一次性免疫傳感器快速檢測(cè)阪崎腸桿菌的研究*

趙廣英，張 曉，竇文超，張 冕，唐維潞，王文華

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310035)

阪崎腸桿菌(Enterobacter Sakazakii，E Sakazakii)曾名為黃色陰溝腸桿菌。該菌是寄生在人和動(dòng)物腸道內(nèi)的條件致病菌，對(duì)成人危害不明顯，但對(duì)嬰幼兒危害非常嚴(yán)重，能引起新生兒腦膜炎、致死性小腸炎以及菌血癥，死亡率高達(dá)50%以上［1］。E Sakazakii引起的腦膜炎?？芍履X梗塞、腦膿腫、囊腫的形成和腦室炎等并發(fā)癥，并可引起神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥或迅速死亡［2］?，F(xiàn)已明確，嬰幼兒配方奶粉是嬰幼兒感染E Sakazakii的主要途徑。對(duì)于免疫機(jī)能尚不健全且以嬰幼兒配方奶粉為主要母乳代用品和營(yíng)養(yǎng)食品的嬰幼兒而言，該菌的危害是非常大的。2002年，國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(International Commission for Microbiological Specifications for Foods，ICMSF) 將E Sakazakii列為“嚴(yán)重危害特定人群，危害生命或慢性實(shí)質(zhì)性后遺癥或長(zhǎng)期影響”的致病菌［3］。2004年，F(xiàn)AO/WHO在制定嬰幼兒配方奶粉標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，經(jīng)過(guò)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，認(rèn)為E Sakazakii與單核細(xì)胞李斯特菌(Listeria Monocytogenes)、肉毒梭菌(Clostridium Botalinum)的A型毒素和B型毒素有同等的危害［4］。2005年，我國(guó)發(fā)布了檢測(cè)E Sakazakii的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)［5－7］，并于 2008 年和 2010 年進(jìn)行了改進(jìn)［8－9］。雖然標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢測(cè)方法準(zhǔn)確性較高，但實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)6 d～7 d，可操作性差。對(duì)該菌的快速檢測(cè)方法也有些報(bào)道，如分子生物學(xué)方法［10］、顯色培養(yǎng)基［11］等。開發(fā)更良好的快速檢測(cè)方法對(duì)該菌的及時(shí)監(jiān)測(cè)、監(jiān)管、質(zhì)控、感染的預(yù)防和感染后的及時(shí)確診的有效實(shí)施都是非常重要的。

離子液體(Ionic Liquids，ILs)是只含陰離子和陽(yáng)離子且在室溫下呈液態(tài)的熔融鹽。因其具有離子導(dǎo)電率高、溶解性好、電化學(xué)窗口寬、相穩(wěn)定性好、低毒等獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，ILs被應(yīng)用于萃取分離［12］、色譜［13－14］、質(zhì)譜［15］、光譜［16］、毛細(xì)管電泳［17］等分析化學(xué)領(lǐng)域。1992年，Wiikes等［18］合成了對(duì)水和空氣穩(wěn)定的ILs，這使得ILs成為酶促反應(yīng)溶劑的又一良好選擇。Fuller等［19］證明部分ILs是有較好生物相容性的介質(zhì)。在含陰離子 BF－4、PF－6、Tf2N－的 ILs 中酶的活性好［20］，這可能是 BF－4、PF－6、Tf2N－較小的氫鍵力減少了溶劑與酶內(nèi)部的氫鍵作用，減小了溶劑與酶結(jié)構(gòu)中正電荷區(qū)的作用使酶構(gòu)象不易改變，從而延長(zhǎng)酶的保存時(shí)間。Mori等［21］研究證明在離子液體1－丁基－3－甲基咪唑六氟磷酸鹽(1－Butyl－ 3 － Methylimidazolium Hexafluorophosphate，［BMIM］PF6)中多種酶表現(xiàn)出較好的活性。近幾年，用ILs構(gòu)建酶?jìng)鞲衅鞯难芯繄?bào)道較多，對(duì)傳感器多方面的改進(jìn)效果明顯［22－23］，但尚未見有將ILs用于改善免疫傳感器的報(bào)道。

