槲皮素抑制內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞T型鈣通道的表達(dá)*

周 曉, 商戰(zhàn)平， 司艷紅, 李衛(wèi)紅, 于鳳秀, 王家富

(1 泰山醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 山東 泰安 271000; 2 山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理教研室， 山東 臨沂 276002)

槲皮素抑制內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞T型鈣通道的表達(dá)*

周 曉2, 商戰(zhàn)平1△， 司艷紅1, 李衛(wèi)紅1, 于鳳秀1, 王家富1

(1泰山醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 山東 泰安 271000;2山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病理教研室， 山東 臨沂 276002)

目的通過(guò)觀察原代培養(yǎng)的人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在內(nèi)皮素(ET-1)作用下對(duì)T型鈣通道(TCC)的影響，進(jìn)一步探討槲皮素(Que)對(duì)心血管的保護(hù)作用。方法原代培養(yǎng)人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，經(jīng)鑒定于2-3代用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞隨機(jī)分成對(duì)照組、Que組、模型組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組：不加入任何藥物；Que組：加入Que 80 μmol/L培養(yǎng)24 h模型組：加入100 nmol/L ET-1培養(yǎng)24 h；實(shí)驗(yàn)組：加入Que培養(yǎng)1 h后，再加入100 nmol/L ET-1共同培養(yǎng)24 h，其中Que的濃度為20、40、80 μmol/L。采用RT-PCR和Western blotting檢測(cè)TCC的主要亞基α1G在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，檢測(cè)TCC電流(ICaT)。結(jié)果模型組α1GmRNA和蛋白的表達(dá)均強(qiáng)于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，模型組ICaT密度明顯大于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(P<0.01)，而對(duì)照組和Que組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)明顯差別(P>0.05)。結(jié)論ET-1誘導(dǎo)人血管平滑肌細(xì)胞中TCC的表達(dá)和ICaT的增強(qiáng)，Que能抑制這種增強(qiáng)效應(yīng)。這可能是Que發(fā)揮保護(hù)心血管功能的機(jī)制之一。

槲皮素； 鈣通道,T型； 血管平滑肌細(xì)胞; 內(nèi)皮縮血管肽1

槲皮素(quercetin,Que)為天然蜂膠中類黃酮的一種，具有防治心血管疾病的功能。內(nèi)皮素-1 (endothelin-1,ET-1)是一種內(nèi)源性血管活性肽，屬于促有絲分裂原性激素。T型鈣通道(T-type calcium channels，TCC)屬于電壓依賴型鈣通道(voltage- dependent calcium channel，VDCC)之一，具有低電壓激活的特性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，三者都和血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs) 的增殖活化有關(guān)[1-3]，但Que 、ET-1、TCC之間有無(wú)內(nèi)在聯(lián)系則缺乏相關(guān)研究，本文探討了ET-1和Que是否通過(guò)TCC發(fā)揮對(duì)心血管損傷或保護(hù)的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1研究對(duì)象 人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞( human umbilical artery smooth muscle cells,HUASMCs)。

1.2主要試劑 ET-1和胰蛋白酶購(gòu)于 Sigma；Que購(gòu)于上海君創(chuàng)生物科技有限公司；DMEM/F12 培養(yǎng)液購(gòu)于Hyclone；胎牛血清(超級(jí)型)購(gòu)于杭州四季青生物工程材料研究所；青霉素和鏈霉素購(gòu)于山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；anti-α1G(α1G是TCC的主要亞基)和anti-actin 多克隆抗體(兔抗人)購(gòu)于Santa Cruz；α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)單克隆抗體(鼠抗人)、Triton X-100和過(guò)氧化物酶標(biāo)記的α1GⅡ抗(羊抗兔) 購(gòu)于武漢博士德公司；總RNA抽提Trizol reagment購(gòu)于 Invitrogen；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于 Promega；Taq DNA聚合酶等PCR反應(yīng)系統(tǒng)購(gòu)于TaKaRa；ECL solution購(gòu)于北京中山生物技術(shù)有限公司；BSA購(gòu)于Roche；配膠試劑均購(gòu)自Bio-Rad公司；細(xì)胞裂解液購(gòu)于碧云天公司。

