漢 430071)

目的本研究利用新型免疫熒光標記試劑-量子點(QDs)結合組織芯片技術檢測細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(EMMPRIN/CD147)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)和P53 蛋白在人肺癌組織中的表達，并探討EMMPRIN與肺癌惡性生物學行為的關系。方法利用QDs免疫熒光組織化學(QDs-IHC)技術分別檢測人肺癌組織芯片中EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白的表達，并利用QDs免疫熒光雙標法同時檢測了EMMPRIN與P53蛋白的共表達。結果EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白表達在肺癌組織的陽性率分別為：70.00%、77.14%和72.86%，與非癌變肺組織相比，差異均顯著(P<0.05)；而且與肺癌的TNM分期、淋巴結轉移均顯著相關(P<0.05)，但與其它的臨床病理特征均明顯無關(P>0.05)。EMMPRIN和MMP-2、P53蛋白表達之間均呈顯著正相關(P<0.01)。結論EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白均與肺癌的發(fā)生有關，EMMPRIN可能與MMP-2、P53協(xié)同促進肺癌的惡性進展。

肺腫瘤； 細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子； 基質金屬蛋白酶2； 量子點

量子點(quantum dots, QDs)或半導體納米微晶體作為一種新型無機熒光染料，與傳統(tǒng)的有機熒光染料相比，具有獨特的光物理特性，目前已成為生物醫(yī)學標記和光學成像的強有力工具。我們基于量子點的免疫熒光標記技術在石蠟包埋組織中能很好地檢測不同抗原的表達，如可檢測腫瘤的分子標志物等[1,2]。癌細胞的侵襲轉移是促進肺癌惡性進展的重要因素，而細胞外基質(extracellular matrix, ECM)成分的降解是肺癌侵襲轉移的必要步驟，能降解ECM的蛋白酶最主要的是基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)。細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN/CD147)是個多功能蛋白，可誘導MMPs的產生而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[3]。本研究采用量子點免疫熒光組織化學(QDs-immunofluorescence histochemistry, QDs-IHC)結合組織芯片技術檢測EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白在肺癌組織中表達和臨床意義并探討EMMPRIN與MMP-2、P53蛋白表達的關系。

材 料 和 方 法

1材料

1.1病人資料 收集我院存檔的肺癌和非癌變肺組織蠟塊共80例，由桂林泛譜生物技術有限公司協(xié)助構建160芯肺癌組織芯片，10×16點陣，每點直徑1.1 mm，4 μm厚，其中包括70例肺癌組織，10例非癌變肺組織作為對照組，每例組織均有2點。所有組織術前均未經放、化療治療，經10%中性緩沖甲醛固定24 h。肺癌患者中男性57例，女性13例，年齡31-78歲，平均57歲。根據(jù)WHO(2004)肺腫瘤組織學分類法和國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2009年修訂的P-TNM分期標準：鱗癌35例(高、中分化和低分化分別為：8例和27例)，腺癌28例包括5例支氣管肺泡癌(高、中、低分化分別為：6例、16例和6例)，腺鱗癌4例，小細胞癌3例；TNM分期：ⅠA+ⅠB期37例，ⅡA+ⅡB期21例，ⅢA+ⅢB期12例。有淋巴結轉移28例，無淋巴結轉移42例。

1.2主要試劑 兔抗人EMMPRIN和MMP-2多克隆抗體(Zymed，工作濃度分別為1∶150、1∶100)，鼠抗人P53(sc-126)單克隆抗體(Santa Cruz，工作濃度為1∶100)；羊抗兔、鼠生物素化Ⅱ抗(Vector，工作濃度均為1∶400)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。量子點超敏熒光試劑盒(605 nm QD標記的鏈霉親和素, QD 605 nm-SA)和量子點雙染熒光試劑盒(QD 605 nm-SA+QD 545 nm-羊抗鼠IgG)均購自武漢珈源量子點技術開發(fā)有限責任公司。

