復(fù)方丹參注射液抗脂多糖誘導(dǎo)的兔彌漫性血管內(nèi)凝血*

林 熙, 祈潔珍， 邱鵬新， 陳家樹△

(1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)藥理學(xué)系, 廣東 廣州 510632；2中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理教研室， 廣東 廣州 510080)

復(fù)方丹參注射液抗脂多糖誘導(dǎo)的兔彌漫性血管內(nèi)凝血*

林 熙1, 祈潔珍2， 邱鵬新2， 陳家樹2△

(1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)藥理學(xué)系, 廣東 廣州 510632；2中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理教研室， 廣東 廣州 510080)

目的研究復(fù)方丹參注射液對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的兔彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)的作用。方法用LPS誘導(dǎo)兔DIC模型。凝固法測定纖維蛋白原含量，全自動凝血分析儀檢測活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)和纖維蛋白原含量；全自動血細胞分析儀進行血小板計數(shù)；全自動血漿分析儀測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)以及血尿素氮(BUN)；發(fā)色底物法測定蛋白C及抗凝血酶Ⅲ的活性。觀察復(fù)方丹參注射液對LPS誘導(dǎo)的兔DIC的拮抗作用。結(jié)果兔耳緣靜脈持續(xù)滴注LPS，觀察到：APTT和PT顯著延長；血小板計數(shù)和纖維蛋白原含量明顯減少；ALT和BUN顯著升高；蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性明顯降低。給予復(fù)方丹參注射液后，APTT和PT的延長明顯縮短；血小板計數(shù)和纖維蛋白原的含量均明顯恢復(fù)；ALT和BUN顯著下降；蛋白C及抗凝血酶Ⅲ的活性顯著改善。結(jié)論復(fù)方丹參注射液對LPS誘導(dǎo)的兔DIC有良好的拮抗作用。

復(fù)方丹參注射液; 肝素; 脂多糖類; 纖維蛋白原; 血小板

彌漫性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)是一種由不同原因引起的，以全身性血管內(nèi)凝血系統(tǒng)激活為特征的獲得性綜合征。這種改變可致微血管系統(tǒng)的損害，引起全身彌漫性微血栓的產(chǎn)生，嚴重時可導(dǎo)致器官功能衰竭[1]。目前臨床上治療DIC的手段主要是抗凝治療-其代表藥物為肝素。但應(yīng)用肝素治療時，其副作用明顯，出血反應(yīng)較大，需要進行實驗室監(jiān)測。因而國內(nèi)外學(xué)者在治療DIC方面進行了大量的實驗研究，但仍未達到十分滿意的效果。

復(fù)方丹參注射液由丹參(Salviamiltiorrhiza)和降香(Dalbergiaodorifera)組成，具有活血化瘀、改善微循環(huán)和抗凝的作用，能有效預(yù)防血栓形成。丹參在大鼠頸動脈血栓模型中可顯著抑制血栓形成[2]；在實驗性大鼠腦梗塞模型中，可改善纖溶系統(tǒng)，抑制腦血栓形成[3,4]；在體外可抑制血小板聚集，抑制血小板釋放[5]。以上證據(jù)表明丹參對凝血系統(tǒng)有很強的抑制作用。同時在本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，復(fù)方丹參注射液可抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的腎微血栓[6]。以上結(jié)果強烈提示復(fù)方丹參注射液可能可以有效地對抗DIC。為進一步探討復(fù)方丹參注射液對DIC的拮抗作用，本課題組采用LPS誘導(dǎo)的DIC家兔模型，觀察復(fù)方丹參注射液對LPS誘導(dǎo)的兔DIC凝血、抗凝系統(tǒng)的影響以及對器官的保護作用，為臨床應(yīng)用復(fù)方丹參注射液預(yù)防DIC提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 健康雄性新西蘭家兔60只，體重2.0-2.5 kg，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，粵檢證字[SCXK(粵)2008-0002]。

1.2試劑及儀器設(shè)備 復(fù)方丹參注射液購于上海第九制藥廠，每毫升相當于丹參、降香各1 g。LPS購于Sigma，肝素購于中國醫(yī)藥工業(yè)有限公司，蛋白C、抗凝血酶Ⅲ活性檢測試劑盒購于上海太陽生物技術(shù)公司。Sysmex CA 1500+CA 6000 全自動凝血分析儀(KOBE)。 Sysmex SE-9500 全自動血細胞分析儀(KOBE)。HITACHI 7170全自動血漿分析儀(HITACHI)。