2方法

2.1HUASMCs原代、傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)(組織貼塊法)根據(jù)Chamley-Campbell[4]的方法加以改進(jìn)。取離體 3 h之內(nèi)的新鮮臍帶，分離臍動(dòng)脈，縱行剪開血管，D-Hanks 緩沖液沖洗血管內(nèi)壁數(shù)次，無(wú)菌刀片刮除內(nèi)膜，撕下中膜平滑肌層，放入盛有DMEM/F12 培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，剪成 0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm-1 mm×1 mm×1 mm的小塊，玻璃分針以3-5塊/cm2的密度均勻種植于瓶底，慢慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使貼有植塊的瓶底朝上，少量培養(yǎng)液在下面，并追加培養(yǎng)液至每瓶1.0-1.5 mL，放入 37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱內(nèi)干涸4 h后，將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，使植塊剛好浸入培養(yǎng)液中。傳代培養(yǎng)：用 0.25%胰酶消化液，根據(jù)細(xì)胞密度按 1∶2 或 1∶3 傳代。原代培養(yǎng)用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，傳代以后血清濃度逐漸降低到10%，2-3代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2分組 培養(yǎng)的HUASMCs胰酶消化脫壁后，充分混合，隨機(jī)分為3組。ET-1和Que的濃度分別參照綦惠等[5]和陳維等[6]的研究，藥物與細(xì)胞作用24 h。(1)對(duì)照組：不加入任何藥物；(2)Que組：加入Que 80 μmol/L；(3)模型組：加入100 nmol/L ET-1培養(yǎng)24 h；(4)實(shí)驗(yàn)組：加入Que 20、40和 80 μmol/L培養(yǎng)1 h，再加入100 nmol/L ET-1共同培養(yǎng)24 h。各組細(xì)胞培養(yǎng)基的血清濃度均為5%。

2.3免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 常規(guī)方法傳代，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108cells/L接種于 6 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)板中預(yù)先放入高壓滅菌處理的蓋玻片，待細(xì)胞長(zhǎng)至 50%-70%融合后，將蓋玻片從培養(yǎng)板中取出，室溫下用PBS緩沖液沖洗 3 次,每次 5 min,冷丙酮溶液中固定 5 min，蒸餾水沖洗 3 次，每次 3 min，后續(xù)步驟按邁新公司 SP 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，Ⅰ抗用α-SMA單克隆抗體。

2.4RT-PCR 用Trizol裂解細(xì)胞，按照Trizol reagment說(shuō)明書提取總RNA，GeneQuant Pro紫外分光光度儀測(cè)A260/A280值，檢測(cè)核酸純度、計(jì)算核酸量。各樣本均取2 μg總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA。用于PCR的引物分別是:α1G上游引物5’-ACCTTACTACTCCGACTACTCC-3’, 下游引物5’-ACAGCCATCTTCAGCAGC-3’；GAPDH上游引物5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’， 下游引物5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。PCR的反應(yīng)體系按照Taq DNA聚合酶(TaKaRa)說(shuō)明書，反應(yīng)條件：α1G：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。GAPDH：94 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 4 min。GEL DOC 2000凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)PCR產(chǎn)物的灰度值，各組數(shù)據(jù)以α1G/GAPDH作為mRNA表達(dá)的相對(duì)量。

2.5Western blotting樣品的制備 蛋白裂解液裂解細(xì)胞，離心后取上清，測(cè)定蛋白濃度，加入buffer后煮沸變性，低溫保存。 配制濃縮膠和10%的分離膠。SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳：每孔上樣量50 μg，濃縮膠 80 V、20 min，分離膠120 V，約75 min，電泳至溴酚藍(lán)跑到凝膠底部。電泳后膠用轉(zhuǎn)膜緩沖液平恒15 min。轉(zhuǎn)膜和顯影：以PVDF膜、濾紙和分離膠制備“夾心餅”，放入濕電轉(zhuǎn)膜儀，100 mV 80 min。根據(jù)marker分子量找到目的條帶(α1G：260 kD；β-actin： 46 kD)，依次加入Ⅰ抗、Ⅱ抗，在曝光暗盒中加入ECL solution，X 光片曝光 5-10 min，顯影液中顯影1 min，定影液中定影1 min, 自來(lái)水沖洗，晾干。各組數(shù)據(jù)以α1G/β-actin作為蛋白表達(dá)的相對(duì)量。