MWCNT主要是由石墨的碳原子層卷曲成數(shù)層到數(shù)十層的同軸圓管，表現(xiàn)出小尺寸效應(yīng)、表面與界面效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)［24－25］既具有金屬的性質(zhì)又具有半導(dǎo)體特性［26］，有優(yōu)良的導(dǎo)電性和催化活性，能促進(jìn)生物分子的電子傳遞［27－28］?；谶@些特點(diǎn)，MWCNT成為生物傳感器制作的良好材料［29－30］。但MWCNT幾乎不溶于所有溶劑，這極大地限制了其在修飾電極方面的應(yīng)用。Nafion對(duì)MWCNT有較好的分散能力，有效的解除了MWCNT應(yīng)用的限制，而且 Nafion也具有良好的生物相容性［31－32］，國(guó)內(nèi)外已大量應(yīng)用Nafion制作高靈敏度葡萄糖傳感器的報(bào)道［35－36］。用 MWCNT/Nafion 構(gòu)建的生物傳感器雖然在多方面的性能已有明顯的改進(jìn)，但尚存在電化學(xué)信號(hào)的穩(wěn)定性，循環(huán)伏安(CV)峰的峰形還不夠理想［37－38］、傳感器儲(chǔ)存時(shí)間不夠長(zhǎng)［39］等不足。本研究將MWCNT分散于Nafion溶液中制備了具有很好穩(wěn)定性的懸浮液。

絲網(wǎng)印刷電極作為支持電極，相比于固體電極制作的免疫傳感器，減少了電極每次使用后都要進(jìn)行物理或化學(xué)處理帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)誤差和麻煩，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和簡(jiǎn)便性;絲網(wǎng)印刷電極的價(jià)格非常便宜，一次性使用，可實(shí)現(xiàn)批量化生產(chǎn)。

本研究嘗試用Nafion、多壁碳納米管(Multi-Wall Carbon Nanotube，MWCNT)結(jié)合離子液體［BMIM］PF6對(duì)絲網(wǎng)印刷電極進(jìn)行修飾，研制了一種新型的電化學(xué)免疫傳感器，用于快速檢測(cè)阪崎腸桿菌。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI 1030A電化學(xué)工作站、CHI 760C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司);SPM－9500J3原子力顯微鏡(日本島津);絲網(wǎng)印刷碳電極(SPCE，本研究團(tuán)隊(duì)與嶸斌生物科技有限公司共同開發(fā)研制);阪崎腸桿菌(E Sakazakii，ATCC 29544); 大 腸 桿 菌(Escherichia coli，E coli，ATCC 8739)、金黃色葡萄 球 菌 (Staphylococcus aureus，S Aureus，ATCC 27217)、副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus，VP，VP 17802)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus Cereus，B Cereus，ATCC 7064)(購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，CICC);純化MWCNT(中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司);［BMIM］PF6(中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所)、Nafion117(5%，F(xiàn)luka)、HRP-Anti-E Sakazakii(北京賽馳生物科技有限公司)、牛血清蛋白(BSA，杭州昊天生物技術(shù)有限公司)、硫堇(Thionine，Thi，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0.01 mol/L，pH 7.4)、H2O2、NaCl、冰醋酸、無(wú)水乙酸鈉等試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。電化學(xué)測(cè)量前，支持電解質(zhì)均充N220 min除氧。

1.2 免疫電極的制備

取適量5%Nafion，用乙醇/水混合物(V乙醇∶V水=1∶2)分別稀釋至 0.5%和 0.1%。準(zhǔn)確稱量 1.0 mg已純化的MWCNT溶于1.5 mL 0.5%Nafion溶液中，超聲處理30 min。將MWCNT懸浮液室溫過(guò)夜，除去沉淀。用0.1%Nafion配制13%［BMIM］PF6溶液。

酶免疫電極按照如下步驟制備:①用微量移液器吸取3 μL MWCNT/Nafion溶液均勻滴涂于SPCE的工作電極表面，室溫晾干;②將13%［BMIM］PF6溶液與 HRP-Anti-E Sakazakii(6 μg/mL)等體積混合，在混勻器上震蕩均勻，4℃保存;③吸取3 μL［BMIM］PF6/Nafion/HRP-Anti-E Sakazakii混合液均勻滴涂到步驟①修飾的工作電極上，室溫晾干;④制得的免疫電極4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 免疫電極制備及工作原理示意圖

