高產(chǎn)胞外多糖嗜熱鏈球菌混菌培養(yǎng)特性研究

馬艷，陳歷俊，王昌祿，牟光慶，陳曉璇

（1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧大連116034；2.北京三元食品股份有限公司技術(shù)中心，北京100085；3.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

高產(chǎn)胞外多糖嗜熱鏈球菌混菌培養(yǎng)特性研究

馬艷1，陳歷俊2，王昌祿3，牟光慶1，陳曉璇1

（1.大連工業(yè)大學食品學院，遼寧大連116034；2.北京三元食品股份有限公司技術(shù)中心，北京100085；3.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

探討高產(chǎn)胞外多糖嗜熱鏈球菌混菌培養(yǎng)的產(chǎn)酸、產(chǎn)香、產(chǎn)黏特性。以發(fā)酵酸度、乙醛質(zhì)量濃度和黏度為綜合指標，確定高產(chǎn)胞外多糖的嗜熱鏈球菌（S.t.）、保加利亞乳桿菌（L.b.）、嗜酸乳桿菌（L.a.）混菌最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度42℃，總接菌量體積分數(shù)4%，V（S.t.）︰V（L.b.）︰V（L.a.）=3︰2︰1。在此條件下，混菌培養(yǎng)可以顯著地提高酸度、乙醛質(zhì)量濃度、黏度、胞外多糖質(zhì)量濃度、β-半乳糖苷酶酶活、蛋白酶水解能力（P＜0.01）。發(fā)酵過程中，胞外多糖質(zhì)量濃度與黏度，β-半乳糖苷酶酶活與酸度，蛋白酶酶活與酸度、乙醛質(zhì)量濃度的相關(guān)性系數(shù)很高。

胞外多糖；混菌培養(yǎng)；酸度；黏度

0 引言

酸奶的品質(zhì)很大程度上取決于乳酸菌發(fā)酵劑的質(zhì)量，性狀優(yōu)良的發(fā)酵劑是高品質(zhì)發(fā)酵乳的保證。目前我國對乳酸菌發(fā)酵劑的研究尚處于初級階段，雖然添加穩(wěn)定劑可改善發(fā)酵乳制品的結(jié)構(gòu)和質(zhì)地，但同時在一定程度上掩蓋了酸奶的真實味道[1]。酸奶發(fā)酵劑若有產(chǎn)粘菌株存在，則會極大提高產(chǎn)品的質(zhì)地、組織狀態(tài)和功能特性。

目前對于高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌混合培養(yǎng)的研究報道很少，本文將一株從西藏雪蓮中篩選的高產(chǎn)胞外多糖的嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌和產(chǎn)酸能力強、具有益生性嗜酸乳桿菌混合培養(yǎng)，確定其產(chǎn)酸、產(chǎn)香和產(chǎn)黏特性的最佳發(fā)酵條件，同時研究了混菌在發(fā)酵過程中的產(chǎn)物變化情況，為提高酸奶的組織狀態(tài)以及研制高效直投式酸奶發(fā)酵劑等提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

嗜熱鏈球菌(Streotococcus thermophillus)，西藏雪蓮中篩選；高產(chǎn)胞外多糖，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳酸菌菌庫提供；保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)，嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)，本實驗室保藏菌種。

12%的脫脂乳，MRS固體培養(yǎng)基，改良IRIE固體培養(yǎng)基。

1.2 儀器

756PC紫外可見分光光度計，YZ280A手提式不銹鋼蒸汽消毒器，LG16-W高速微量離心機，DRP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，722型光柵分光光度計，DK-S22型恒溫水浴鍋、JY99-2D超聲波細胞粉碎機。

1.3 方法

1.3.1 共生性與混菌最佳培養(yǎng)條件的優(yōu)化

稀釋平板計數(shù)法比較混菌培養(yǎng)與單菌培養(yǎng)的活菌數(shù)，確定其共生性。

以酸度、乙醛質(zhì)量濃度、黏度的綜合評分為指標確定混菌最佳培養(yǎng)條件，即：菌種比例、培養(yǎng)溫度、接菌量。

1.3.2 滴定酸度的測定

酸度測定按GB/T5009.46-2003(乳與乳制品衛(wèi)生標準的分析方法)進行。

1.3.3 乙醛的測定[2]

