SHIV1157ipd3N4中國恒河猴細胞適應株靜脈感染中國恒河猴有效濃度的確定

叢 喆，蔣 虹，金 光，陳 霆，王 衛(wèi)，陶 真，姚 南，熊 競，吳芳新，陳志偉，魏 強

(1.中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021;2.香港大學李嘉誠醫(yī)學院艾滋病研究所，香港 999077)

SHIV1157ipd3N4中國恒河猴細胞適應株靜脈感染中國恒河猴有效濃度的確定

叢 喆1，蔣 虹1，金 光1，陳 霆1，王 衛(wèi)1，陶 真1，姚 南1，熊 競1，吳芳新1，陳志偉2，魏 強1

(1.中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021;2.香港大學李嘉誠醫(yī)學院艾滋病研究所，香港 999077)

目的 確定SHIV1157ipd3N4靜脈途徑感染中國恒河猴的有效病毒濃度，明確SHIV1157ipd3N4感染實驗猴體內病毒復制和免疫損傷情況。方法 10只正常中國恒河猴分成6組，分別用10倍系列稀釋的病毒液1 mL靜脈感染，測定血漿病毒載量，CD4+/CD8+，CD4+T淋巴細胞絕對數(shù)，分析感染后恒河猴體內病毒復制和免疫損傷情況。結果 5TCID50/mL以上濃度的SHIV1157ipd3N4能通過靜脈途徑感染中國恒河猴。結論 該實驗的成功進行為SHIV/中國恒河猴疾病及評價模型的建立奠定了良好的基礎，為今后使用此模型評價抗病毒藥物或疫苗提供了條件。

SHIV1157ipd3N4;中國恒河猴;模型，動物;AIDS

R.M.Ruprecht以SHIVKB9為骨架構建了表達HIV-1 C亞型 env的 SHIV-1157i，并經靜脈途徑感染印度恒河猴得到 SHIV1157ipd3N4［1，2］。它所具有高度復制能力的、CCR5受體嗜性、經黏膜傳播這些特性，使它在研究HIV感染和發(fā)病機制及評價AIDS候選疫苗的功效方面具有重要的現(xiàn)實意義。SHIV1157ipd3N4能通過靜脈途徑成功感染印度恒河猴，黏膜途徑感染印度恒河猴、豬尾猴和中國恒河猴［3-4］，但其靜脈感染中國恒河猴的有效濃度、疾病進程及所引發(fā)的病毒免疫指標有哪些變化，與黏膜途徑感染引起的變化又是否相同呢?本研究旨在明確SHIV1157ipd3N4在中國恒河猴體內感染的有效濃度及在病毒學和免疫學等方面的變化，為今后此模型在我國的應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

中國恒河猴10只，購自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所［SCXK(京)2005-2005］，用商品化膨化飼料飼養(yǎng)，體重3～5 kg。經間接免疫熒光法(IFA)檢測排除相關慢病毒(SIV、SRV-1，2，5、STLV-1)感染。

1.2 病毒

感染毒株為SHIV1157ipd3N4，本實驗室擴增制備，批號為 20090706。中國恒河猴 PBMCs滴定TCID50滴度為 5×102TCID50/mL。

1.3 分組設計及感染方法

10只恒河猴隨機分為6個劑量組，由10-1至10-6，分別經后肢靜脈感染稀釋好的病毒液1 mL。G1005V、G1006V、G1007V (10-1，50TCID50)，G1008V、G1009V 、G1010V(10-2，5TCID50)，G1011V、G1012V、G1013V(10-3，0.5TCID50)，G1014V(10-4，0.05TCID50)。

1.4 樣品采集和指標測定

在感染前和感染后 7、14、21、28、42、56、70 及84 d采集EDTA抗凝血4 mL，分別測定血常規(guī)、血漿病毒載量、CD4+/CD8+、CD4+細胞絕對數(shù)和血漿結合抗體水平。

1.5 SHIV1157ipd3N4感染恒河猴外周血病毒載量的檢測

TRIzol法提取血漿中病毒 RNA，Quantitect SYBR Green RT-PCR Kit(Qiagen，204243)測定血漿病毒 RNA 載量［5］。