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將不同修飾電極于SPM－9500J3型AFM進(jìn)行成像觀察，掃描方式為輕敲模式，所用探針為商用OMCL－AC240TS－C2 型(日本Olympus公司)，所有圖像均通過(guò)自動(dòng)平滑處理以消除慢掃方向的低頻噪音。

電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用三電極體系:免疫電極為工作電極，碳電極為對(duì)電極，Ag/AgCl電極為參比電極。采用循環(huán)伏安法(CV，應(yīng)用CHI 1030A電化學(xué)工作站)和交流阻抗法(EIS，應(yīng)用CHI 760C電化學(xué)工作站)對(duì)免疫電極電化學(xué)表征，用CV檢測(cè)E Sakazakii。測(cè)試底液為含1.0 mmol/L Thi的0.3 mmol/L H2O2HAc－NaAc(0.1 mol/L，pH 6.5)緩沖溶液。用生理鹽水制備的各濃度梯度的E Sakazakii懸液，在每個(gè)免疫電極上滴加3 μL菌懸液，于無(wú)菌密閉容器中30±0.5℃孵育20 min，用雙蒸水仔細(xì)沖洗干凈，晾干。用CV法檢測(cè)免疫電極還原峰電流值的變化值(ΔIpc)來(lái)測(cè)定樣品中的 E Sakazakii，ΔIpc=Ipc1－Ipc2，其中Ipc1為免疫電極在測(cè)試底液中的還原峰電流值，Ipc2為免疫電極孵育抗原后在測(cè)試底液中的還原峰電流值。

2 結(jié)果與討論

2.1 電極表征

2.1.1 AFM 表征

通過(guò)AFM對(duì)修飾電極做了形態(tài)表征，如圖2所示。由圖1a可見MWCNT露出部分的形態(tài)，這表明Nafion成功地將 MWCNT修飾到了電極上。［BMIM］PF6/Nafion包埋的酶標(biāo)抗體明顯地固定在MWCNT/Nafion修飾的電極上(圖2b)。免疫電極孵育后(圖2c)，E Sakazakii覆蓋了抗體層(圖2c)，這表明HRP-Anti-E Sakazakii與E Sakazakii發(fā)生了特異性結(jié)合。

圖2 電極修飾的AFM表征

2.1.2 電極修飾過(guò)程的循環(huán)伏安表征

采用CV研究不同修飾物對(duì)電極電化學(xué)特性的影響(圖3)。

圖3 不同電極在測(cè)試底液中的CV圖

由圖3可知，裸絲網(wǎng)印刷碳電極(SPCE)在底液中出現(xiàn)一對(duì)可逆的Thi(硫堇)氧化還原峰(曲線a);當(dāng)電極修飾Nafion后，氧化峰電流值基本不變，還原峰電流值增大(曲線b)，這是由于Nafion側(cè)鏈上的－HSO－3離子束的靜電作用，可以使得Nafion膜通過(guò)離子交換固定測(cè)試底液中的電活性物質(zhì)Thi，這促進(jìn)了電子從電極向Thi的傳遞從而導(dǎo)致了還原峰電流增大;當(dāng)MWCNT/Nafion修飾到電極表面后，氧化還原峰電流明顯增大(曲線 c)，這是因?yàn)镸WCNT具有大比表面積能有效地改變電極表面特性，MWCNT管端類似于高度有序石墨電極有較快的電子傳遞能力，MWCNT的獨(dú)特電化學(xué)特性使得電極CV時(shí)信號(hào)明顯放大;用［BMIM］PF6/Nafion修飾電極后，氧化還原峰降低(曲線 d)，這是由于［BMIM］PF6/Nafion阻礙了Thi和H2O2向電極修飾層內(nèi)部的擴(kuò)散，雖然減弱了底物與MWCNT間的電子傳遞，在一定程度上降低了電極的電流響應(yīng)，卻使得免疫電極孵育前后的電流變化值ΔIpc中所占的比例提高，使得檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。當(dāng)HRP-anti-E Sakazakii固定后，電極氧化還原電流峰電流顯著增大(曲線e)，這表明酶標(biāo)抗體已成功地包埋在［BMIM］PF6/Nafion復(fù)合膜中。免疫反應(yīng)后，免疫電極氧化還原峰電流值大幅減小(曲線f)，表明抗原－抗體免疫反應(yīng)后生成的免疫復(fù)合物在部分空間上阻礙了媒介體和底物向HRP活性中心和電極內(nèi)部的擴(kuò)散，電子傳遞受到阻礙，從而導(dǎo)致了氧化還原電流峰值的大幅降低。