2.6細(xì)胞電生理 在室溫(20-25 ℃)下，用EPC-10(Heka)膜片鉗放大器進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄。實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置、數(shù)據(jù)采集和刺激方案施加均通過(guò)采樣軟件Pulse 8.8(Heka)來(lái)控制。玻璃微電極充灌電極內(nèi)液后，電極阻抗為4-6 ΜΩ；形成全細(xì)胞模式后，封接電阻≥500 ΜΩ，串聯(lián)電阻≤20 ΜΩ并補(bǔ)償70%-80%進(jìn)行電流記錄。用Pulsefit (Heka)、Clampfit 10.0(Axon Instrument)及Origin 7.0(Microcal Software)分析繪圖。在全細(xì)胞電壓鉗模式下，以硝苯地平(1 μmol/L)阻斷L型鈣通道，鉗制電位-90 mV，給予一個(gè)-40 mV時(shí)程400 ms的單刺激，用LockIn程序計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞的膜電容，該電容數(shù)值代表細(xì)胞表面積，測(cè)量出-40 mV下的全細(xì)胞電流峰值(pA)，將該電流峰值除以細(xì)胞的膜電容(pF)，得到細(xì)胞的電流密度(pA/pF)，取各組的最大電流密度值作統(tǒng)計(jì)分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1平滑肌細(xì)胞的鑒定

在倒置相差顯微鏡下觀察，HUASMCs呈梭形或多邊形，核呈橢圓形或桿狀，胞漿均質(zhì)，有時(shí)可見(jiàn)核仁，細(xì)胞可重疊生長(zhǎng)達(dá)多層，高低起伏，呈典型的“峰-谷” 樣生長(zhǎng)。經(jīng)平滑肌細(xì)胞特異性α- SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色，陽(yáng)性細(xì)胞胞漿中有棕黃色顆粒，陽(yáng)性率約為 95%，見(jiàn)圖1、2。

Figure 1. Primary culture of HUASMCs(×100). Spindle-shaped or polygonal HUASMCs became confluent, showing typical “peak-valley”-like growth.

圖1原代培養(yǎng)的HUASMCs呈“峰-谷”樣生長(zhǎng)

Figure 2. Immunocytochemical staining for α-SMC-actin in primary HUASMCs(×200). Expression of α-SMA(bfrown-yellow granules) was seen in the cytoplasm in about 95% cells.

圖2HUASMCsα-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果

2RT-PCR結(jié)果

各組RT-PCR的DNA電泳條帶以溴化乙啶染色，在凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)其灰度值，以α1G/ GAPDH作為各組α1GmRNA相對(duì)表達(dá)量，見(jiàn)圖3?？梢钥闯?，模型組α1GmRNA表達(dá)最強(qiáng)；實(shí)驗(yàn)組(Que 20、40、80 μmol/L)次之，且呈劑量依賴性降低；對(duì)照組和Que組最小。除對(duì)照組和Que組無(wú)顯著差異(P>0.05)外，其余各組差異顯著(P<0.05)。模型組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的α1GmRNA表達(dá)量不同，且依次遞減，提示ET-1可使HUASMCs中α1GmRNA的表達(dá)增高，Que則對(duì)這種增高有劑量依賴性的抑制作用。

圖3HUASMCsα1GmRNA表達(dá)

3Westernblotting結(jié)果

用Quantity One軟件分析曝光后的各組底片條帶，檢測(cè)其灰度值，以α1G/ β-actin作為各組α1G蛋白的相對(duì)表達(dá)量。從圖4可以看出，模型組的α1G蛋白表達(dá)最大，實(shí)驗(yàn)組次之，且呈劑量依賴性降低，對(duì)照組和Que組最小。除對(duì)照組和Que組無(wú)顯著差異(P>0.05)外，其余各組差異顯著(P<0.05)，提示ET-1可使HUASMCs中α1G蛋白的表達(dá)增高，Que則對(duì)這種增高有劑量依賴性的抑制作用。

圖4HUASMCsα1G蛋白表達(dá)

