青頂擬多孔菌對單一和復(fù)合多環(huán)芳烴的降解特性

杜麗娜,高大文,2*(.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院環(huán)境科學(xué)專業(yè),黑龍江 哈爾濱 50040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 50090)

青頂擬多孔菌對單一和復(fù)合多環(huán)芳烴的降解特性

杜麗娜1,高大文1,2*(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院環(huán)境科學(xué)專業(yè),黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150090)

利用中國東北林區(qū)普遍存在白腐菌——青頂擬多孔菌,降解單一和復(fù)合多環(huán)芳烴,分別測定了菲、蒽、芘于11,22,33d的累積降解率.結(jié)果顯示,對于單一多環(huán)芳烴,該菌種降解能力由強(qiáng)到弱依次為菲＞蒽＞芘,33d累積降解率依次為96.56%、94.76%和57.53%;對復(fù)合多環(huán)芳烴降解中,菲和芘的累積降解率分別為99.46%和61.09%.在復(fù)合多環(huán)芳烴的降解研究中發(fā)現(xiàn),少量蒽的加入,刺激了菌種對菲和芘的降解,使菲和芘的降解率分別提高了2.9%和3.56%.由此提示,在研究降解高環(huán)、難降解多環(huán)芳烴時,可利用低環(huán)多環(huán)芳烴對菌種的刺激作用,在體系內(nèi)形成高、低環(huán)多環(huán)芳烴的共代謝,以達(dá)到更加高效降解多環(huán)芳烴的目的.

青頂擬多孔菌；單一多環(huán)芳烴；復(fù)合多環(huán)芳烴；降解；共代謝

多環(huán)芳烴(PAHs)廣泛存在于土壤、水體和大氣中,具有致畸、致癌、致突變的作用.1979年,美國國家環(huán)境保護(hù)局(EPA)將16種PAHs定為優(yōu)先檢測污染物.中國政府也將7種PAHs列入“中國環(huán)境優(yōu)先污染物黑名單”[1-3].

PAHs的治理方法有物理方法、化學(xué)方法[4-6]和生物修復(fù)[7-9]等.其中,微生物修復(fù)具有低成本、高效益、無二次污染的特點(diǎn),且作用潛力巨大.白腐真菌(White rot fungi)是一類能引起木質(zhì)白色腐爛的絲狀真菌的總稱,該菌種類繁多,可利用自身分泌的木質(zhì)素降解酶系及獨(dú)特的作用方式,對許多難降解有機(jī)物進(jìn)行降解,如工業(yè)廢水[10]、農(nóng)藥[11]和一些環(huán)境持久性有機(jī)污染物[12-13].本研究采用東北林區(qū)普遍存在的白腐菌——青頂擬多孔菌,考察了該菌對單一和復(fù)合 PAHs的降解情況,探討不同形式 PAHs的降解機(jī)理,并且在此基礎(chǔ)上初步探索菌種對 PAHs的共代謝情況,為治理PAHs提供新思路.

1 材料與方法

1.1 供試菌種

菌種選用東北林區(qū)特有的白腐真菌——青頂擬多孔菌(Polyporellus picipes),購自中國科學(xué)院微生物研究所.

1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基:稱取去皮馬鈴薯 200g,切成小塊,加適量(完全浸沒馬鈴薯)蒸餾水,煮 20～30min,用 9層紗布過濾出馬鈴薯浸出液,加入葡萄糖20g, K2HPO4·3H2O 3.0g, MgSO4·7H2O 1.5g,瓊脂20g,蒸餾水定容至1L.

液體培養(yǎng)基:稱取麩皮35g,加適量(完全浸沒麩皮)蒸餾水,煮 20～30min,用 9層紗布過濾出麩皮浸出液,加入蛋白胨4g, K2HPO4·3H2O 1g, KCl 0.5g, MgSO4·7H2O 0.5g, FeSO4·7H2O 0.01g,采用HAc/NaAc緩沖液調(diào)節(jié)pH4.0.

1.3 主要試劑與儀器

蒽(Ant,純度 90%)、菲(Phe,97%)、芘(Pyr,純度＞98%),環(huán)己烷和丙酮均為分析純.稱取一定量蒽、菲、芘溶于丙酮,配制成500mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液,工作液采用逐級稀釋的方法配制.