2.1.3 免疫傳感器的交流阻抗法(EIS)表征

以Thi為探針對(duì)免疫電極進(jìn)行交流阻抗法表征。如圖4所示，裸電極的阻抗圖譜近似一條直線(曲線a)，這表明電極過(guò)程只受擴(kuò)散控制;電極上修飾Nafion/MWCNT后，電極的阻抗值明顯增大(曲線b)。修飾離子液體［BMIM］PF6/Nafion/HRP-anti-E Sakazakii后電極在動(dòng)力學(xué)上變慢(曲線c)，這是因?yàn)槊笜?biāo)抗體是生物大分子，固定于電極后使得電極表面電子傳遞受到較大阻力。免疫電極經(jīng)免疫反應(yīng)后阻抗值明顯增大(曲線d)，這表明修飾在電極上的抗體保持了很好的活性，成功的結(jié)合了抗原。

圖4 不同電極在測(cè)試底液中的Nyquist圖

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 測(cè)試底液中H2O2濃度確定

H2O2濃度對(duì)HRP催化反應(yīng)影響較大。如圖5所示，在H2O2濃度為0～0.1 mmol/L時(shí)，免疫電極還原峰電流值急劇增大;在0.1 mmol/L～1 mmol/L間，隨著H2O2濃度的增加，免疫電極還原峰電流值增加平緩。考慮到檢測(cè)的靈敏度、酶催化活性以及CV峰形，選取0.3 mmol/L濃度的H2O2。

圖5 測(cè)試底液中H2O2濃度與免疫電極還原峰電流的關(guān)系

2.2.2 pH 的確定

底液pH值對(duì)免疫電極氧化還原峰電流響應(yīng)的影響如圖6所示。在含1.0 mmol/L Thi和0.3 mmol/L H2O2的底物溶液中，pH 4.0 ～8.0 范圍內(nèi)，免疫電極在pH 5.0時(shí)氧化峰電流值最大，之后逐漸降低;還原峰電流值隨pH的增加而增大。在pH 6.5時(shí)，免疫電極峰形最為良好，因此實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)試底液pH為6.5。

圖6 測(cè)試底液pH與免疫電極氧化峰電流(a)和還原峰電流(b)的關(guān)系

2.2.3 孵育條件的選擇

孵育溫度和時(shí)間對(duì)免疫反應(yīng)有顯著影響。圖7(a)顯示，在(30±0.5)℃溫度下，免疫反應(yīng)前后免疫電極還原峰電流值減少量ΔIpc最大。在這一溫度下，免疫反應(yīng)10 min后，還原峰電流值變化平緩;孵育50 min時(shí)ΔIpc出現(xiàn)較大波動(dòng)(圖7(b))，這是由稀釋抗原的生理鹽水中NaCl形成結(jié)晶難以被洗脫而導(dǎo)致的現(xiàn)象?？紤]到免疫反應(yīng)的充分性和檢測(cè)周期，實(shí)驗(yàn)中選擇孵育時(shí)間為20 min。

圖7 孵育溫度和孵育時(shí)間與還原峰電流的關(guān)系

2.3 免疫電極對(duì)E Sakazakii的響應(yīng)

在以上優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行E Sakazakii的電化學(xué)免疫測(cè)定，采用CV法檢測(cè)免疫前后還原峰電流的變化值 ΔIpc。圖8表明E Sakazakii濃度在103cfu/mL～109cfu/mL之間變化時(shí)，ΔIpc與細(xì)菌濃度的對(duì)數(shù)成良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔIpc(μA)=0.2580lg［C/(cfu·mL－1)］－0.6469，相關(guān)系數(shù)為0.9987。檢出限為3.4×102cfu/mL(S/N=3)。

圖8 免疫電極還原峰電流變化值對(duì)E Sakazakii濃度對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 特異性

