工程大腸桿菌脂肪酸胞外分泌調(diào)控研究進展

孟 鑫，程 濤,2，李良智，楊建明，劉 煒，徐 鑫，咸 漠,*

(1.中國科學院青島生物能源與過程研究所，山東 青島 266101；2.江西理工大學材料與化學工程學院，江西 贛州 341000)

工程大腸桿菌脂肪酸胞外分泌調(diào)控研究進展

孟 鑫1，程 濤1,2，李良智1，楊建明1，劉 煒1，徐 鑫1，咸 漠1,*

(1.中國科學院青島生物能源與過程研究所，山東 青島 266101；2.江西理工大學材料與化學工程學院，江西 贛州 341000)

天然產(chǎn)油微生物產(chǎn)生的脂肪酸多以甘油三酯形式貯存在細胞內(nèi)，需要從細胞內(nèi)提取，工藝復雜、生產(chǎn)成本高，且嚴重污染環(huán)境。工程大腸桿菌定向調(diào)控生產(chǎn)游離脂肪酸已成為近年來的研究熱點，是緩解能源危機，提供優(yōu)質(zhì)、低成本油脂原料的有效途徑。本文從大腸桿菌脂肪酸胞外分泌相關基因(tesA、fadD、fadL)和調(diào)控蛋白(MsbA)兩個方面綜述脂肪酸胞外分泌調(diào)控研究進展，并提出了利用分子生物學和代謝工程手段對大腸桿菌脂肪酸代謝定向調(diào)控，生產(chǎn)胞外游離脂肪酸的新的研究方向。

脂肪酸；代謝調(diào)控；轉(zhuǎn)運

脂肪酸是一種重要的平臺化合物，廣泛應用于工業(yè)、食品、醫(yī)藥、保健品等諸多方面，尤其是作為油脂原料在生物柴油(脂肪酸甲酯)生產(chǎn)中應用[1]。目前，主要是以動、植物油脂為原料生產(chǎn)脂肪酸[2]，但這些油脂生產(chǎn)受季節(jié)、地域等因素限制，生產(chǎn)成本高，不宜大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)應用。微生物是有效轉(zhuǎn)化秸稈等生物質(zhì)資源的生物催化劑，是開發(fā)優(yōu)質(zhì)、低成本生物柴油的首選，已受到國內(nèi)外眾多學者的普遍關注[3]。微生物油脂種類繁多，脂肪酸組成與植物油脂相似，被譽為是“天然汽油”[4]。與動、植物油脂相比，微生物細胞增殖快，發(fā)酵周期短，不受場地、季節(jié)、氣候變化等的影響，易于連續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)。但是，天然產(chǎn)油微生物產(chǎn)生的脂肪酸多以甘油三酯形式貯存在細胞內(nèi)，需要從細胞內(nèi)提取，工藝復雜、生產(chǎn)成本高，且提取過程嚴重污染環(huán)境。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，通過代謝工程手段，定向調(diào)控工程大腸桿菌生產(chǎn)胞外游離脂肪酸，可以避免復雜的提取精煉過程，是真正降低脂肪酸生產(chǎn)成本，獲得優(yōu)質(zhì)油脂原料的有效手段，具有重要的戰(zhàn)略意義。工程大腸桿菌具有遺傳背景清楚，易于工程調(diào)控，可高密度發(fā)酵等諸多優(yōu)點，已經(jīng)成為微生物催化合成化學品和燃料的理想受體菌。目前，工程大腸桿菌已成功用于多種脂肪酸及脂肪酸代謝衍生物的生產(chǎn)，像類黃酮、生物乙醇等[5-6]。最近已有研究報道，利用工程菌生產(chǎn)脂肪酸，但這些研究獲得的脂肪酸多以胞內(nèi)脂形式存在，仍需復雜的提取分離過程，而對于利用工程菌生產(chǎn)胞外游離脂肪酸的研究較少。本文綜述大腸桿菌脂肪酸轉(zhuǎn)運相關調(diào)節(jié)基因和蛋白功能的研究進展，并對工程大腸桿菌生產(chǎn)胞外游離脂肪酸的策略進行展望。