酸奶樣品中的乙醛在酸性條件下與亞硫酸氫鈉發(fā)生加成反應生成乙醛亞硫酸氫鈉，其剩余的亞硫酸氫鈉被碘氧化。在堿性條件下，乙醛亞硫酸氫鈉與碘定量反應，根據(jù)濃度關(guān)系計算乙醛質(zhì)量濃度。

1.3.4 黏度和胞外多糖質(zhì)量分數(shù)測定

黏度測定采用NDJ-1型旋轉(zhuǎn)黏度計，選擇合適轉(zhuǎn)子測定。

胞外多糖質(zhì)量分數(shù)測定采用硫酸-苯酚法測定粗多糖質(zhì)量分數(shù)[3]。

1.3.5 β-半乳糖苷酶酶活和蛋白酶水解能力測定

β-半乳糖苷酶酶活的測定：超聲細胞破壁技術(shù)提取粗酶液，采用硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）為酶作用底物，生成有色產(chǎn)物ONP，通過比色法來測定[4]。一個酶活力單位(U)定義為在37℃每分鐘釋放1 μmol ONP所需的酶量。

蛋白酶水解能力的測定采用茚三酮法，以水解的氨基酸總量表示(mg/L)[5]。

1.3.6 數(shù)據(jù)的差異性和相關(guān)性分析

采用origin軟件處理數(shù)據(jù)，spss13.0軟件進行相關(guān)性和顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 共生性與混菌最佳培養(yǎng)條件的確定

菌株在質(zhì)量分數(shù)為12%的脫脂乳中培養(yǎng)，稀釋平板計數(shù)確定3菌兩兩共生，這與吳榮榮[6]、趙瑞香[7]等的研究基本一致。

如果酸奶發(fā)酵劑桿菌占優(yōu)勢，產(chǎn)酸過多會影響酸奶的口感和風味，故發(fā)酵劑中球桿菌比例一般為2︰1和1︰1。選擇菌種比例、培養(yǎng)溫度、接種量3個因素作3水平正交實驗L9（33），正交實驗設計與結(jié)果見表1。通過加權(quán)評分法，對產(chǎn)酸、產(chǎn)香、產(chǎn)黏特性給予相同的權(quán)重系數(shù)，即酸度、乙醛質(zhì)量濃度、黏度分別占總評分的1/3，再進行加權(quán)求和，綜合評分Yi=（1/3×Yi1/Yi1max+1/3×Yi2/Yi2max+1/3×Yi3/Yi3max）×100，試驗確定多指標正交實驗的最佳組合為A2B3C3，即V（S.t.）︰V（L.b.）︰V（L.a.）=3︰2︰1，培養(yǎng)溫度為42℃，接菌量為4%，由極差分析可知，因素對試驗指標影響的主次順序是C＞B＞A，即接菌量對產(chǎn)酸、產(chǎn)香、產(chǎn)黏特性影響最大，其次是溫度，菌種比例對其影響最小。有研究表明[8]，混合菌種發(fā)酵的酸奶在風味和保健功能等方面明顯優(yōu)于單一菌種發(fā)酵的酸奶。

表1 L9（33）正交實驗設計與結(jié)果

2.2 發(fā)酵過程中產(chǎn)酸、產(chǎn)香和產(chǎn)黏物質(zhì)的變化與比較

在最佳培養(yǎng)條件下，單、混菌均接種在脫脂乳培養(yǎng)基中，單菌接菌量仍為4%。圖1為不同菌種發(fā)酵過程中活菌數(shù)、酸度、乙醛質(zhì)量濃度變化趨勢。圖1(a)表明單、混菌均在8 h達到對數(shù)生長期，單、混菌活菌數(shù)差異達到極顯著水平（P＜0.01），8 h混菌活菌數(shù)可達108mL-1以上，其中，lg(S.t.):lg(L.a.):lg(L.b.)=8.79∶6.64∶6.10。

