乳與乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的特性及檢測(cè)方法

劉志楠，喻東威，趙源，劉曉川，趙雅麗，薛志清，李梅

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司質(zhì)量管理系統(tǒng)分析檢測(cè)中心，內(nèi)蒙古011500）

乳與乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的特性及檢測(cè)方法

劉志楠，喻東威，趙源，劉曉川，趙雅麗，薛志清，李梅

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司質(zhì)量管理系統(tǒng)分析檢測(cè)中心，內(nèi)蒙古011500）

研究了β-內(nèi)酰胺酶的特性和檢測(cè)方法；向復(fù)原乳中添加不同濃度的青霉素鈉，從而確定β-內(nèi)酰胺酶降解抗生素的最適比例；通過(guò)耐熱性試驗(yàn)和耐久性試驗(yàn)來(lái)確定其穩(wěn)定性；通過(guò)添加青霉素鈉來(lái)檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶的含量。結(jié)果表明：β-內(nèi)酰胺酶降解抗生素的最適比例為3瓶/t；β-內(nèi)酰胺酶經(jīng)100℃沸水處理后（90 s）和經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間保存后（4℃，96 h）仍具有很強(qiáng)的抗生素降解能力；添加10-9g/L青霉素鈉，經(jīng)37℃3 h靜置反應(yīng)后，添加的抗生素可被降解。了解β-內(nèi)酰胺酶的特性后可以應(yīng)用本方法檢測(cè)乳與乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的比例。

β-內(nèi)酰胺酶；青霉素鈉；乳與乳制品。

0 引言

隨著人們生活質(zhì)量的逐漸提高，食用乳及乳制品的安全問(wèn)題備受關(guān)注，而其中最突出的就是抗生素的殘留[1-3]。目前，青霉素作為β-內(nèi)酰胺類藥物是治療牛乳腺炎的首選藥物，是牛奶中最常見(jiàn)的殘留抗生素。由于國(guó)內(nèi)多數(shù)乳品企業(yè)對(duì)抗生素殘留超標(biāo)的牛乳采取降價(jià)收購(gòu)，出于經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)，一些不法分子人為地使用一些生物制劑去降解牛乳中殘留的抗生素，生產(chǎn)人造“無(wú)抗奶”。2005年至今，已有數(shù)家公司宣稱出售分解牛乳中殘留抗生素解抗劑。經(jīng)過(guò)調(diào)研工作，初步判斷市售解抗劑的主要成分是β-內(nèi)酰胺酶[4]。β-內(nèi)酰胺酶作為國(guó)家禁止的添加物，現(xiàn)行的檢測(cè)方法主要有直接法和間接法[5]。本實(shí)驗(yàn)擬采用間接法[6，7]。

1 材料與方法

牛奶，青霉素鈉磷酸鹽緩沖液，無(wú)抗新西蘭奶粉，β-lactamase，Twinsensor抗生素檢測(cè)試紙條，chram抗生素檢測(cè)試紙條，利普斯50抗生素檢測(cè)試劑，水浴鍋，培養(yǎng)箱。

向復(fù)原乳中添加不同濃度的青霉素鈉，從而確定β-內(nèi)酰胺酶降解抗生素的最適比例；通過(guò)耐熱性試驗(yàn)和耐久性試驗(yàn)來(lái)確定其穩(wěn)定性；通過(guò)添加青霉素鈉來(lái)檢測(cè)乳與乳制品中β-內(nèi)酰胺酶的比例。

2 結(jié)果

2.1 比例實(shí)驗(yàn)

2.1.1 含有10-8g/L青霉素鈉的牛乳

新西蘭無(wú)抗奶粉10 g+90 mL蒸餾水，振蕩混均制成復(fù)原乳，990 μL復(fù)原乳+10 μL的β-lactamase配置形成β-lactamase母液。另10 mL或5 mL復(fù)原乳加100 μL青霉素鈉的量為1×10-6，配置形成抗生素為10×10-8或5×10-9的溶液5份，分別添加2，6，18，30 μL的β-lactamase母液到10 mL復(fù)原乳中，其β-lactamase最終比例為1瓶/3t、1瓶/t、3瓶/t和5瓶/t牛奶、混均，37℃靜置3 h，Twinsensor檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。