2方法

2.1動物模型的建立 參照Hermida等[7]用LPS誘導(dǎo)兔DIC的方法。3%戊巴比妥鈉按30 mg/kg從家兔耳緣靜脈注射麻醉,分離右側(cè)頸動脈、插管，以備取血。LPS溶于60 mL生理鹽水中，然后以100 μg·kg-1·h-1(10 mL/h)的速度從兔耳緣靜脈滴注，連續(xù)6 h給藥，建立穩(wěn)定的兔DIC模型。給藥后2 h、4 h給予戊巴比妥鈉腹腔注射，維持動物的持續(xù)麻醉狀態(tài)。

2.2動物分組 將實驗兔隨機分6組，每組10只：(1)正常對照組；(2)DIC模型組；(3)低劑量復(fù)方丹參注射液治療組；(4)中劑量復(fù)方丹參注射液治療組；(5)高劑量復(fù)方丹參注射液治療組；(6)肝素對照組。

2.3給藥方法

①正常對照組 從兔雙側(cè)耳緣靜脈以10 mL/h的速度滴注生理鹽水(既不注射LPS，也不注射復(fù)方丹參注射液和/或肝素)，連續(xù)6 h給藥。

②DIC模型組 從兔一側(cè)耳緣靜脈滴注100 μg·kg-1·h-1(10 mL/h)LPS的同時，從對側(cè)耳緣靜脈以10 mL/h的速度滴注生理鹽水，連續(xù)6 h給藥。

復(fù)方丹參注射液治療組：把復(fù)方丹參注射液溶于60 mL生理鹽水中，從兔一側(cè)耳緣靜脈滴注LPS的同時，從對側(cè)耳緣靜脈分別以0.1 mL·kg-1·h-1、0.2 mL·kg-1·h-1、0.4 mL·kg-1·h-1(10 mL/h)的速度滴注低、中、高劑量復(fù)方丹參注射液，連續(xù)6 h給藥。

肝素對照組：把肝素溶于60 mL生理鹽水中，從兔一側(cè)耳緣靜脈滴注LPS的同時，從對側(cè)耳緣靜脈以6×105IU·kg-1·h-1(10 mL/h)的速度滴注肝素，連續(xù)6 h給藥。

2.4觀察指標和樣品的收集 在注射LPS前和注射2 h、6 h后分別予以動脈取血1 mL，置于含有1/10體積的枸櫞酸鈉抗凝液的塑料管中，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，待測血漿-20 ℃保存。

用Sysmex CA 1500+CA 6000 全自動凝血分析儀檢測活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time, APTT)、凝血酶原時間(prothrombin time, PT)和纖維蛋白原含量；用HITACHI 7170全自動血漿分析儀測定血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶( alanine aminotransferase, ALT)以及血尿素氮(blood urine nitroge, BUN)；用發(fā)色底物法測定蛋白C及抗凝血酶Ⅲ的活性；另取1 mL血，用依地酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，用Sysmex SE-9500 全自動血細胞分析儀進行血小板計數(shù)。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1復(fù)方丹參注射液對LPS誘導(dǎo)的兔DIC凝血系統(tǒng)的影響

1.1APTT及PT的測定 DIC模型組注射LPS 2 h、6 h后，APTT明顯延長，分別為(22.53±7.06) s和(34.17±6.81)s，與正常對照組比較差異顯著(P<0.05)，見表1；同時PT也呈明顯增加，分別為(13.42±4.86)s和(20.83±5.21)s，與正常對照組比較差異顯著(P<0.05)，見表1。

復(fù)方丹參注射液治療組給藥2 h后，復(fù)方丹參注射液中、高劑量組APTT和PT延長,與DIC模型組比較有明顯下降(P<0.05)，見表1。給藥6 h后，復(fù)方丹參注射液各劑量組APTT和PT的延長與DIC模型組比較明顯下降，與肝素組抗凝作用相似(P<0.05)，見表1。

1.2血小板計數(shù)的測定 DIC模型組注射LPS 2 h、6 h后，血小板計數(shù)分別為(304.16±47.23)×109/L和(155.47±24.65)×109/L，與正常對照組比較呈進行性下降(P<0.05)，見表1。復(fù)方丹參注射液中、高劑量組給藥2 h后，血小板計數(shù)與DIC模型組比較有明顯的增加(P<0.05)，見表1；給藥6 h后，復(fù)方丹參注射液各劑量組的血小板計數(shù)有明顯降低，與DIC組比較有顯著差異(P<0.05)，與肝素組抗凝作用相似,見表1。

1.3纖維蛋白原含量的測定 DIC模型組注射LPS 6 h后，纖維蛋白原含量為(1.86±0.42)g/L，與正常對照組比較顯著下降(P<0.05),見表1。給藥6 h后，復(fù)方丹參注射液各劑量組的纖維蛋白原含量有明顯下降，與DIC對照組比較有顯著差異(P<0.05)，與肝素組抗凝作用相似，見表1。