由圖1（b）可以看出，單、混菌隨著發(fā)酵時間的延長，酸度均呈上升趨勢，其中0～8 h上升較快，8 h后酸度趨于平穩(wěn)。比較發(fā)現(xiàn)，4 h后同期的單、混菌酸度差異達到極顯著水平（P＜0.01），表明混菌培養(yǎng)可提高酸度，單菌培養(yǎng)中嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸能力較強。

圖1（c）表明，在發(fā)酵過程中，乙醛質(zhì)量濃度均呈上升趨勢，3株單菌中保加利亞乳桿菌乙醛質(zhì)量濃度較高，6 h后同期的單、混菌乙醛質(zhì)量濃度差異達到極顯著水平（P＜0.01），表明乳酸菌共生性可以顯著提高乙醛的產(chǎn)量。有文獻報道[9，10]，主要風味物質(zhì)乙醛多由保加利亞乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生，混合菌株發(fā)酵要比單一菌株發(fā)酵產(chǎn)生的芳香物質(zhì)多。

圖2為不同菌種發(fā)酵過程中黏度、胞外多糖質(zhì)量濃度變化趨勢。單、混菌的黏度隨發(fā)酵時間呈上升趨勢（圖2（a）），0～8 h上升較快。6 h后同期的單、混菌黏度值差異達到極顯著性水平（P＜0.01），表明混菌培養(yǎng)促進粘度的增加，單菌培養(yǎng)高產(chǎn)胞外多糖的嗜熱鏈球菌黏度較高。

由圖2（b）可以看出，胞外多糖的質(zhì)量濃度與黏度變化趨勢相同，其中混菌的胞外多糖質(zhì)量濃度和黏度的相關(guān)系數(shù)R為0.956，達到極顯著水平（P＜0.01），4 h后同期的單、混菌胞外多糖質(zhì)量濃度差異達到極顯著性水平（P＜0.01），結(jié)果表明，混菌胞外多糖質(zhì)量濃度的增多促進了其黏度的增加。高產(chǎn)胞外多糖的菌株所具有的黏性、穩(wěn)定性和持水性功能，可以改善發(fā)酵乳制品的口感、質(zhì)地結(jié)構(gòu)和風味[11]。

2.3 發(fā)酵過程中相關(guān)酶活的變化與比較

β-半乳糖苷酶是乳糖代謝的關(guān)鍵酶，可降低乳糖的含量，解決乳糖不耐癥。圖3為不同菌種發(fā)酵過程中β-半乳糖苷酶酶活、蛋白酶水解能力變化趨勢。

由圖3（a）可知，不同菌種在發(fā)酵過程中0～8 h乳糖酶活力上升較快。4 h后同期的單、混菌β-半乳糖苷酶活力差異達到極顯著水平（P＜0.01），混菌β-半乳糖苷酶酶活8h達到最大值0.148 U/mL。單菌培養(yǎng)β-半乳糖苷酶酶活差異不顯著。

適度的蛋白酶水解對改善酸乳的質(zhì)地和風味是必要的，由圖3（b）可看出，蛋白酶水解生成氨基酸量隨著發(fā)酵時間的延長而增加，0～8 h上升趨勢明顯，8 h后同期單、混菌的蛋白酶水解氨基酸含量差異達到極顯著水平（P＜0.01），表明混菌的共生性促進蛋白酶水解生成氨基酸。單菌培養(yǎng)中保加利亞乳桿菌蛋白酶的水解能力最強，有文獻報道[12,13]，保加利亞乳桿菌蛋白酶具有很強的蛋白水解能力,將大量的蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生氨基酸促進了嗜熱鏈球菌和嗜酸乳桿菌的生長。