特異性是衡量免疫電極性能好壞的一個(gè)重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)中選取 PBS空白液和 VP、E coli、S flexneri、S Aureus、B Cereus(濃度與 E Sakazakii相同，均為109cfu/mL)這些食品中常見致病微生物進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。圖9顯示免疫電極檢測(cè)E Sakazakii時(shí)，電流變化遠(yuǎn)大于其他致病菌和PBS引起的電流變化(ΔIpc均小于0.3 μA)，這表明該免疫電極具有較好的特異性。

圖9 免疫電極的特異性

2.5 重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性

2.5.1 重現(xiàn)性、穩(wěn)定性

分別取不同批次制備的免疫電極對(duì)E Sakazakii進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果RSD＜6%(n=7)，這表明該免疫電極具有良好的重現(xiàn)性。將免疫電極于4℃下放置30 d，每隔5 d對(duì)電極測(cè)試并記錄其電流響應(yīng)，并與只用Nafion包埋酶標(biāo)抗體制作的免疫電極對(duì)照。圖10顯示，由 Nafion/［BMIM］PF6/HRP-anti-E Sakazakii制備免疫電極的響應(yīng)信號(hào)為初始信號(hào)的95.50%(n=6)，而對(duì)照組信號(hào)降至初始信號(hào)的88.10%。這說(shuō)明離子液體［BMIM］PF6能有效地延長(zhǎng) HRP-anti-E Sakazakii的半衰期而保持其活性，使得免疫電極有較長(zhǎng)的儲(chǔ)存周期。

圖10 免疫電極的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

2.5.2 準(zhǔn)確性

根據(jù)免疫電極特異性實(shí)驗(yàn)，當(dāng)免疫電極檢測(cè)實(shí)際樣品的電流變化值ΔIpc≥0.3 μA時(shí)，將樣品定為陽(yáng)性樣品，ΔIpc＜0.3 μA 時(shí)定為陰性樣品。采用免疫電極檢測(cè)十種嬰幼兒配方奶粉，平行測(cè)3份，并與國(guó)標(biāo)法比較。結(jié)果見表1，十種樣品均為陰性，兩種檢測(cè)方法結(jié)果一致。由于免疫電極檢測(cè)確定陰性樣品的判據(jù)是還原峰電流值變化 ΔIpc＜0.3 μA，所以檢測(cè)結(jié)果存在假陰性的可能。本團(tuán)隊(duì)利用感官評(píng)價(jià)中的三點(diǎn)檢驗(yàn)法進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)分為樣品制備和免疫電極檢測(cè)兩部分，由兩組人員獨(dú)立完成。樣品準(zhǔn)備人員隨機(jī)選取三種無(wú)E Sakazakii檢出的奶粉，在其中兩種奶粉中接種E Sakazakii。經(jīng)處理，制備六組試樣用于檢測(cè)，每組試樣包含3份，分別由3種奶粉制備。由作者用免疫傳感器對(duì)試樣檢測(cè)。表2顯示，免疫電極準(zhǔn)確地鑒別出17份試樣是否被E Sakazakii污染，出現(xiàn)1例假陰性，出現(xiàn)假陰性的概率為5.56%。在清除電極表面NaCl和未免疫結(jié)合抗原過(guò)程中，沖洗強(qiáng)度過(guò)大是出現(xiàn)假陰性的主要原因，選擇更合適的試劑分散E Sakazakii是降低沖洗強(qiáng)度的有效方法。

表1 免疫電極準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=30)

表2 免疫電極三點(diǎn)檢驗(yàn)法準(zhǔn)確性檢測(cè)的結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用［BMIM］PF6/Nafion基質(zhì)將HRP-anti-E Sakazakii固定于Nafion/MWCNT修飾的絲網(wǎng)印刷碳電極上，制成檢測(cè)E Sakazakii的免疫電極。該免疫電極具有較好的電化學(xué)信號(hào)、選擇性、重現(xiàn)性(RSD＜6%)、準(zhǔn)確性(出現(xiàn)假陰性的概率為5.56%)和儲(chǔ)存穩(wěn)定性(4℃放置30 d后電流響應(yīng)值問(wèn)為初始值的 95.50%)。該方法檢測(cè)的線性范圍為>103cfu/mL～109cfu/mL。此免疫電極制作簡(jiǎn)便、成本低廉，利用其檢測(cè)目標(biāo)抗原簡(jiǎn)單易行，有望成為快速檢測(cè)微生物的一種新方法。

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