2方法

2.1QDs-IHC檢測蛋白表達 實驗方法參照文獻[4]，組織芯片滴加90%甘油封片后，上熒光顯微鏡藍光激發(fā)QD605，以細胞內出現(xiàn)紅色的熒光顆粒為陽性。用TBS代替Ⅰ抗作空白對照，以已知陽性片作陽性對照。Olympus BX51(CCD DP72)熒光顯微鏡觀察顯示EMMPRIN蛋白定位于細胞膜和胞質內，MMP-2則定位于細胞胞質內，而P53則定位于胞核內。采用半定量評分方法，高倍鏡下每芯選3-4個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，首先將染色強度打分：0分為無色，1分為淡紅色，2分為紅色，3分為亮紅色；再按陽性細胞所占百分比打分：陰性為0分，陽性細胞數(shù)1%-10%為1分，陽性細胞數(shù)11%-50%為2分，陽性細胞數(shù)51%-75%為3分；陽性細胞數(shù)>75%為4分。染色強度與陽性細胞百分比的乘積≥2為免疫熒光組織化學反應陽性。

2.2QDs免疫熒光雙標法檢測EMMPRIN和P53蛋白共表達 實驗方法參照文獻[2]， 簡述如下：QD 605 nm-SA(工作濃度為1∶150)用以檢測EMMPRIN蛋白表達，QD 545nm-羊抗鼠IgG 的混合物(工作濃度為1∶50)用以檢測P53蛋白表達。90%緩沖甘油封片后，利用美國劍橋NuanceTM多光譜顯微成像系統(tǒng)觀察顯示EMMPRIN蛋白定位于細胞膜和胞質內呈紅色信號，而P53蛋白則定位于胞核內呈綠色信號，并統(tǒng)計EMMPRIN和P53蛋白的共表達例數(shù)。

3統(tǒng)計學處理

結 果

1EMMPRIN蛋白的表達意義

EMMPRIN蛋白主要表達在癌細胞的胞膜和胞質，而在癌旁正常組織中幾乎不表達，而在腫瘤周圍的間質細胞中有部分表達，見圖1A、B。結果如表1、2所示，70例肺癌組織中EMMPRIN蛋白的陽性率為70.00%，與對照組相比差異顯著(P<0.01)。EMMPRIN蛋白的陽性率與肺癌的年齡、性別、不同組織學類型和肺鱗癌、腺癌的病理分級之間無顯著相關(P>0.05)，而與高TNM分期和伴有淋巴結轉移呈顯著正相關(P<0.05)。

2MMP-2蛋白的表達意義

MMP-2蛋白主要表達在癌細胞的胞質，而在癌旁正常組織中幾乎不表達，而在成纖維細胞與內皮細胞中也有表達，見圖1C、D。結果如表1和表2所示，70例肺癌組織中MMP-2蛋白的陽性率為77.14%，與對照組相比差異顯著(P<0.01)。MMP-2蛋白的陽性率與肺癌的年齡、性別、不同組織學類型和肺鱗癌、腺癌的病理分級之間無顯著相關(P>0.05)，而與TNM分期(P<0.01)和淋巴結轉移均顯著相關(P<0.05)。

3P53蛋白的表達意義

P53蛋白則定位于肺癌細胞的胞核內，但在支氣管肺泡癌中幾乎均為陰性表達，見圖1E、F。結果如表1和表2所示，對照組和肺癌組中P53蛋白的陽性率分別為10.0%、72.86%，兩組間差異顯著(2=15.196,P<0.01)。P53蛋白表達陽性率在肺癌患者的不同年齡、性別、不同組織學類型和肺鱗癌、腺癌的病理分級之間差異均無顯著(P>0.05)。P53蛋白與高TNM分期(P<0.05)和伴有淋巴結轉移的肺癌呈顯著正相關(P<0.01)。