2復(fù)方丹參注射液對LPS誘導(dǎo)的兔DIC抗凝系統(tǒng)的影響

DIC模型組注射LPS后，血漿蛋白C及抗凝血酶Ⅲ的活性分別為60.21±20.52、82.07±17.31(2 h)以及43.58±14.10、50.28±20.08(6 h)，與正常對照組比較均呈進行性下降(P<0.05)，見表1。復(fù)方丹參注射液中、高劑量組給藥2 h后，抗凝血酶Ⅲ的活性以及各劑量組蛋白C活性均明顯增高(與DIC模型組比較差異顯著，P<0.05)，見表1；給藥6 h后，復(fù)方丹參注射液各劑量組蛋白C及抗凝血酶Ⅲ的活性有明顯改善，與DIC對照組比較差異顯著(P<0.05)，與肝素組抗凝作用相似，見表1。

表1 復(fù)方丹參注射液對LPS誘導(dǎo)的兔DIC的凝血系統(tǒng)的作用

*P<0.05,**P<0.01vsLPS group.SM:CompoundSalviamilitorrhizainjection.

3復(fù)方丹參注射液對LPS誘導(dǎo)的兔DIC血漿ALT和BUN的影響

兔注射LPS 2 h、6 h后，血漿ALT和BUN水平均有明顯升高。復(fù)方丹參注射液中、高劑量組給藥2 h后，ALT明顯下降(P<0.05)，復(fù)方丹參注射液各劑量組給藥6 h后ALT亦顯著下降(P<0.01)，見圖1。 復(fù)方丹參注射液中、高劑量組給藥6 h后，BUN水平較DIC模型組有顯著下降(P<0.01)，見圖2。

討 論

LPS(內(nèi)毒素)是G-桿菌細胞壁上的主要成分，可直接導(dǎo)致凝血因子激活，組織因子釋放，引起凝血途徑激活，導(dǎo)致微血栓廣泛形成，從而誘導(dǎo)動物DIC的發(fā)生[8,9]。因此研究者常用LPS誘導(dǎo)、建立DIC動物模型。本課題組用連續(xù)靜脈滴注LPS誘導(dǎo)兔DIC的發(fā)生，結(jié)果顯示，給予LPS后，APTT和PT呈進行性延長，血小板計數(shù)和纖維蛋白原顯著降低；血漿蛋白C和抗凝血酶Ⅲ活性也呈明顯下降；而血漿ALT和BUN含量則顯著增加。這與國外文獻報道一致[7]，表明建立了穩(wěn)定的兔DIC模型。

本研究中，復(fù)方丹參注射液分別以0.1 mL·kg-1·h-1(低劑量)、0.2 mL·kg-1·h-1(中劑量)、0.4 mL·kg-1·h-1(高劑量)3個劑量滴注。隨復(fù)方丹參注射液劑量的增加，APTT和PT較DIC模型組有明顯縮短；血漿纖維蛋白原含量以及血小板計數(shù)較DIC模型組有明顯增加；同時血漿蛋白C和抗凝血酶Ⅲ活性也較DIC模型組有明顯改善；血漿BUN以及ALT含量較DIC模型組有明顯下降。以上結(jié)果表明復(fù)方丹參注射液能有效拮抗LPS誘導(dǎo)的兔DIC。

圖1復(fù)方丹參注射液對脂多糖誘導(dǎo)的兔DIC血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶的作用

圖2復(fù)方丹參注射液對脂多糖誘導(dǎo)的兔DIC血漿尿素氮的作用

DIC以全身凝血系統(tǒng)激活、抗凝系統(tǒng)抑制、纖維蛋白沉積、多器官微血栓形成以及多器官功能衰竭為特征。APTT和PT是內(nèi)源性凝血系統(tǒng)較為敏感、簡便和常用的篩選試驗。動物注射LPS 2 h、6 h后APTT和PT均顯著延長，提示LPS誘發(fā)DIC過程中凝血途徑被啟動；而我們給予復(fù)方丹參注射液后，APTT和PT較DIC模型組有明顯縮短，提示復(fù)方丹參注射液可抑制LPS誘導(dǎo)DIC過程中凝血途徑的激活。