4電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果

記錄鉗制電位-90 mV下-40 mV、400 ms單刺激的電流，經(jīng)計(jì)算得到各組的電流密度值，見(jiàn)圖5。除對(duì)照組和Que組無(wú)顯著差異(P>0.05)外，其余各組差異顯著(P<0.05)。提示ET-1可增強(qiáng)HUASMCs中TCC的最大電流密度，Que則對(duì)這種增強(qiáng)有抑制作用。

討 論

成人VSMCs增殖率非常低，但在病理狀態(tài)下，VSMCs可以活化增殖，向內(nèi)膜遷移并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致血管壁重構(gòu)。在這一過(guò)程中，VSMCs的基因表型發(fā)生了明顯變化，TCC表達(dá)增強(qiáng)就是其中之一。Kuga等[2]很早就發(fā)現(xiàn)在大鼠VSMCs中，TCC的表達(dá)與細(xì)胞周期有關(guān)，G0期能探測(cè)到TCC電流(ICaT)的VSMCs比例為0，而在G1期和S期這一比例上升到37%和90%。Rodman等[7]的研究則發(fā)現(xiàn)，在人肺動(dòng)脈VSMCs中，構(gòu)成TCC的是CaV3.1，應(yīng)用針對(duì)CaV3.1的siRNA明顯抑制TCC表達(dá)和細(xì)胞增殖，TCC阻滯劑也把VSMCs阻止在G0/G1期，同樣抑制了細(xì)胞的增殖。

圖5全細(xì)胞T型鈣通道電流記錄

根據(jù)以上的觀察，TCC的表達(dá)可能是VSMCs活化的必要條件，促進(jìn)VSMCs轉(zhuǎn)化的一些內(nèi)源性因素，如ET-1，必然要影響TCC的表達(dá)。Izumi等[8]對(duì)心肌的研究與這一假設(shè)類似，他們發(fā)現(xiàn)大鼠心肌由肥大到衰竭的過(guò)程中，內(nèi)源性ET-1和心肌細(xì)胞α1GmRNA及蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，而且長(zhǎng)期使用ET-1受體阻滯劑可以抑制ICaT和α1GmRNA的表達(dá)，從而減輕心肌衰竭的程度。ET-1是一種內(nèi)源性激素，過(guò)高的ET-1被認(rèn)為是心血管疾病最強(qiáng)的獨(dú)立的預(yù)警信號(hào)[9]。

本實(shí)驗(yàn)以ET-1作用于原代培養(yǎng)的人臍動(dòng)脈VSMCs，觀察了ICaT的強(qiáng)弱和α1G的表達(dá)。結(jié)果顯示，ET-1促進(jìn)了α1G在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，增強(qiáng)了ICaT，和上述的設(shè)想一致。ET-1很可能首先增強(qiáng)ICaT進(jìn)而促進(jìn)了VSMCs活化。ICaT的增強(qiáng)與構(gòu)成TCC的各亞基都有關(guān)系，而且可以發(fā)生在各亞基的磷酸化、翻譯、轉(zhuǎn)錄等各個(gè)水平，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果僅提示ET-1可能通過(guò)在mRNA和蛋白水平增強(qiáng)了α1G的表達(dá)，進(jìn)而使ICaT增強(qiáng)。至于ET-1是促進(jìn)了α1G基因的轉(zhuǎn)錄還是增加了mRNA的穩(wěn)定性，以及α1G蛋白的磷酸化是否增加，則有待進(jìn)一步研究。目前關(guān)于ET-1影響TCC的研究結(jié)果也有矛盾之處，比如，F(xiàn)erron等[10]對(duì)心肌細(xì)胞的研究顯示ET-1增強(qiáng)ICaT的原因在于翻譯后的調(diào)節(jié)，對(duì)mRNA沒(méi)有影響。這提示ET-1調(diào)節(jié)ICaT的方式在不同細(xì)胞可能有所不同。