4EMMPRIN與MMP-2、P53蛋白表達之間的相關性

結果如表3所示，70例肺癌組織中，EMMPRIN和MMP-2蛋白共同陽性表達44例，共同陰性表達11例，二者呈顯著正相關(P<0.01,r=0.460)；EMMPRIN和P53蛋白共同陽性表達42例，見圖2，共同陰性表達12例，二者呈顯著正相關(P<0.01,r=0.442)。

表1 EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白在肺癌中的表達及其臨床病理意義

SCC:squamous cell carcinoma; AC:adenocarcinoma; ASC:adenosquamous carcinoma; SCLC:small cell lung cancer.

表2EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白表達與肺鱗癌、腺癌分級的關系

Table 2. Relationship between expression of EMMPRIN, MMP-2 and P53 proteins and grade of lung squamous cell carcinomas and adenocarcinomas

ParametersnEMMPRINPMMP-2PP53P﹣﹢﹣﹢﹣﹢Squamouscellcarcinoma35>0．05>0．05>0．05Well，moderatelydifferentiated8533544Poorlydifferentiated27720423720Adenocarcinoma28>0．05>0．05>0．05Welldifferentiated6242433Moderatelydifferentiated16511511313Poorlydifferentiated6061506

Figure 1. Expression of EMMPRIN, MMP-2 and P53 proteins detected by QDs-IHC in lung cancer (blue light excitation)A,B: positive expression of EMMPRIN protein in lung squamous cell carcinoma (A, ×100; B, ×200);C,D: positive expression of MMP-2 protein in lung squamous cell carcinoma(C, ×100; D, ×200);E,F: positive expression of P53 protein in lung adenocarcinoma (E, ×100; F, ×200).

圖1QDs-IHC檢測肺癌組織中EMMPRIN、MMP-2和P53的蛋白表達

表3肺癌組織中EMMPRIN與MMP-2、P53蛋白表達之間的關系

Table 3. Relationship between co-expression of EMMPRIN and MMP-2, P53 proteins in the lung cancer tissues

ParametersnEMMPRINrP﹣﹢P530．442<0．01﹣19127﹢51942MMP-20．460<0．01﹣16115﹢541044

討 論

蛋白的免疫標記技術在腫瘤標志物的檢測中已得到廣泛地使用。由于QDs具有很寬的激發(fā)光譜，單一波長激發(fā)光可激發(fā)QDs的多色熒光，因此可以用于多組分分子的同時檢測；并且發(fā)光強度大，熒光壽命長，光穩(wěn)定性好[2]，能與特異的靶分子相互作用，基于QDs的免疫標記比傳統(tǒng)方法更敏感，特別對于一些低表達基因的檢測。如Chen等[5]報道在乳腺癌的研究中利用QDs的熒光標記檢測Her-2蛋白的表達比傳統(tǒng)的IHC法更好。而本研究中采用QDs-IHC 技術檢測肺癌組織芯片中EMMPRIN、MMP-2和P53蛋白的表達，定位準確，并能長時間觀察熒光信號，沒有瘁滅現(xiàn)象，而且還能在同一標本上同時檢測2種不同定位的抗原，表明QDs-IHC 能精確檢測肺癌組織上的不同蛋白表達。