安捷倫 6890N型氣相色譜儀(美國 Agilent公司)、SPX-150B型生化恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、752型紫外-可見光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)、H1650高速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、MSX-280型手提式壓力蒸汽消毒器(北京市永光日月醫(yī)療儀器廠)、202-OAB型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)等.

1.4 菌種的活化培養(yǎng)

將青頂擬多孔菌從斜面上接種于含固體培養(yǎng)基的平板上,28℃靜置培養(yǎng),至菌絲布滿平板.

1.5 PAHs的降解

向 150mL三角瓶中分別加入不同濃度的蒽、菲、芘的丙酮溶液,放置通風(fēng)櫥中過夜,待丙酮揮發(fā)完畢后取出,各加入50mL液體培養(yǎng)基,分別配制成 30mg/L蒽、菲、芘 3組單一溶液和5mg/L蒽+30mg/L菲、5mg/L蒽+30mg/L芘兩組復(fù)合溶液.滅菌后,每個樣品分別接種3片直徑為10mm的菌片,每組樣品做9個平行,另設(shè)置不加菌空白樣品.在28℃、160r/min條件下培養(yǎng)33d,每組樣每隔11d取3個平行樣測定降解率.

1.6 PAHs的提取

液相采用環(huán)已烷萃取,量取與待萃取的菌液等體積的環(huán)己烷于分液漏斗中,劇烈振蕩,靜置,待溶液分層后,將上層有機(jī)相倒入蒸餾瓶,下層水相倒入另一分液漏斗中,重復(fù)操作2次后,棄去水相.為將 PAHs提取完全,對三角瓶里的菌片同時進(jìn)行提取,即向裝有剩余菌片的三角瓶內(nèi)加入20mL體積比為 1:1的環(huán)已烷和丙酮混合液,超聲提取20min,重復(fù)操作2次后,棄去菌片.將每次液相與菌片萃取獲得上層有機(jī)相合并入蒸餾瓶,在 45℃下,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),濃縮至 1.5mL左右,收集于氣相色譜小瓶,待測.

1.7 PAHs的測定

采用氣相色譜法[14].測定條件:進(jìn)樣量 1μL,氣化室溫度 260℃,分流比 50:1.分離柱:Agilent 19091J-413HP-5 5% Phenyl Methyl Siloxane(30.0m×320μm×0.25μm).程序升溫:初溫 200℃,中溫260℃,升溫速率5/min℃,于260℃,保留3min.檢測器:FID檢測器,溫度280℃.

1.8 漆酶活力的測定

將菌種接入液體培養(yǎng)基,定期移取1mL培養(yǎng)液于離心管中,9000r/min離心10min,上清液即為粗酶液.

定義每 1min轉(zhuǎn)化 1μmol2,2-連氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)所需的酶量為 1個活力單位.反應(yīng)體系為:0.2mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH5.0), 5mmol/LABTS溶液以及一定量酶液,用分光光度計(jì)檢測在波長420nm處0～3min內(nèi)吸光度值的變化[15].

1.9 生物量的測定

生物量的測定采用菌體干重法[16].取已烘至恒重的定量濾紙1張,在天平上稱重(a),取整瓶培養(yǎng)菌液過濾,收集菌片,105℃烘至恒重(b),扣除菌片瓊脂的干重(c).菌絲的干重＝b-a-c

2 結(jié)果與討論

2.1 青頂擬多孔菌對單一PAHs的降解

由于不同PAHs結(jié)構(gòu)和毒性不同,使得菌種對其降解的難易程度不同.在28℃、160r/min條件下,檢測青頂擬多孔菌對蒽、菲、芘 3組單一液體培養(yǎng)基的11,22,33d降解情況,結(jié)果如圖1所示.對比 PAHs的降解率,青頂擬多孔菌對菲的降解作用最強(qiáng),其次是蒽,最后是毒性較強(qiáng)的芘,33d對PAHs的降解率分別為蒽94.76%、菲96.56%、芘57.53%.該菌對PAHs的降解能力與文獻(xiàn)報(bào)道的 Pleurotus ostreatus[17]和 Bjerkandera sp.BOS55[18]等菌種的降解能力相近,處于較優(yōu)水平.

