烏司他丁對(duì)機(jī)械通氣致肺損傷大鼠肺組織CC16表達(dá)的影響

王曉艷，張新日

(1.山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030001;2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸科，太原 030001)

烏司他丁對(duì)機(jī)械通氣致肺損傷大鼠肺組織CC16表達(dá)的影響

王曉艷1，張新日2

(1.山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030001;2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸科，太原 030001)

目的 通過(guò)觀察烏司他丁(UTI)對(duì)大潮氣量機(jī)械通氣大鼠肺組織Clara細(xì)胞分泌蛋白(CC16)表達(dá)的影響，探討CC16在機(jī)械通氣所致肺損傷(VILI)發(fā)病中作用以及UTI對(duì)VILI的干預(yù)作用。方法 24只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、大潮氣量組和UTI干預(yù)組，觀察其肺組織病理學(xué)改變，測(cè)定肺組織中丙二醛(MDA)和BALF中總蛋白(TP)含量，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)肺組織CC16 mRNA的表達(dá)，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肺組織中CC16蛋白表達(dá)及Clara細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果 與對(duì)照組比較，大潮氣量肺組織MDA的含量及BALF總蛋白含量明顯升高(P＜0.01)，而肺細(xì)支氣管上皮細(xì)胞CC16mRNA及其蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01);與大潮氣量組比較，UTI干預(yù)組大鼠肺組織中MDA的含量及BALF總蛋白含量明顯降低(P＜0.01)，而肺細(xì)支氣管上皮細(xì)胞CC16mRNA及其蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.01)。結(jié)論 大潮氣量機(jī)械通氣導(dǎo)致肺組織CC16 mRNA及其蛋白表達(dá)水平降低在VILI發(fā)病中起重要作用，烏司他丁不但能促進(jìn)Clara細(xì)胞分泌CC16而抑制肺組織炎癥反應(yīng)，還能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，對(duì)VILI有一定保護(hù)作用。

機(jī)械通氣;急性肺損傷;CC16;烏司他丁

大量研究表明，多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子參與了機(jī)械通氣所致肺損傷(VILI)的發(fā)病過(guò)程，其機(jī)制仍不十分清楚。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Clara細(xì)胞分泌蛋白——CC16具有抗炎、抗氧化、抗纖維化等多種生物活性，但其是否參與VILI的發(fā)病過(guò)程目前尚未見(jiàn)到文獻(xiàn)報(bào)道。烏司他丁(UTI)是一種廣譜蛋白酶抑制劑，能抑制炎癥介質(zhì)和氧自由基的產(chǎn)生和釋放，在臨床上主要用于DIC、休克和急性胰腺炎等疾病的治療，但有關(guān)UTI對(duì)VILI時(shí)炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子影響的研究報(bào)道甚少。本文擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察大潮氣量機(jī)械通氣大鼠肺組織CC16的表達(dá)水平，以及UTI對(duì)其表達(dá)的影響，探討UTI對(duì)VILI的干預(yù)作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組及模型制備

取成年雄性 Wister大鼠24只(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí) 合格證號(hào)：SCXK2009-0001)，體重300～380 g，隨機(jī)分為3組：①對(duì)照組：未行機(jī)械通氣;②大潮氣量組：VT30 mL/kg，通氣前3 d開(kāi)始每天上午及通氣后1小時(shí)經(jīng)腹腔注入生理鹽水3 mL;③烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品)組：VT30 mL/kg，通氣前3 d開(kāi)始每天上午及通氣后1 h經(jīng)腹腔注入U(xiǎn)TI 3 mL(10萬(wàn)U/kg)。

25%烏拉坦4 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠后行氣管切開(kāi)。除對(duì)照組外，其余各組大鼠均通過(guò)三通管與動(dòng)物人工呼吸機(jī)(DH-150型，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠制造)相連接行機(jī)械通氣。各組大鼠的通氣參數(shù)除潮氣量外，其余參數(shù)均相同，即 RR：60次/min，I/E：1/3，F(xiàn)iO2：21% 。通氣時(shí)間為 120 min。