EMMPRIN最早從肺癌細胞系LX - 1中被分離出來，是一類屬于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，在人體內廣泛分布，具有多種不同的功能，而它在腫瘤的生長、浸潤和轉移中的作用是目前研究的熱點之一。EMMPRIN不僅參與細胞與細胞或細胞與基質的黏附，而且可通過腫瘤細胞周圍間質的成纖維細胞刺激合成MMPs，能夠降解ECM，促進腫瘤的浸潤與轉移[6]。本研究顯示，EMMPRIN蛋白在肺癌組織中的陽性表達率顯著高于對照組，表明在肺癌的惡性進展中，EMMPRIN起很重要作用。EMMPRIN蛋白的陽性率與肺癌患者的性別、年齡、不同組織學類型和病理分級之間無顯著相關，但與高TNM分期和伴有淋巴結轉移的肺癌均呈顯著正相關，表明EMMPRIN蛋白表達的升高有助于肺癌的侵襲轉移。Sienel等[3]研究150例肺原發(fā)腫瘤中發(fā)現(xiàn)，EMMPRIN定位于胞膜與肺腺癌生存期縮短相關，但Hakuma等[7]在208例外科切除的非小細胞肺癌組織中研究發(fā)現(xiàn)EMMPRIN表達的陽性率為92%，與低TNM分期和高分化腺癌相關，而與非小細胞肺癌的預后無關。

Figure 2. Co-expression of EMMPRIN and P53 proteins in the lung cancer analyzed by CRi multispectral imaging system (blue light excitation.red:EMMPRIN; green:P53.×400)A: positive signal of EMMPRIN and P53 proteins (RGB color);B: emission spectrum of 545 nm(green), 605 nm(red)quantum dots and background (black);C: red positive signal of EMMPRIN protein splited by spectrum;D: green positive signal of P53 protein splited by spectrum;E: autofluorescence signal of background;F: unmixed composite image of co-expression signal of EMMPRIN and P53 proteins generated by CRi imaging system.

圖2量子點免疫熒光雙標法檢測肺癌中EMMPRIN和P53蛋白的共表達

MMP-2是一種鋅離子依賴的蛋白水解酶，分子量為72 kD。MMP-2以酶原形式分泌，不具有酶活性，I型膜型MMP(membrance type 1 MMP, MT1-MMP)等可將其激活，被激活后的MMP-2能水解細胞基底膜及ECM 中的Ⅳ型、V型膠原和纖維連接蛋白成分，導致基底膜破壞，腫瘤細胞浸潤結締組織基質，侵入小血管和淋巴管而發(fā)生轉移。關于MMP-2與腫瘤侵襲、轉移的關系國內外作了大量的實驗研究，Guo等[8]研究認為MMP-2是一個與肺癌的進展、轉移和生存相關的敏感指標。本研究顯示，MMP-2蛋白在非癌變肺組織中幾乎不表達，而在成纖維細胞與內皮細胞中有表達，肺癌組織中MMP-2蛋白的陽性率與對照組相比差異顯著，表明MMP-2的表達與肺癌的發(fā)生有關。MMP-2蛋白的陽性率與高的TNM分期和伴有淋巴結轉移呈顯著正相關，而與其它的臨床病理參數(shù)均無關，以上這些均可提示MMP-2蛋白陽性表達與肺癌的侵襲轉移密切相關。然而在70例肺癌組織中，EMMPRIN 和MMP-2蛋白表達之間呈顯著正相關，提示彼此可能協(xié)同促進肺癌的侵襲轉移，與Leinonen等[9]的文獻報道一致。但Sienel等[3]研究并未發(fā)現(xiàn)肺癌中EMMPRIN與MMP-2蛋白表達之間顯著相關。

抑癌基因p53參與細胞增殖和分化的調控，其主要生物學功能是引起細胞周期阻滯，誘導細胞凋亡和促進細胞分化。但p53基因也是人類腫瘤最常見的突變或缺失基因，突變后喪失了正常p53基因的功能，而且自身獲得了癌基因的功能，將導致腫瘤的發(fā)生。由于野生型P53蛋白的半衰期短，用免疫組化方法不易檢出，而突變型P53蛋白抑癌功能喪失，致癌功能激活，半衰期大大延長，含量高出正常100-1 000倍，且能與一些癌蛋白形成穩(wěn)定的復合物，易于被免疫組化檢測到，且p53突變和P53蛋白在組織中的表達是一致的[10]。本研究采用QDs-IHC檢測肺癌組織中P53蛋白的陽性表達率顯著高于非癌變肺組織，提示P53與肺癌的發(fā)生密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)P53蛋白表達陽性率與TNM分期上升以及伴有淋巴結轉移均顯著相關，表明P53蛋白表達與肺癌TNM分期相關；p53突變的肺癌更容易發(fā)生淋巴結轉移。但本研究并未發(fā)現(xiàn)P53蛋白表達與其它臨床病理特征有關。另外文獻報道，p53突變還與非小細胞肺癌的復發(fā)顯著相關[11]。