1.6 SHIV1157ipd3N4感染恒河猴CD4+T細胞絕對數(shù)檢測

測定外周血中 CD4+/CD8+比值，根據(jù)血常規(guī)結果，計算出CD4+T細胞絕對數(shù)［6］。

1.7 SHIV1157ipd3N4感染恒河猴外周血總結合抗體滴度檢測

恒河猴血漿樣品滅活后系列稀釋，用“人類免疫缺陷病毒抗體診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)”(生物梅里埃，A4 4284018-86)檢測交叉性體液免疫反應，高于Cut-off值的最大血漿稀釋度定義為SHIV特異性總結合抗體滴度［7］。

圖1 10倍系列稀釋SHIV1157ipd3N4靜脈感染中國恒河猴外周血病毒載量結果Fig.1 The viremia(viral RNA copies/mL plasma)in the Chinese-origin rhesus macaques infected intravenously with 10-fold dilution of SHIV1157ipd3N4

2 結果

2.1 SHIV1157ipd3N4靜脈感染恒河猴外周血病毒載量結果

50 TCID50感染猴中G1005V和G1007V均在感染后7 d就檢出血漿病毒載量，G1006V也在14 d陽轉。5 TCID50感染猴 G1008V、G1009V、G1010V 的血漿病毒載量則均出現(xiàn)在感染后14 d。

6只感染猴高峰期的載量都在105～107copies/mL之間，42 d后載量水平均有所下降，但隨后反彈。0.5 TCID50和 0.05 TCID50感染猴 G1011V、G1012V、G1013V、G1014V在實驗期間未出現(xiàn)血漿病毒載量。

2.2 SHIV1157ipd3N4靜脈感染恒河猴CD4+/CD8+比值結果

50 TCID50感染猴 G1005V、G1006V、G1007V 在感染后21 d均有下降，隨后反彈。5 TCID50感染猴中除G1010V外，G1008V和G1010V也在21 d下降并反彈。G1009V則不降反升，但它在56 d有一次大幅下降，但也仍然在 1以上。0.5TCID50和0.05TCID50感 染 猴 G1011V、G1012V、G1013V、G1014V在實驗期間基本保持恒定(圖2)。

2.3 SHIV1157ipd3N4靜脈感染恒河猴CD4+細胞絕對數(shù)結果

各劑量組之間在CD4+T細胞絕對數(shù)上變化基本相同。感染猴中除了50 TCID50感染猴 G1007V和5 TCID50感染猴 G1008V在實驗后期有升高外，其它4只在整個實驗期間基本保持水平。未感染的4只實驗猴則整體呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(圖3)。

2.4 SHIV1157ipd3N4靜脈感染恒河猴外周血總結合抗體滴度測定

50 TCID50感染猴G1005V和G1007V的抗體在感染后21 d就出現(xiàn)了，另一只感染猴G1006V也在28 d陽轉。與此同時，5 TCID50感染猴中只有G1009V在21 d抗體陽性，其它兩只感染猴G1008V和G1010V抗體陽轉時間為42 d。42 d以后，6只感染猴之間的抗體水平逐漸接近了。0.5 TCID50和0.05 TCID50感 染 猴 G1011V、G1012V、G1013V、G1014V在實驗期間未檢出抗體(圖4)。

圖2 10倍系列稀釋SHIV1157ipd3N4靜脈感染中國恒河猴外周血CD4+/CD8+T淋巴細胞比值Fig.2 The changes of CD4+/CD8+ratio of T lymphocytes in the Chinese-origin rhesus macaques infected intravenously with 10-fold dilution of SHIV1157ipd3N4

圖3 10倍系列稀釋SHIV1157ipd3N4靜脈感染中國恒河猴外周血CD4+T淋巴細胞絕對數(shù)Fig.3 The CD4+T cell counts(per l blood)in the Chinese-origin rhesus macaques infected intravenously with 10-fold dilution of SHIV1157ipd3N4