1.2 BALF及肺組織標(biāo)本采集與處理

通氣結(jié)束后經(jīng)腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，暴露氣管及肺臟，結(jié)扎右主支氣管，用生理鹽水反復(fù)灌洗左肺(4 mL×3次)，灌洗液(BALF)回收率達(dá)75%以上。將收集到的 BALF離心(3 000 r/min，10 min，r=10 cm)后。取上清液 -20℃凍存待檢。取部分右肺組織，用10%的甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。另取部分新鮮肺組織，-70℃保存，用于提取肺組織總RNA以及測(cè)定肺組織MDA含量。

1.3 肺組織MDA含量測(cè)定

采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定大鼠肺組織中丙二醛(MDA)含量。測(cè)定方法及操作步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4 BALF中總蛋白含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定BALF中總蛋白含量，操作步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.5 肺組織CC16免疫組織化學(xué)染色及Clara細(xì)胞計(jì)數(shù)

采用鏈霉素親和-生物素-過(guò)氧化酶復(fù)合物(SABC)法測(cè)定大鼠肺組織CC16蛋白表達(dá)，具體操作步驟參照試劑盒說(shuō)明(試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物有限公司)進(jìn)行。兔抗大鼠抗體工作濃度為1：50，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。

結(jié)果判斷：陽(yáng)性染色為細(xì)胞胞漿呈棕黃色，染色陽(yáng)性細(xì)胞即為Clara細(xì)胞。在400倍光鏡下對(duì)每張組織切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察。采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)每個(gè)視野的光密度值，以上述5個(gè)視野的平均值作為該大鼠肺組織CC16蛋白表達(dá)的相對(duì)含量。在高倍鏡下(×400)對(duì)每張組織切片隨機(jī)選擇4個(gè)終末或呼吸性細(xì)支氣管，計(jì)算Clara細(xì)胞占細(xì)支氣管上皮細(xì)胞總數(shù)的百分比。

1.6 肺組織CC16mRNA測(cè)定

肺組織CC16mRNA水平的檢測(cè)依照一步法RT-PCR試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)操作指南，以提取的大鼠肺組織總RNA作為模板，上游引物：5′-tgaagaggctggtggatacc-3′，下游引物：5′-ttggtgtagggaggtcaagg-3′。反應(yīng)條件為：反轉(zhuǎn)錄50℃，30min，滅活 反轉(zhuǎn)錄 酶 94℃，2min，預(yù) 變性94℃，30s，54℃ 退火、延伸 72℃，4 min，共 32 個(gè)循環(huán)。內(nèi)參照為磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，上游引物：5′-tgaacgggaagctcactgg-3′，下 游 引 物： 5′-tccaccaccctgttgctgta-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物在 2%瓊脂糖凝膠(0.5μg/mL溴化乙錠)中進(jìn)行電泳，片段分別為185 bp和307 bp，用Bio-Rad凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析，mRNA相對(duì)含量由CC16與GAPDH吸光度值×面積的比值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組間差異比較采用方差分析法，各組均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組肺組織MDA含量及BALF中總蛋白含量(ˉx±s)Tab.1The levels of MDA in the lung and total protein in BALF groups(ˉx±s)

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織HE染色結(jié)果

HE染色高倍鏡下觀察，對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)和各級(jí)支氣管上皮完整，肺泡間隔正常，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。大潮氣量組可見(jiàn)彌漫性肺間質(zhì)水腫和大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡破裂融合，肺泡腔內(nèi)有少量出血，UTI組可見(jiàn)肺間質(zhì)水腫和少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔結(jié)構(gòu)基本完整，肺損傷程度較大潮氣量組明顯減輕(圖1～3見(jiàn)封二)。

圖7 各組CC16、GAPDH mRNA電泳圖M：marker;A：UTI pretreatment group;B：High tidal volume ventilation group;C：Control groupFig.7 Electrophoresis figure of CC16mRNA and GAPDH mRNA in groups