1 大腸桿菌脂肪代謝途徑概述

在大多數(shù)細菌、植物中，脂肪酸合成是在一組高度保守蛋白的催化下完成的，這些蛋白被稱為Ⅱ型脂肪酸合成酶系(FAS)[7]。大腸桿菌脂肪酸合成是一種典型的FAS系統(tǒng)(圖1)。在所有生物體中，脂肪酸及其衍生物是機體細胞膜的重要組成部分，是能量代謝的重要動力來源，是代謝調(diào)節(jié)的重要分子，在生物體細胞代謝中發(fā)揮重要作用。在大腸桿菌細胞內(nèi)，脂肪酸代謝主要包括3個過程：1)從葡萄糖出發(fā)，經(jīng)糖酵解作用和三羧酸循環(huán)，為機體脂肪酸合成提供了底物acetyl-CoA；2)蘋果酸酶催化蘋果酸脫羧轉(zhuǎn)化生成丙酮酸，并釋放出能量NADPH，是脂肪酸合成的主要動力來源；3)經(jīng)脂肪酸從頭合成，在FAS的催化下轉(zhuǎn)化生成脂酰-CoA，脂酰-CoA在硫脂酶TesA的水解作用下，釋放出游離脂肪酸，進入細胞質(zhì)中，或在甘油三磷酸?；D(zhuǎn)移酶作用下生成磷脂。

圖1 大腸桿菌脂肪酸代謝路徑Fig.1 Metabolic pathway of fatty acids in E. coli

大腸桿菌脂肪酸轉(zhuǎn)運是一個復雜的調(diào)控過程，是在多種基因和蛋白的共同調(diào)節(jié)作用下進行的，但脂肪酸轉(zhuǎn)運及分泌機制尚處于探索階段[8]。已報道一些與大腸桿菌脂肪酸轉(zhuǎn)運相關的蛋白及基因家族，如硫脂酶基因[9]、Fad基因家族[10]、內(nèi)膜脂類翻轉(zhuǎn)酶基因[11]等。然而，若實現(xiàn)大腸桿菌脂肪酸胞外分泌，還需要對脂肪酸轉(zhuǎn)運的多種基因和蛋白進行調(diào)控，探索脂肪酸轉(zhuǎn)運可能的機制。

2 脂肪酸胞外分泌相關基因研究進展

長鏈脂肪酸是能量代謝和膜脂合成的重要原料，無論真核生物，還是原核生物，脂肪酸轉(zhuǎn)運到細胞的特定部位都是受基因嚴格調(diào)控的[12]，其中，研究較多的是硫脂酶基因、Fad基因家族。

2.1 硫脂酶基因

硫脂酶(TesA，EC3.1.2)廣泛存在于動植物、微生物體內(nèi)，在脂肪酸合成過程中催化水解脂酰-CoA或脂?；?ACP生成CoASH或ACP，同時釋放出游離脂肪酸的反應[9]，是細胞脂肪酸合成、降解和轉(zhuǎn)運的關鍵酶。機體代謝產(chǎn)生的脂肪酸是以胞內(nèi)脂形式貯存，還是以游離形式存在，取決于硫脂酶活性的大小[13]。因作用底物不同，硫脂酶分為兩類：以脂酰-ACP為水解底物的硫脂酶(acyl-ACP thioesterase)；以脂酰-CoA為水解底物的硫脂酶(acyl-CoA thioesterase)[14]。