圖1 單一蒽、菲、芘降解率比較Fig.1 The comparison of degradation rate of anthracene,phenanthrene and pyrene

2.2 蒽、菲、芘的降解特性

對比等濃度蒽、菲、芘的降解情況,可以看出,該菌對其降解的從易到難順序?yàn)?菲、蒽、芘.此結(jié)果與聶麥茜[19]研究的一種短桿菌一致.菲和蒽為三環(huán) PAHs,而芘為四環(huán) PAHs,一般來講,低環(huán)PAHs中,苯環(huán)個數(shù)多的毒性較大[20],不易被菌種利用.所以芘的毒性要高于菲和蒽,較難降解.但也有研究結(jié)果顯示[21],在一定條件下,3種PAHs的降解難易度為菲＞芘＞蒽.

在培養(yǎng)的不同階段,微生物對作用底物的降解能力不同.對一種PAHs而言,比較3個階段的降解率的累積增幅,即凈累積降解率,可以看出培養(yǎng)中期(11～22d)最大,蒽48.05%、菲52.74%、芘33.26%;其次是培養(yǎng)初期(0～11d),蒽 30.53%、菲31.26%、芘17.17%;增幅最小的是培養(yǎng)的最后階段(22～33d),蒽 16.18%、菲 12.56%、芘 7.20%.雖然該菌種對不同 PAHs的降解率大小不同,但是對3種PAHs在3個階段中的作用趨勢相同,此結(jié)果與菌體分泌漆酶和生長趨勢有關(guān),測定31d在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌體產(chǎn)漆酶酶活和生物量,如圖2所示.菌體從培養(yǎng)初期開始,生物量迅速增大,而酶活則開在0～7d增幅較小,從第7d開始,酶活迅速上升;生物量增大到第15d達(dá)到最大值,最大生物量為 214.50mg/L,之后呈下降趨勢,酶活在7～21d左右,均呈上升趨勢,并在21d達(dá)到峰值,為139280.7U/L,之后便迅速下降.整體來講,培養(yǎng)中期(11～22d)正處于酶活高峰期階段,故作用情況最好,降解率最高.

圖2 青頂擬多孔菌漆酶酶活與生長曲線Fig.2 The activity of Polyporellus picipes and its growth curve

關(guān)于漆酶降解作用的機(jī)理,侯紅漫等[22]在其相關(guān)的研究中指出: 漆酶是單電子氧化還原酶,它催化底物氧化反應(yīng)機(jī)理主要是底物自由基的生成和漆酶分子中4個Cu2+的協(xié)同作用.具體為底物結(jié)合酶活性中心的 I型 Cu2+位點(diǎn),通過Cys-His途徑將其傳遞給三核位點(diǎn);該位點(diǎn)再把電子傳遞給結(jié)合到活性中心的第二底物氧分子,并還原成水.在整體的反應(yīng)過程中,需要連續(xù)的單電子氧化作用,以滿足漆酶的充分還原.還原態(tài)的酶分子通過四電子轉(zhuǎn)移傳遞給分子氧,在此過程中,氧還原可能分為兩步:首先,有2個電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生過氧化氫中間體;該中間體在另外 2單電子作用下被還原成水.

2.3 青頂擬多孔菌對蒽+菲、蒽+芘復(fù)合 PAHs的降解

在28℃、160r/min條件下,檢測青頂擬多孔菌在液體培養(yǎng)基中對蒽+菲、蒽+芘復(fù)合 PAHs降解情況,結(jié)果如圖3和圖4所示.

青頂擬多孔菌對蒽、菲的單一降解效果很接近,菲稍高,降解率相差不到 6%.其他研究顯示[23-25],單一蒽與菲相比較,蒽毒性較小,更容易被微生物利用降解.故選擇用蒽作為刺激物,來研究復(fù)合 PAHs的降解作用.蒽作為刺激物的濃度選擇為 5mg/L,是因?yàn)樵趶?fù)合 PAHs研究中,主要研究的降解對象是菲和芘,想要利用蒽對菌種的刺激作用,以達(dá)到增大菲和芘的降解率的目的.蒽是充當(dāng)刺激物而不是被降解物的角色,故加入的量比菲和芘少.