圖4 10倍系列稀釋SHIV1157ipd3N4靜脈感染中國恒河猴外周血總結合抗體滴度Fig.4 The titers of Ab in the Chinese-origin rhesus macaques infected intravenously with 10-fold dilution of SHIV1157ipd3N4

3 討論

SHIV1157ipd3N4。具有高度復制能力、CCR5受體嗜性和經黏膜傳播的特性，使它在研究HIV感染和發(fā)病機制及評價AIDS候選疫苗的功效方面具有重要的現(xiàn)實意義。

本實驗室利用中國恒河猴PBMCs制備了一批SHIV1157ipd3N4的細胞適應株，本研究旨在明確該批次SHIV1157ipd3N4細胞適應株靜脈途徑感染中國恒河猴的有效濃度及在病毒學和免疫學等方面的變化，為今后此模型在我國的應用奠定基礎。

本次研究中，我們使用中國恒河猴PBMCs對病毒的毒力進行了滴定。根據(jù)滴定的結果，使用4個10倍系列稀釋的病毒劑量感染中國恒河猴，通過其血漿病毒載量、CD4+/CD8+比值及CD4+細胞絕對數(shù)的測定，來確定該病毒感染中國恒河猴的感染劑量范圍及感染情況。由于動物數(shù)量有限，為了明確劑量效應關系，我們采取了10倍系列稀釋病毒的策略，拉大了各組之間的病毒劑量范圍。并且對可能感染的實驗組，各使用了3只實驗猴，理論上不能被感染的10-4稀釋度，只用了一只實驗猴。結果證明，我們這樣安排是可行的。10-1到 10-2的感染猴，即 50 TCID50到 5 TCID50SHIV1157ipd3N4感染的實驗猴均成功建立了系統(tǒng)性感染，而10-3和10-4的感染猴則沒有被感染。根據(jù)病毒滴定的結果，1 mL 10-3和10-4稀釋度的病毒液中只含有 0.5 TCID50和0.05 TCID50的病毒，理論上不可能感染動物，因此目前這個結果和病毒滴定的結果是相符合的，從另一個側面也證明了病毒滴定的準確性。

與SHIVSF162p3靜脈感染猴結果略有不同，各不同劑量組陽性猴的病毒、免疫等各項指標沒有顯示出很明顯的量效關系，除高劑量組(50 TCID50)的血漿病毒載量出現(xiàn)得比低劑量組(5 TCID50)略早幾天外，載量的峰值及持續(xù)時間都沒有依照病毒濃度的高低，有相應的變化。各組感染猴高峰期的載量都在105～107copies/mL之間，CD4+/CD8+的變化也基本相同。與未感染猴不同的是，絕大多數(shù)感染猴在感染高峰期還是有一個CD4+/CD8+的下降，雖然過程很短暫，與此同時，各組之間外周血CD4+T細胞的絕對數(shù)的變化趨勢相同，均沒有明顯的下降。這點也符合之前的報道，對于 CCR5-SHIV來說，CD4+T細胞的減少主要發(fā)生在外周免疫器官，如腸道的派氏淋巴結等，而在外周血中這種變化不明顯。

本研究中，我們還注意了靜脈感染早期外周血中總結合抗體滴度的變化和攻毒劑量之間的關系。結果表明，高劑量組(50 TCID50)的抗體出現(xiàn)得比低劑量組(5 TCID50)略早幾天，且抗體水平增長得要快一些，但到了感染后期這種差距就消失了，基本都穩(wěn)定在一個水平上了。這也說明，在感染早期，機體體液免疫的水平和消長與攻擊病毒的劑量有一定的關系，一旦建立了系統(tǒng)性感染，這種區(qū)別就不存在了。

SHIV1157ipd3N4能通過靜脈途徑成功感染印度恒河猴，黏膜途徑感染印度恒河猴、豬尾猴和中國恒河猴，但其靜脈感染中國恒河猴的有效濃度、疾病進程及所引發(fā)的病毒免疫指標有哪些變化，與黏膜途徑感染引起的變化又是否相同呢?本研究旨在明確SHIV1157ipd3N4在中國恒河猴體內感染的有效濃度及在病毒學和免疫學等方面的變化，為今后此模型在我國的應用奠定基礎。