血小板是凝血反應(yīng)的關(guān)鍵點，DIC時血小板數(shù)量的減少是由于凝血途徑的激活，促進凝血酶大量生成，導(dǎo)致了血小板聚集，從而使血小板減少。纖維蛋白原是凝血反應(yīng)的最終產(chǎn)物，也是血栓的主要成分。DIC時纖維蛋白原含量減少是由于血漿中纖維蛋白原在凝血酶作用下轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定性纖維蛋白(即微血栓)的結(jié)果。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，給予復(fù)方丹參注射液后，均可以在一定程度上阻止兔DIC誘導(dǎo)的血小板和纖維蛋白原進行性下降，同時本課題組前期研究結(jié)果亦顯示復(fù)方丹參注射液可抑制腎組織微血栓的形成，以上結(jié)果提示了復(fù)方丹參注射液可抑制凝血系統(tǒng)激活，并抑制器官微血栓形成。血管內(nèi)是否存在栓子與DIC多器官功能衰竭的發(fā)生有直接關(guān)系[10]，ALT和BUN是反映肝、腎功能的重要實驗室指標，本實驗中我們觀察到，復(fù)方丹參注射液各組血漿中BUN以及ALT明顯下降，甚至高劑量復(fù)方丹參注射液給藥6 h后，血漿ALT含量恢復(fù)到正常水平，這很可能與復(fù)方丹參注射液抑制微血栓形成，從而使重要臟器供血得以恢復(fù)或改善，臟器功能也隨之改善有關(guān)。

本研究中復(fù)方丹參注射液的這些效應(yīng)與其抗凝作用有密切關(guān)系。因此我們進一步測定了血漿蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性。蛋白C和抗凝血酶Ⅲ是參與抗凝機制的重要的兩個抗凝調(diào)節(jié)蛋白。DIC時，血漿蛋白C和抗凝血酶Ⅲ呈顯著下降，這是由于凝血系統(tǒng)的激活，引起凝血酶大量激活，抑制了蛋白C和抗凝血酶Ⅲ活性；臨床上，DIC患者的蛋白C和抗凝血酶Ⅲ活性明顯下降，常?？蓪?dǎo)致患者死亡。本研究中，給予LPS后，實驗動物的血漿蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性顯著降低，而給予復(fù)方丹參注射液后，可明顯恢復(fù)兩者的活性，甚至隨著復(fù)方丹參注射液劑量的增加，血漿蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性可恢復(fù)至正常水平。提示復(fù)方丹參注射液可通過阻止兩者活性的下降，改善抗凝系統(tǒng)，從而達到拮抗DIC的目的。

綜上所述，復(fù)方丹參注射液可明顯防止內(nèi)毒素血癥時的DIC，表現(xiàn)在，與DIC模型組比較，用復(fù)方丹參注射液治療的實驗兔的APTT和PT明顯縮短；血小板數(shù)量和纖維蛋白原增加；血漿ALT和BUN的水平明顯下降；蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性明顯改善。這種作用可能是復(fù)方丹參注射液抑制凝血系統(tǒng)激活、改善抗凝系統(tǒng)、阻止微血栓形成、促進重要臟器的血供以及恢復(fù)臟器功能的結(jié)果。本研究提示復(fù)方丹參注射液在DIC的治療中有良好的應(yīng)用前景。

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EffectofcompoundSalviamilitorrhizainjectiononLPS-induceddisseminatedintravascularcoagulationinrabbits

LIN Xi1, QI Jie-zhen2, QIU Peng-xin2, CHEN Jia-shu2

(1DepartmentofPharmacology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofPharmacology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:jiashu_sysu@hotmail.com)

AIM: To evaluate the effect of compoundSalviamilitorrhiza(SM) injection on lipopolysaccharide (LPS)-induced experimental disseminated intravascular coagulation (DIC) in rabbits.METHODSThe LPS-induced DIC model in rabbits was performed by continuous infusion of LPS at 100 μg·kg-1·h-1for 6 h. Treatment with compound SM injection or heparin was begun simultaneously with LPS infusion through the contralateral marginal ear vein.Activated partial thromboplastin time (APTT), prothrombin time (PT), platelet count and fibrinogen concentration were determined. The plasma levels of alanine aminotransferase (ALT) and blood urine nitrogen (BUN) were detected. The activity of protein C and antithrombi III (ATIII) was also measured.RESULTSContinuous infusion of LPS induced gradual impairment of hemostatic parameters and damages in renal and liver functions. The intravenous administration of compound SM injection attenuated the increase in plasma levels of APTT and PT, and the decrease in plasma levels of fibrinogen and platelet induced by LPS infusion. Compound SM injection decreased the levels of ALT and BUN, reduced the damages in the liver and kidney, and also significantly inhibited the decreased plasma levels of protein C and ATIII in LPS- treated animals.CONCLUSIONCompound SM injection has a protective effect against DIC in rabbits.

CompoundSalviamiltiorrhizainjection; Heparin; Lipopolysaccharides; Fibrinogen; Blood platelets

R543.7

A

1000-4718(2011)03-0464-05

2010-10-09

2010-12-31

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81000209)；教育部科學(xué)技術(shù)研究重點資助項目(No. 210255)；暨南大學(xué)科研培育與創(chuàng)新基金資助項目(No. 21609304)

△通訊作者 Tel:020-87330553；E-mail: jiashu_sysu@hotmail.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.009