大腸桿菌硫脂酶(acyl-CoA thioesterase)主要以脂酰-CoA為水解底物，釋放出游離脂肪酸[15]，同時也能夠水解脂酰-ACP，但酶活性較低，包括兩種類型：ThioesteraseⅠ，由tesA基因編碼，專一性水解12～18碳的脂酰-CoA；Thioesterase II，由tesB基因編碼，專一性水解6～18碳的脂酰-CoA[16]。目前，對大腸桿菌硫脂酶基因功能已有報道，Zheng等[17]在大腸桿菌中共表達tesB和phaG基因后，發(fā)現(xiàn)兩個基因有相互調(diào)節(jié)作用，促進了重組菌3-羥基癸酸(3-hydroxydecanoic acid)的生產(chǎn)。Steen等[4]研究表明，在大腸桿菌中表達內(nèi)源硫脂酶基因tesA，搖瓶發(fā)酵可得到0.32g/L的游離脂肪酸。因此，可在大腸桿菌中表達硫脂酶tesA基因，釋放出ACP，獲得游離脂肪酸，參與脂肪酸轉(zhuǎn)運，使脂肪酸以游離形式分泌到細胞外。近年來又有相關研究驗證了這一結論[17]，但由于脂肪酸轉(zhuǎn)運受多種酶和蛋白的調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)運機制尚不清楚。

2.2 脂酰輔酶A合成酶基因

圖2 大腸桿菌長鏈脂肪酸跨膜轉(zhuǎn)運過程[10]Fig.2 Cross-membrane transportation process of long-chain fatty acids in E. coli

在大腸桿菌中，長鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運是在功能基因fadD和fadL的共同作用下實現(xiàn)的[18-20](圖2)。fadD基因編碼脂酰輔酶A合成酶(FadD，EC 6.2.1.3)，對長鏈脂肪酸有較強的專一性，與細胞質(zhì)膜結合不牢固。Klein等[21]指出fadD基因缺陷株不能在細胞質(zhì)或細胞膜磷脂中積累任何鏈長的脂肪酸，這證明了脂酰輔酶A合成酶在細胞脂肪酸轉(zhuǎn)運中是一個必須的重要基團。Michinaka等[16]敲除了釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的脂酰輔酶A合成酶基因fadD，細胞產(chǎn)生的脂肪酸以游離形式分泌到細胞外，較原始菌株相比，胞外脂肪酸含量提高了17倍。在大腸桿菌fadD基因缺陷株中表達內(nèi)源硫脂酶tesA基因，重組菌胞外游離脂肪酸產(chǎn)量可達到0.7g/L。

2.3 外膜蛋白基因fadL

fadL基因編碼外膜蛋白FadL，是調(diào)控大腸桿菌長鏈脂肪酸跨外膜向內(nèi)膜轉(zhuǎn)運的重要通道蛋白[22]。在大腸桿菌脂肪酸轉(zhuǎn)運體系中，fadL基因發(fā)揮著重要作用，其專一轉(zhuǎn)運細胞中10～18個碳的脂肪酸，并以10～18個碳鏈長的脂肪酸為底物；結合12～18碳的脂肪酸向膜磷脂轉(zhuǎn)運，是脂肪酸轉(zhuǎn)運的必需基因[23]。在長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運過程中，長鏈脂肪酸與FadL結合，構像發(fā)生變化，暴露在膜蛋白通道處，易于跨膜蛋白通道轉(zhuǎn)運[18]。長鏈脂肪酸(LCFA)是通過膜蛋白FadL的特殊轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)機制跨越外膜運輸?shù)?。當穿過外膜后，LCFA進入周質(zhì)空間，同時，允許部分進入細胞內(nèi)膜。FadD與內(nèi)源ATP結合并主要以FadD-ATP形式存在，這一復合體可能是調(diào)控細胞內(nèi)膜游離脂肪酸形成的主要調(diào)節(jié)蛋白。然而，脂肪酸借助FadL跨外膜蛋白向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的機制目前仍不清楚。Kumar等[24]預測轉(zhuǎn)運的脂肪酸碳末端主要是疏水性的和帶電荷的氨基酸。Lee等[25]將芽孢桿菌Bacillus sp. strain TG43脂肪酶定位在大腸桿菌fadL基因C末端，利用fadL基因作為錨定蛋白的性質(zhì)，能夠有效檢測大腸桿菌細胞表面的脂肪酶活性。

由此可見，fadD基因和fadL基因是大腸桿菌脂肪酸轉(zhuǎn)運過程中的兩個重要調(diào)節(jié)基因，利用基因敲除手段，對細胞脂肪酸轉(zhuǎn)運進行定向調(diào)控，是實現(xiàn)大腸桿菌脂肪酸胞外分泌的有效策略。