總之，通過本次靜脈感染中國恒河猴研究，我們成功滴定了本批次 SHIV1157ipd3N4，掌握了SHIV1157ipd3N4在恒河猴體內的消長規(guī)律，今后可根據(jù)具體的實驗目的選擇合適劑量的SHIV1157ipd3N4建立靜脈感染模型，進行 AIDS疫苗評價。

［1］ Song RJ，Chenine AL，Rasmussen RA，et al.Molecularly Cloned SHIV-1157ipd3N4： a highly replication competent，mucosally transmissible R5 simian-human immunodeficiency virus encoding HIV Clade C env［J］.J Virol，2006，80(17)：8729-8738.

［2］ Humbert M，Rasmussen RA，Song RJ，et al.SHIV-1157i and passaged progeny viruses encoding R5 HIV-1 clade C env cause AIDS in rhesus monkeys［J］.Retrovirology，2008，5： 94.Published online 2008 October 17.doi：10.1186/1742-4690-5-94.

［3］ Ho O，Larsen K，Polacino P，et al.Pathogenic infection of Macaca nemestrina with a CCR5-tropic subtype-C simian-human immunodeficiency virus［J］.Retrovirology，2009，6：65.

［4］ Chenine AL， SiddappaNB， KramerVG， etal.Relative transmissibility of an R5 clade C simian-human immunodeficiency virus across different mucosae in macaques parallels the relative risks of sexual HIV-1 transmission in humans via different routes［J］.J Infect Dis，2010，201(8)：1155-1163.

［5］ 叢喆，李兆忠，魏強，等.SYBR GreenⅠ實時熒光定量RTPCR測定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷貝數(shù)方法的建立［J］.中國實驗動物學報，2006，14(4)：271-275.

［6］ 王衛(wèi)，劉強，許琰，等.SHIV-KB9感染中國恒河猴有效濃度的確定［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2007，17(2)：67-71.

［7］ 張月娟，褚國方.ELISA檢測HIV抗體室內質控血漿的使用與分析［J］.職業(yè)與健康，2007，23(4)：268-269.

Titration of a SHIV1157ipd3N4 Stock by Intravenous Inoculation of Chinese-Origin Rhesus Macaques

CONG Zhe1，JIANG Hong1，JIN Guang1，CHEN Ting1，WANG Wei1，TAO Zhen1，YAO Nan1，XIONG Jing1，WU Fang-xin1，CHEN Zhi-wei2，WEI Qiang1
(1.Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Disease Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China;2.AIDS Institute，Li Ka Shing Faculty of Medicine，The University of Hong Kong，Hong Kong 999077，China)

Objective To determine the viral concentration of SHIV1157ipd3N4 to infect Chinese-origin rhesus macaques intravenously，and to clarify the viral replication and immunological impairment in the monkeys after SHIV1157ipd3N4 inoculation.Methods 10 Chinese-origin rhesus macaques were used in this study.Firstly，all the monkeys were screened by serological test to ensure that they were free of SIV，SRV，and STLV.Then they were infected with 1 mL of 10-fold serial dilution of SHIV1157ipd3N4 separately.Finally to make blood routine examination and measure the viral loads of the monkeys by real-time RT-PCR.Results More than 5 TCID50/mL of SHIV1157ipd3N4 can infect the Chinese-origin rhesus macaques i.v.successfully.Conclusions Our findings of this study provide a firm basis for establishing a SHIV1157ipd3N4 infection model of Chinese rhesus macaques intravenously.This model would be very usefulfor HIV-1 subtype C vaccine and pathogenesis studies.

SHIV1157ipd3N4;Chinese-origin rhesus macaques;Animal model;AIDS

R33

A

1671-7856(2011)04-0012-04

2010-10-08

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.04.003

國家十一五科技重大專項課題 (2009ZX10004-402，2008ZX10001-015-10)。

叢喆，碩士，副主任技師，從事實驗動物病毒分子生物學和模型研究工作。

魏強，教授，博士導師，研究方向：實驗動物病毒學。E-mail：weiqiang0430@sohu.com。