青頂擬多孔菌對5mg/L蒽+30mg/L菲復(fù)合PAHs的降解率分別是:11d降解蒽 63.54%、菲42.00%;22d降解蒽94.11%、菲91.91%;33d降解蒽 99.47%、菲 99.46%.可見,初始階段(0～11d)和培養(yǎng)中期(11～22d)菌種降解對菲的作用明顯,降解率累積增幅較大,分別為42%和49.91%;在22d之后,降解作用趨于平緩,降解率累積增幅較小,僅為7.55%.

該菌對5mg/L蒽+30mg/L芘復(fù)合PAHs的降解率分別是:11d降解蒽53.94%、芘21.73%;22d降解蒽93.50%、芘56.54%;33d降解蒽98.91%、芘 61.09%(圖 4).可見,在初始階段(0～11d)和中期(11～22d),菌種對芘的降解作用較為明顯,11d芘降解率累積增值較大,分別為 21.73%和 34.81%;而培養(yǎng)后期(22～33d)時,作用較小,11d累積降解率增幅僅為4.55%.

圖4 5mg/L蒽+30mg/L芘的降解率Fig.4 The degradation rate under 5mg/L anthracene and 30mg/L pyrene

2.4 復(fù)合PAHs降解機(jī)理

在單一和復(fù)合基質(zhì)條件下, 菌種對同一種類、同一濃度的PAHs作用力不同.從圖5、圖6可見,菌種對單一菲和芘的降解能力均較含有5mg/L蒽的培養(yǎng)液中菲和芘的降解能力弱,尤其在降解初期,如降解11d時,單一條件下菲的累積降解率小于添加5mg/L蒽的PAHs復(fù)合基質(zhì)中菲的累積降解率 10.74%.隨著降解時間的延長,復(fù)合和單一 PAHs的降解差別逐漸縮小,這可能是由于單一PAHs經(jīng)青頂擬多孔菌降解后產(chǎn)生了易被該菌利用的物質(zhì),從而通過共代謝作用加速了單一 PAHs的降解,由此可以得出,在有易被青頂擬多孔菌降解的 PAHs存在時,一些難降解的PAHs在短時間內(nèi)也可得到較高的降解率(見圖5中降解11d數(shù)據(jù)).綜上,在復(fù)合PAHs的降解研究中,蒽的投加不但沒有減弱菌種對菲和芘的降解能力,反而在短時間內(nèi)促進(jìn)了2種PAHs的降解,增大了菌種對其的降解率,雖然蒽的加入能夠增大菌種對菲和芘的降解能力,但是青頂擬多孔菌對芘的降解率仍然遠(yuǎn)小于菲,這是由于 PAHs結(jié)果不同,菌種的作用方式不同.對于低環(huán)的菲,菌種可以直接代謝,較容易利用;對于大分子量、高環(huán)的芘,菌種利用形式較復(fù)雜,需要借助于外加碳源,采用共代謝的方式才能夠?qū)ζ溥M(jìn)行代謝降解[26].

圖5 不同條件菲降解率的對比Fig.5 The phenanthrene degradation rate in different conditions

圖6 不同條件下芘降解率的對比Fig.6 The pyrene degradation rate in different conditions

另外,高分子 PAHs一般是通過共代謝方式被微生物降解的[27-28].本研究發(fā)現(xiàn),青頂擬多孔菌能夠很好地將PAHs與外加的營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合進(jìn)行共代謝,有效利用營養(yǎng)底物,發(fā)揮自身峰值高、周期長(整個酶活周期超過30d)的產(chǎn)酶優(yōu)勢,通過分泌大量的漆酶完成對 PAHs的高效降解.對于單一 PAHs而言,菌種利用營養(yǎng)底物提供的碳源和能源對PAHs進(jìn)行共代謝降解,該降解率與PAHs的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)密切相關(guān)[29-30];對于復(fù)合 PAHs的研究則發(fā)現(xiàn),體系內(nèi)除了存在營養(yǎng)底物與 PAHs之間的共代謝之外,還存在著另外一種重要的共代謝形式,即PAHs之間的共代謝,不同種類PAHs之間存在著共代謝關(guān)系已被鞏宗強(qiáng)等[31]的研究所證實(shí),并且此類共代謝研究在其他難降解物質(zhì)中也有發(fā)現(xiàn)[32]. PAHs之間的共代謝作用形式在體系中發(fā)揮著不可替代的作用,對比圖 5和圖 6可知,復(fù)合基質(zhì)中菲和芘的降解率都高于單一的菲和芘,也就證明蒽在體系中起到促進(jìn)菲和芘降解的作用,即在 PAHs降解體系中,適當(dāng)投加一種較容易降解的PAHs會刺激菌種更好地利用難降解PAHs.而且菌種對復(fù)合PAHs的降解并不是分開的,而是一同進(jìn)行的,只是對于相對容易利用的物質(zhì)發(fā)揮的作用更加明顯.