表1 含有10-8g/L青霉素鈉的牛乳Twinsensor檢測(cè)結(jié)果

2.1.2 含有5×10-9g/L青霉素鈉的牛乳

新西蘭無(wú)抗奶粉10 g+90 mL蒸餾水，振蕩混均制成復(fù)原乳，990 μL復(fù)原乳+10 μL的β-lactamase配置形成β-lactamase母液。另5 mL復(fù)原乳加100 μL青霉素鈉的量為1×10-6，配置形成抗生素的量為5×10-9的溶液5份，分別添加2，6，18，30 μL的β-lactamase母液到10 mL復(fù)原乳中，其β-lactamase最終比例為1瓶/3t，1瓶/t，3瓶/t和5瓶/t牛奶、混均，37℃靜置3 h，Twinsensor檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。

表2 含有5×10-9青霉素鈉的牛乳Twinsensor檢測(cè)結(jié)果

由表1和表2可以看出，在最佳反應(yīng)條件下（37℃，3 h），含有5×10-9或10-8g/L青霉素鈉的牛奶經(jīng)不同比例β-lactmase處理后，1瓶/3 t或1瓶/t的β-lactmase比例不能徹底降解青霉素鈉?？紤]到奶站的實(shí)際，3～5瓶/t牛奶β-lactmase比例才可能降解牛奶中的抗生素。

2.2 Beta-lactamase的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.2.1 β-lactamase的耐熱性實(shí)驗(yàn)

采用100℃沸水處理。新西蘭無(wú)抗奶粉10 g+90 mL蒸餾水，振蕩混均制成復(fù)原乳，990 μL復(fù)原乳+10 μL的β-lactamase配置成β-lactamase母液，添加18 μL的βlactamase母液到10 mL復(fù)原乳中，其β-lactamase最終比例為3瓶/t牛奶，取上述牛奶6份均為1 mL，分別煮沸0，10，30，60，90，120 s后迅速降溫到室溫，熱處理后的6瓶×1mL復(fù)原乳分別加入10 μL的1×10-6g/L青霉素鈉，另取1 mL無(wú)β-lactamase的復(fù)原乳加入10 mL的1×10-6g/L青霉素鈉作為對(duì)照（抗生素的量為10-8），混均，37℃靜置3 h；分別用Twinsensor，E50，Charm檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。

表3 β-lactamase的耐熱性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 β-lactamase的耐久性實(shí)驗(yàn)

新西蘭無(wú)抗奶粉10 g+90 mL蒸餾水，振蕩混均制成復(fù)原乳，990 μL復(fù)原乳+10 μL的β-lactamase配置成β-lactamase母液，分別添加0，6，18，30 μL的β-lactamase母液，到10 mL復(fù)原乳中，其β-lactamase最終比例為0瓶/t，1瓶/t，3瓶/t和5瓶/t牛奶、混均；37℃靜置3 h后4℃保存96 h，分別取上述1 mL復(fù)原乳+10 μL的1×10-6g/L青霉素鈉（抗生素的量為10-8），混均，37℃靜置3 h，分別用Twinsensor、E50和Charm檢測(cè),結(jié)果如表4所示。

表4 β-lactamase的耐久性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

由表3和表4可以看出，經(jīng)100℃沸水處理后（90 s），牛奶中的β-lactmase仍具有很強(qiáng)的β-內(nèi)酰胺類抗生素降解能力。牛奶中的β-lactmase經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間保存后（4℃，96 h）仍具有很強(qiáng)的β-內(nèi)酰胺類抗生素降解能力。經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)證明，牛奶中添加的β-lactmase具有穩(wěn)定的降解β-內(nèi)酰胺類抗生素的能力（為添加抗生素方法檢測(cè)解抗劑存在提供理論基礎(chǔ)）。

2.3 抗生素解抗劑檢測(cè)方法

2.3.1 10-9青霉素鈉添加檢測(cè)