關于EMMPRIN 與P53在肺癌組織中的研究國內外鮮見相關報道。本研究利用量子點免疫熒光雙標技術同時檢測肺癌組織中EMMPRIN 與P53蛋白的共表達，結果表明，在同一波長激發(fā)光下能清晰顯示這兩種蛋白在同一細胞內的定位，但少數(shù)區(qū)域兩種信號有所重疊，故本研究還采用美國劍橋NuanceTM多光譜成像分離技術，把兩種信號先采集再分開，最后模擬成像，效果很好，還能定量分析。本研究中發(fā)現(xiàn)EMMPRIN 與P53蛋白的共表達情況：EMMPRIN和P53蛋白共同陽性表達42例，共同陰性表達12例，二者呈顯著正相關(P<0.01,r=0.442)，表明在肺癌的進展中，EMMPRIN 與P53可能互相協(xié)同促進。

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ProteinexpressionofEMMPRIN,MMP-2andP53detectedbytechniqueofquantumdotsimmunofluorescenceinhumanlungcancer

PAN Qi1, CHEN Fu-chun1, WU Bai-qiang1, BAO Jun1, XUE Jie-hao1, CHEN Hong-lei2

(1DepartmentofThoracosurgery,TraditionalChineseMedicalHospitalofWenling,Wenling317500,China;2DepartmentofPathologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalScience,WuhanUniversity,Wuhan430071,China.E-mail:chenhongleiwh@126.com)

AIM: To investigate the expression of extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN/CD147), matrix metalloproteinase2 (MMP-2) and P53 proteins in human lung cancer tissues and to explore the relationship between EMMPRIN protein and malignant biological behaviour of lung cancer.METHODSFluorescent semiconductor nanocrystals [also known as quantum dots (QDs)] were applied, which were nanometer-sized light-emitting particles and were emerging as a new class of fluorescent probes for cancer detection due to the unique optical and electronic properties. The technique of QDs immunofluorescence histochemistry (QDs-IHC) was used to detect the protein expression of EMMPRIN, P53 and MMP-2 in the human lung cancer microarray, and co-expression of EMMPRIN/P53 proteins was also simultaneously detected by double-labeling immunofluorescence.RESULTSCompared with non-cancerous lung tissues, the positive rates of EMMPRIN, P53 and MMP-2 proteins in the lung cancer tissues were 70.00%, 77.14% and 72.86%, respectively, and the differences were all significant (P<0.05). The positive rates of EMMPRIN, P53 and MMP-2 proteins were all significantly related with tumor staging(TNM stage) and lymph node metastasis (P<0.05). The positive correlation between EMMPRIN expression and protein levels of MMP-2 and P53 was observed (P<0.01).CONCLUSIONThe protein expression of EMMPRIN, P53 and MMP-2 is correlated with the development of lung cancer. Malignant progression of lung cancer promoted by EMMPRIN may be closely related with the expression of MMP-2 and P53.

Lung neoplasmas; Extracellular matrix metalloproteinase inducer; Matrix metallopreteinase 2; Quantum dots

R734.2

A

1000-4718(2011)03-0488-06

2010-09-09

2010-11-30

國家自然科學基金資助項目(No.30900652) ；浙江省中醫(yī)藥普通課題研究計劃資助項目(No. 2008CB077)

△通訊作者 Tel：0576-86207747; E-mail:chenhongleiwh@126.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.013