2.4 酶活與產(chǎn)酸、產(chǎn)香和產(chǎn)黏特性的相關(guān)性

表2為混菌在發(fā)酵過程中各指標的相關(guān)系數(shù)?；炀诎l(fā)酵過程中，酸度與活菌數(shù)的相關(guān)性系數(shù)為0.987（P＜0.01），乙醛質(zhì)量濃度與酸度的相關(guān)系數(shù)達0.990（P＜0.01），乙醛質(zhì)量濃度與活菌數(shù)的相關(guān)系數(shù)達0.990（P＜0.01），乙醛產(chǎn)量主要集中在8 h后的活菌對數(shù)生長期；蛋白酶水解能力與酸度和乙醛質(zhì)量濃度的相關(guān)系數(shù)R分別高達0.996和0.992（P＜0.01）。有研究表明[14]，蛋白酶水解產(chǎn)生的氨基酸是乙醛合成的前體物質(zhì)，蛋白酶水解能力強則乙醛合成量多，這與試驗結(jié)果相符；0～8 h混菌培養(yǎng)所產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶酶活與酸度的相關(guān)系數(shù)R高達0.992，β-半乳糖苷酶能水解乳糖產(chǎn)生乳酸，該酶活性高則產(chǎn)生乳酸快，而8 h后兩者的相關(guān)性系數(shù)降低，這是由于乳酸過高會抑制β-半乳糖苷酶的活性，活性下降，但仍催化乳糖生成乳酸，只是乳酸的生成速度降低[15，16]。

表2 混菌各指標的相關(guān)系數(shù)

3 結(jié)論

（1）高產(chǎn)胞外多糖的嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌能夠兩兩共生；混菌的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度42℃，接菌量4%，V（S.t.）︰V（L.b.）︰V（L.a.）=3︰2︰1；因素對試驗綜合指標影響的主次順序是：接菌量＞溫度＞菌種比例。

（2）在混菌最佳培養(yǎng)條件下，酸度、乙醛質(zhì)量濃度、黏度、胞外多糖質(zhì)量濃度、蛋白酶水解能力隨發(fā)酵時間的延長呈上升趨勢，混菌與同期單菌的指標差異達到極顯著水平（P＜0.01），表明：混菌培養(yǎng)顯著提高了其產(chǎn)酸、產(chǎn)香、產(chǎn)黏特性。其中，嗜熱鏈球菌產(chǎn)粘特性較好，保加利亞乳桿菌產(chǎn)香特性較好，嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸較強。

（3）在混菌發(fā)酵過程中，活菌數(shù)與酸度、乙醛質(zhì)量濃度；所產(chǎn)乳酸菌胞外多糖與黏度；β-半乳糖苷酶酶活與酸度；蛋白酶酶活與酸度、乙醛質(zhì)量濃度的相關(guān)性系數(shù)較高。

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Study on the mixed cultivated properties of high exopolysacchride-producing Streotococcus thermophillus

MA Yan1,CHEN Li-jun2,WANG Chang-lu3,MU Guang-qing1,CHEN Xiao-xuan1
（1.School of Food Technology,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China;2.Technology Center;Beijing Sanyuan Foods Co.Ltd.，Beijing 100085,China;3.College of Food Engineering and Biotechnology;Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

The aim of this research is to study the acidity,acetaldehyde and viscosity of mixed cultivation with high exopolysaccharides-producing Streptococcus thermophilus.The optimal fermentation conditions with mixed cultivation are:42℃,inoculation size 4%(v/v),the strains matching ratio of high exopolysaccharides-producing Streptococcus thermophilus,Lactobacillus bulgaricus and Lactobacillus acidophilus is 3∶2∶1 according to acidity,content of acetaldehyde and viscosity.On this condition,mixed cultivation of Lactic acid bacteria significantly improve acidity,acetaldehyde content,viscosity,exopolysaccharide(EPS),the activity of β-galactosidase and protease（P＜0.01).The correlative modulus of EPS and viscosity,the activity of β-galactosidase and acidity,the activity of protease and acidity,acetaldehyde content is high.

Exopolysaccharide(EPS);mixed cultivation;acidity;viscosity

Q93-335

A

1001-2230（2011）01-0015-04

2010-09-07

遼寧省教育廳創(chuàng)新團隊項目（2009T013）。

馬艷（1984-），女，碩士研究生，研究方向為微生物資源與利用。

牟光慶