無(wú)抗新西蘭奶粉10 g+90 mL蒸餾水，振蕩混均制成復(fù)原乳，990 μL復(fù)原乳+10 μL的β-lactamase配置成β-lactamase母液；（10 mL復(fù)原乳+100 μL,1×10-6g/L青霉素鈉）×2（抗生素的量為10-8），分別添加18 μL和30 μL的β-lactamase母液到10 mL復(fù)原乳中，其β-lactamase最終比例為3瓶/t和5瓶/t牛奶，混均，室溫靜置3h，Twinsensor檢測(cè)結(jié)果（-）。其中一部分進(jìn)行以下操作：2瓶×1 mL（3瓶/t），2瓶×1 mL（5瓶/t），沸水處理120 s后降至室溫，上述處理的（1 mL復(fù)原乳+10 μL10-6g/L青霉素鈉）×4（抗生素的量為），兩種比例的樣品分別37℃和室溫靜置，3 h后Twinsensor和Charm檢測(cè)；另一部分進(jìn)行以下操作：2瓶×1 mL（3瓶/t），2瓶×1 mL（5瓶/t），上述處理的（1 mL復(fù)原乳+10μL 10-6g/L青霉素鈉）×4（抗生素的量為10-8g/L），兩種比例的樣品分別37℃和室溫靜置，3 h后Twinsensor和Charm檢測(cè)，結(jié)果如表5所示。

表5 10-8g/L青霉素鈉添加3小時(shí)后檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)

2.3.25 ×10-9g/L青霉素鈉添加檢測(cè)

無(wú)抗新西蘭奶粉10 g+90 mL蒸餾水，振蕩混均制成復(fù)原乳，990 μL復(fù)原乳+10 μL的β-lactamase配置成β-lactamase母液；（10 mL復(fù)原乳+50 μL,1×10-6g/L青霉素鈉）×3（抗生素為5×10-9g/L），分別添加6，18，30 μL的β-lactamase母液到10 mL復(fù)原乳中，其β-lactamase最終比例為1瓶/t，3瓶/t和5瓶/t牛奶，混均，室溫靜置3 h，Twinsensor檢測(cè)結(jié)果（-）。其中一部分進(jìn)行以下操作：2瓶×1 mL（1瓶/t）、2瓶×1 mL（3瓶/t），2瓶×1 mL（5瓶/t），沸水處理120 s后降至室溫，上述處理的（1 mL復(fù)原乳+5μL，1×10-6g/L青霉素鈉）×6（抗生素的量為5×10-9g/L），兩種比例的樣品分別37℃和室溫靜置，3 h后Twinsensor和snap檢測(cè)；另一部分進(jìn)行以下操作：2瓶×1 mL（1瓶/t）、2瓶×1 mL（3瓶/t），2瓶×1 mL（5瓶/t），上述處理的（1 mL復(fù)原乳+5 μL,1×10-6g/L青霉素鈉）×6（抗生素的量為5×10-9g/L），兩種比例的樣品分別37℃和室溫靜置，3 h后Twinsensor和snap檢測(cè)，結(jié)果如表6所示。

表6 5×10-9g/L青霉素鈉添加3h后檢測(cè)結(jié)果檢測(cè)

由表5和表6可以看出，本研究模擬原奶中含有抗生素，并用合適量的解抗劑降解，3 h室溫或37℃靜置反應(yīng)后，用微生物法（E50試劑盒）和快抗法（Twinsensor、Charm和Snap）檢測(cè)均為抗生素陰性的情況下，再往這些牛奶中添加抗生素（青霉素鈉），用微生物法（E50試劑盒）和快抗法（Twinsensor、Charm和Snap）來(lái)檢測(cè)這些添加的抗生素的變化來(lái)推斷原奶中是否含有解抗劑。

含有合適比例解抗劑的牛奶（3瓶/t）中，添加抗生素青霉素鈉5×10-9或10-8g/L后，室溫或37℃反應(yīng)3 h，均可使添加的抗生素降解。37℃比室溫反應(yīng)的結(jié)果好。添加抗生素的量10-8相對(duì)較好，5×10-9接近目前公司各種檢測(cè)試劑盒的極限，結(jié)果判斷有些難度。經(jīng)過(guò)熱處理（120 s）的樣品中解抗劑雖然活性降低，但仍能降解添加的抗生素（3 h，37℃），即使不能完全降解添加的抗生素，但通過(guò)陽(yáng)性值明顯降低也可以判斷解抗劑的存在，這使得本方法檢測(cè)成品中解抗劑有了可能。