2.2 肺組織MDA含量和BALF總蛋白含量測(cè)定

各組大鼠肺組織MDA和BALF總蛋白含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示：大潮氣量組大鼠肺組織MDA含量和BALF總蛋白含量明顯高于對(duì)照組和UTI干預(yù)組(均 P＜0.01);UTI干預(yù)組大鼠肺組織MDA含量和BALF總蛋白含量雖高于對(duì)照組，但較大潮氣量組明顯降低(均P＜0.01)。

2.3 肺組織CC16mRNA及其蛋白表達(dá)及Clara細(xì)胞百分比測(cè)定

各組大鼠肺組織CC16mRNA及其蛋白及Clara細(xì)胞百分比測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2和圖4～7(圖4～6見(jiàn)封二)。結(jié)果顯示：大潮氣量組大鼠肺組織CC16mRNA及其蛋白表達(dá)及Clara細(xì)胞百分比明顯低于對(duì)照組和 UTI干預(yù)組(均 P＜0.01);UTI干預(yù)組大鼠肺組織CC16mRNA及其蛋白表達(dá)及Clara細(xì)胞百分比雖低于對(duì)照組，但較大潮氣量組明顯增高(均 P＜0.01)。

3 討論

呼吸機(jī)所致肺生物傷或炎癥性損傷是機(jī)械通氣的嚴(yán)重并發(fā)癥，也是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)和難題。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Clara細(xì)胞分泌蛋白——CC16具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)及抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)活性，但其是否參與VILI的發(fā)病過(guò)程目前尚未見(jiàn)到文獻(xiàn)報(bào)道。

Clara細(xì)胞是排列在肺細(xì)支氣管黏膜上的一種非纖毛上皮細(xì)胞，具有分泌功能。1881年，Kolliker首先發(fā)現(xiàn)了這類(lèi)細(xì)胞。1937年Max Clara描述了這類(lèi)細(xì)胞的形態(tài)特征，同時(shí)以他的名字命名。Clara細(xì)胞分泌的主要物質(zhì)之一是Clara細(xì)胞分泌蛋白(CCSP)，因其相對(duì)分子量為 15840，故稱(chēng)為 CC16。近年來(lái)隨著對(duì) CC16研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)CC16不但具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種生物功能，而且與急性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，是肺組織特異性表達(dá)的一種內(nèi)源性抗炎因子。

表2 各組肺組織CC16mRNA及其蛋白及Clara細(xì)胞百分比(ˉx±s)Tab.1The expression of CC16 and protein in lung and the percentage of Clara cells in groups(ˉx±s)

目前認(rèn)為CC16是急性肺損傷的一個(gè)新的生物標(biāo)志物［1］。急性肺損傷時(shí)細(xì)胞內(nèi) NF-кB常發(fā)生活化，NF-кB活化后可上調(diào)多種細(xì)胞因子，如 TGF-β1、TNF、IL-8等的表達(dá)，但對(duì) CC16基因轉(zhuǎn)錄卻具有抑制作用，導(dǎo)致Clara細(xì)胞中CC16含量減少［2］。CC16減少后削弱了對(duì) PLA2的抑制作用［3］，使花生四烯酸類(lèi)促炎細(xì)胞因子生成增多，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞大量聚集活化，分泌大量炎癥介質(zhì)而引起肺組織損傷。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)［4］，CC16缺陷大鼠在感染病毒或接受抗原刺激時(shí)比野生鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，而給予重組人 CC16后其炎癥反應(yīng)可明顯減輕，說(shuō)明CC16在抗炎作用中扮演著重要角色。本研究結(jié)果顯示，大潮氣量組大鼠肺組織可見(jiàn)彌漫性肺間質(zhì)水腫和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，BALF總蛋白含量明顯高于對(duì)照組，而肺組織CC16mRNA及其蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，提示大潮氣量機(jī)械通氣所引起的急性肺損傷與CC16表達(dá)減少有一定關(guān)系。因此，通過(guò)上調(diào)CC16的表達(dá)可抑制肺組織炎癥細(xì)胞發(fā)生活化，減少炎癥介質(zhì)的釋放，對(duì)VILI應(yīng)具有保護(hù)作用。