3 結(jié)論

3.1 青頂擬多孔菌對 30mg/L等單一濃度蒽、菲、芘的33d累積降解率分別為94.76%、96.56%和57.53%.菌種對蒽和菲的降解能力均較強(qiáng)且能力接近,對芘的降解能力稍弱.不同種 PAHs被降解能力受PAHs的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)影響,在低環(huán)PAHs中,環(huán)數(shù)越高,毒性越大,越難被降解;同種 PAHs不同時期的降解率大小則受菌種的產(chǎn)酶時期影響,該菌漆酶酶活較高,本研究中降解中期完全處于產(chǎn)酶高峰期,故凈降解率最大.

3.2 青頂擬多孔菌對蒽+菲和蒽+芘兩種復(fù)合PAHs中菲和芘的 33d降解率分別為 99.46%和61.09%.與單一情況下相比,降解率均有所增大.對于提高的降解率而言,蒽的作用不可忽視.少量蒽的加入,在體系中形成了一種有利于菌種更好的發(fā)揮降解能力的新代謝形式,即不同分子量PAHs之間的共代謝,菌種在這種代謝形勢下,受到蒽的刺激,進(jìn)一步增強(qiáng)了對菲和芘降解能力,從而增大了降解率.

3.3 青頂擬多孔菌能夠有效地利用營養(yǎng)底物與PAHs、PAHs與PAHs兩種共代謝形式,充分發(fā)揮對 PAHs的降解能力.在共代謝形式下,作為刺激物的低環(huán) PAHs的適量加入,會誘導(dǎo)菌種發(fā)揮更大的降解潛力,在自身得到較好的降解的情況下,更加促進(jìn)另一種難降解 PAHs的降解代謝,增大難降解多環(huán)芳烴的降解率.

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致謝：本實(shí)驗(yàn)采用的菌種來自中科院微生物研究所,在此表示感謝.

Degradation characteristics of single and mixed PAHs by Polyporellus picipes.

DU Li-na1, GAO Da-wen1,2*(1.School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China；2.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China). China Environmental Science, 2011,31(2)：277～282

Polyporellus picipes, which existed commonly in forest area of northeast China, was used to degrade single and mixed polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). The accumulated degradations of phenanthrene, anthracene and pyrene were measured in 11, 22and 33d respectively. The degradation of single PAHs were phenanthrene ＞ anthracene＞ pyrene,and the accumulated degradation efficiencies of 33days were 96.56%, 94.76% and 57.53%, respectively. The accumulated degradation efficiencies of phenanthrene and pyrene in the presence of anthracene were 99.46% and 61.09%. In mixed PAHs degradation, adding a bit of anthracene would stimulate Polyporellus picipes to degrade phenanthrene and pyrene,and make the degradation efficiencies of them raise 2.9% and 3.56%. In conclusion, to improve the degradation of high molecular weight (HMW) or refractory PAHs, the low molecular weight (LMW) PAHs could be used as the co-metabolism substrates for HMW PAHs degradation.

Polyporellus picipes；single PAHs；mixed PAHs；degradation；co-metabolism

X172

A

1000-6923(2011)02-0277-06

2010-05-19

全國優(yōu)秀博士學(xué)位論文作者專項(xiàng)研究基金(200544);教育部博士點(diǎn)基金(20100062110002);黑龍江省杰出青年研究基金(JC200909)

* 責(zé)任作者, 教授, gaodw@nefu.edu.cn

杜麗娜(1984-),女,黑龍江省黑河市人,東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院環(huán)境科學(xué)專業(yè)碩士研究生.主要研究方向?yàn)榄h(huán)境生物技術(shù).發(fā)表論文1篇.