2.4 β-lactamase的活力測(cè)定

精密量取青霉素溶液（每1 mL含有青霉素1萬(wàn)單位，pH值為7.0磷酸鹽緩沖液）50 mL，預(yù)熱37℃后，精密加入已預(yù)熱好的青霉素酶稀釋液（每1 mL含有青霉素酶8 000～12 000單位，pH值為7.0磷酸鹽緩沖液，在37℃預(yù)熱。）25 mL，迅速混勻，在37℃準(zhǔn)確放置1h，精密量取3 mL，立即加入已精密量取的碘滴定液（濃度為0.005 mol/L）25 mL中,在室溫暗處放置15 min，用硫代硫酸鈉滴定液（濃度為0.01 mol/L）滴定，至近終點(diǎn)時(shí)，加淀粉指示液，繼續(xù)滴加至藍(lán)色消失。

空白試驗(yàn)：取已預(yù)熱的青霉素溶液2 mL，精密加入上述碘滴定液（濃度為0.005 mol/L）25 mL,然后精密加入青霉素酶稀釋液1 mL，在室溫暗處放置15 min，用硫代硫酸鈉滴定液（濃度為0.01mol/L）滴定。按照公式計(jì)算。測(cè)定結(jié)果為

E=(B-A)MFD100=(21.43-0.1)×0.01×742×300×100=474.8萬(wàn)U/mL，

式中：E為青霉素酶活力；B為空白滴定所消耗的上述硫代硫酸鈉滴定液的體積；A為供試品滴定所消耗的上述硫代硫酸鈉滴定液的體積；M為硫代硫酸鈉滴定液的濃度；F為在相同條件下，每1 mL的上述碘滴定液（濃度為0.005 mol/L）相當(dāng)于青霉素的效價(jià)；D為青霉素酶溶液的稀釋倍數(shù)。

3 討論

牛奶中的解抗劑β-lactamase保存期長(zhǎng)，耐熱性和穩(wěn)定性好。3-5瓶/t的比例解抗劑β-lactamase在室溫3 h可以完全中和或降解牛奶中的抗生素。含有抗生素和合適量解抗劑β-lactamase的牛奶，再添加10-9g/L抗生素青霉素鈉后，經(jīng)37℃（3 h）靜置反應(yīng)后，添加的抗生素可被降解，與對(duì)照比較，添加的抗生素被降解，可間接證明解抗劑的存在。本法同時(shí)檢測(cè)抗生素和抗生素解抗劑。本法檢測(cè)解抗劑的限度目前為0.018 g/L牛奶，0.01 g/L牛奶以下也可檢出。本法無(wú)需購(gòu)買新儀器。只要無(wú)抗新西蘭奶粉或無(wú)抗奶和廉價(jià)的青霉素鈉，可操作性強(qiáng)，結(jié)果判斷簡(jiǎn)單。

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β-lactamase character and detected method in milk and milk product

LIU Zhi-nan，YU Dong-wei，ZHAO Yuan，LIU Xiao-chuan，ZHAO Ya-li，XUE Zhi-qing，LI Mei
（Inner Mongolia Mengniu Dairy Industry(Group)Limited Company Quality Management Department Analysis Test Center，Inner Mongolia 011500，China）

Sstudy on the character and detecting method of β-lactamase can degrade the antibioticr.Added different concentration benzylpenicillin sodium into in this experiment,to sure the optimal proportion of antibiotic degraded by the β-lactamase and determine the stability by the heat resistance and durability experiment;detected the content of β-lactamase by adding benzylpenicillin sodium.Results:The optimal βlactamase ratio for degrading antibiotics was 3 bottles/t,It still keep strong antibiotics degrading ability by dealt with 100℃water for 90 s or stored in 4℃，96 h;added 10ppb benzylpenicillin sodium which was degraded after set in 37℃3 h.Applied the method to detect β-lactamase content in milk or milk product after understanding the character of β-lactamase.

β-lactamase;benzylpenicillin sodium;milk and milk product

TS252.7

A

1001-2230（2011）01-0053-03

2010-10-14

劉志楠（1982-），男，分析研究員，研究方向?yàn)槭称窓z測(cè)與分析。