有報(bào)道Que拮抗LPS所致的肝細(xì)胞損傷[11],并通過(guò)多種機(jī)制拮抗ET-1誘導(dǎo)的VSMCs肥大、增殖、遷移和分泌，其中包括抑制ET-1誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物升高、PKC的激活等[12]。既然ICaT的增強(qiáng)是VSMCs活化的必要條件， ET-1導(dǎo)致了這種增強(qiáng)，那么抑制ICaT可能是Que拮抗ET-1的機(jī)制之一。以往研究中涉及Que對(duì)細(xì)胞鈣電流和鈣通道蛋白影響的不多，而且多局限于L型鈣通道，Que對(duì)TCC及ICaT的影響則少有研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于ET-1誘導(dǎo)的HUASMCs中ICaT和α1G(mRNA和蛋白水平)表達(dá)的增強(qiáng)，Que均具有抑制作用。Que可能通過(guò)降低α1G基因的轉(zhuǎn)錄、減少下游蛋白質(zhì)產(chǎn)物抑制了ET-1誘導(dǎo)的ICaT增強(qiáng)，這或許是Que拮抗ET-1促VSMCs活化的機(jī)制之一。

從以往的研究了解到，ET-1通過(guò)激活MAPK中的ERK1/2提高TCC和ICaT的表達(dá)[13]，Que也可以通過(guò)抑制MAPK的磷酸化降低一些刺激因子導(dǎo)致的細(xì)胞增殖[14]，因此，Que有可能通過(guò)MAPK途徑抑制ET-1導(dǎo)致的TCC表達(dá)和ICaT增強(qiáng)。MAPK作為多種細(xì)胞信號(hào)通道的中心環(huán)節(jié)，可以被多種信號(hào)激活，所以Que也可能在其它環(huán)節(jié)上實(shí)現(xiàn)對(duì)ICaT的抑制。ET-1作用于7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，Que則缺乏具體的受體途徑，但 ET-1和Que對(duì)各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子均有廣泛影響，涉及到蛋白質(zhì)、脂類、細(xì)胞內(nèi)鈣和活性氧等[15,16]，因此要明確Que抑制ET-1誘導(dǎo)ICaT增強(qiáng)的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

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Quercetininhibitsendothelin-1-inducedT-typeCa2+channelexpressioninhumanumbilicalarterialsmoothmusclecells

ZHOU Xiao2, SHANG Zhan-ping1, SI Yan-hong1, LI Wei-hong1, YU Feng-xiu1, WANG Jia-fu1

(1DepartmentofPathophysiology,TaishanMedicalCollege,Taian271000,China;2DepartmentofPathology,ShandongMedicalCollege,Linyi276002,China.E-mail:zhpshang@tsmc.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of quercetin on endothelin-1-induced T-type calcium channel(TCC) expression in primary cultured human umbilical arterial smooth muscle cells for exploring the protective role of quercetin in cardiovascular system.METHODSHuman umbilical arterial smooth muscle cells were verified by immunocytochemistry. The cells in 2-3 passages were used and randomly divided into control group, quercetin alone group, model group and experimental group. The cells in control group were cultured without any drugs for 24 h. The cells in quercetin alone group were cultured with 80 μmol/L quercetin for 24 h. The cells in model group were cultured with ET-1 at the concentration of 100 nmol/L for 24 h. The cells in experimental groups were pretreated with quercetin for 1 h, then coincubated with 100 nmol/L ET-1 for 24 h. The concentrations of quercetin used in this study were 20, 40and 80 μmol/L, respectively. The expression of α1G, a TCC major subunit, was assayed at mRNA and protein levels by RT-PCR and Western blotting, respectively. The TCC currents(IcaT) were detected by the technique of whole-cell patch-clamp.RESULTSCompared with control and experimental group,ICaTdensity (P<0.01) and the expression of α1Gat mRNA (P<0.05) and protein (P<0.01) levels in model group were significantly increased. No significant difference in the results of quercetin alone group and control group was observed.CONCLUSIONThe protective roles of quercetin in cardiovascular functions are related to the depressive effects of quercetin on ET-1-induced increase in bothICaTdensity and the expression of α1Gat mRNA and protein levels in cultured human vascular smooth muscle cells.

Quercetin; Calcium channels, T-type; Vascular smooth muscle cells; Endothelin-1

R363

A

1000-4718(2011)03-0450-05

2010-06-23

2011-01-20

泰山醫(yī)學(xué)院基金資助項(xiàng)目(No.2001086)

△通訊作者 Tel: 0538-6225010; E-mail:zhpshang@tsmc.edu.cn

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.006