烏司他丁是一種廣譜酶抑制劑，能穩(wěn)定溶酶體膜，抑制溶酶體酶釋放，清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)的釋放，近年來(lái)廣泛用于ALI/ARDS的治療，收到一定效果。譚朝華等［5］通過(guò)對(duì)油酸致急性肺損傷動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，烏司他丁對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生具有明顯抑制作用。Okumura等［6］研究發(fā)現(xiàn)，UTI不但能抑制脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，還能抑制PMN在肺組織內(nèi)聚集活化。Abe等［7］研究發(fā)現(xiàn)，UTI可通過(guò)上調(diào)抗炎因子(IL-10)的表達(dá)和清除肺組織內(nèi)氧自由基而發(fā)揮抗損傷作用。本研究結(jié)果顯示，UTI干預(yù)組大鼠肺組織CC16mRNA及其蛋白表達(dá)水平明顯高于大潮氣量組，而肺組織 MDA含量和BALF總蛋白含量較大潮氣量組明顯減少，同時(shí)肺組織充血、出血、滲出和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷改變亦明顯減輕，說(shuō)明UTI對(duì)VILI具有一定防治作用。其機(jī)制包括兩方面：①通過(guò)上調(diào)CC16的表達(dá)而抑制炎癥細(xì)胞在肺內(nèi)聚集、活化和釋放炎癥介質(zhì);②通過(guò)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)而減少肺內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生。

綜上所述，肺組織Clara細(xì)胞數(shù)量及CC16含量減少與VILI發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。UTI一方面可通過(guò)促進(jìn)CC16的合成而抑制肺組織炎癥反應(yīng)，另一方面又可通過(guò)抑制氧自由基的釋放而減輕肺組織氧化性損傷，因而對(duì) VILI的臨床防治具有積極作用。

［1］ McAuley DM，Belfast UK，Michael A，et al.Clara cell protein CC16 a new lung epithelial biomarker for acute lung injury［J］.CHEST，2009，135(6)：1408-1410.

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Effects of Ulinastatin on the Expression of Clara cell Secretory Protein(CC16)in the Rat Lung in High Tidal Volume Mechanical Ventilation

WANG Xiao-yan1，ZHANG Xin-ri2
(1.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China;2.Department of Respiratory Medicine，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

Objective To explore the role of ulinastatin(UTI)in the treatment course of ventilator-induced lung injury(VILI)by investigating the effect of UTI on expression of Clara cell secretory protein(CC16)in the lung of rats in high tidal volume mechanical ventilation.Methods Twenty-four male Wistar rats were randomly divided into three groups：control group，high tidal volume ventilation group and UTI pretreatment group.The levels of MDA in the lung and total protein in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were measured.The expression of CC16 mRNA in the lung was detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).The number of Clara cells and synthesis of CC16 were detected by immunohistochemistry.Results Comparing with the control group，the levels of MDA in lung and total proteinin bronchoalveolar lavage fluid were very significantly increased(P＜0.01)in the high tidal volume ventilation group，and the expression of CC16 was significantly decreased(P ＜ 0.01).Comparing with the high tidal volumeventilation group，the levels of MDA in the lung and total protein in bronchoalveolar lavage fluid were significantly decreased(P ＜0.01)in the UTI-pretreatment group，and the expression of CC16 mRNA and protein increased significantly.Conclusions CC16 plays an important role in ventilator-induced lung injury(VILI).The expression of CC16 mRNA and protein are reduced in a VILI rat model.Ulinastatin may effectively prevent the inflammatory process and ventilator-induced lung injury by increasing the level of CC16 and inhibit the lipid peroxidation.

Mechanical ventilation;Acute lung injury;CC16;Ulinastatin;Rat

R33

A

1671-7856(2011)04-0024-04

2010-11-12

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.04.004.006

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目，2007032016-1;太原市科技項(xiàng)目計(jì)劃任務(wù)書(shū)，0801041)。

王曉艷(1985-)，女，碩士，主要研究方向：機(jī)械通氣與肺損傷。Email：wxiaoxiao85@163.com。

張新日，碩士生導(dǎo)師，Email：ykdzxr61@yahoo.com.cn。