3 脂肪酸胞外分泌相關蛋白研究進展

大腸桿菌長鏈游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)跨細胞膜轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中，是細胞利用FFA的重要環(huán)節(jié)[11]。大腸桿菌是G—細菌，細胞膜由外膜和內(nèi)膜兩部分組成，磷脂雙分子層是構成細胞膜的基本支架，使得細胞具有良好的流動性[26]，但脂肪酸是如何在內(nèi)膜和外膜之間轉(zhuǎn)運的一直以來是學者們討論的焦點[27-29]。盡管目前關于大腸桿菌脂肪酸轉(zhuǎn)運的研究已取得了一定進展，但細胞內(nèi)的游離脂肪酸是通過簡單擴散形式被動運輸?shù)郊毎猓€是在膜蛋白參與下的主動運輸作用[11,30]，觀點不一。脂肪酸是大分子化合物，在機體中通過簡單的自由擴散形式分泌到細胞外的量相對較少，而大多需要借助膜蛋白進行轉(zhuǎn)運，因此，脂肪酸在膜蛋白作用下的跨膜轉(zhuǎn)運機制研究受到國內(nèi)外學者的關注[31-32]。脂肪酸在細胞質(zhì)中形成，借助轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運到細胞膜上發(fā)揮功能，通常是在多種膜蛋白的作用下實現(xiàn)的，其中，研究較多的是膜蛋白MsbA。

3.1 內(nèi)膜脂類翻轉(zhuǎn)酶MsbA

內(nèi)膜脂類翻轉(zhuǎn)酶MsbA是一種膜蛋白，由msbA基因編碼，是大腸桿菌磷脂和脂質(zhì)跨內(nèi)膜向外膜轉(zhuǎn)運的一個重要的ABC轉(zhuǎn)座子[33-34]。msbA基因最早是在研究htrB基因突變株時發(fā)現(xiàn)的，推測msbA基因編碼的蛋白參與細胞早期形成的脂質(zhì)跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運[35]。X射線晶體檢測表明，大腸桿菌MsbA蛋白可能具有脂質(zhì)翻轉(zhuǎn)酶功能，在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運中起著至關重要的作用[36]。研究表明，MsbA在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運中可能存在兩種機制：以“flip-flop”模式(圖3A)，依賴于MsbA的轉(zhuǎn)運作用，新合成的脂質(zhì)積累在內(nèi)膜表面；以“ejection”模式(圖3B)，可能不需要MsbA的轉(zhuǎn)運作用，直接在MsbA的催化作用下，將脂質(zhì)從內(nèi)膜外表面溢出。近年來，圍繞MsbA在脂質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運中的作用進行了很多研究[37-38]，但脂質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運機制仍處于探索階段。

圖3 MsbA在大腸桿菌脂質(zhì)轉(zhuǎn)運中功能[39]Fig.3 Possible functions of MsbA in lipid transportation in E. coli

3.2 調(diào)控脂肪酸轉(zhuǎn)運的其他膜蛋白

大腸桿菌脂肪酸在細胞代謝、細胞繁殖、細胞膜組成等方面都發(fā)揮著不可替代的作用，在細胞質(zhì)中合成的脂肪酸轉(zhuǎn)運到細胞膜表面，是在多種膜蛋白共同調(diào)節(jié)下實現(xiàn)的。除了膜蛋白MsbA外，近年來又探索了與脂肪酸轉(zhuǎn)運相關的其他蛋白的功能，像Skp、SurA、FkpA和DegP蛋白[39]。Wu等[40]研究表明，參與細胞表面脂多糖積累的功能蛋白有兩種：與基本外膜蛋白相連的Imp蛋白和脂蛋白RlpB。盡管已鑒定了這些蛋白參與外膜蛋白形成，但在脂肪酸跨膜轉(zhuǎn)運、脂肪酸定位和蛋白折疊方面的機制還需進一步探索。對大腸桿菌膜蛋白功能的研究，將有助于進一步解析原核生物脂肪酸轉(zhuǎn)運機制，是今后工作的重點。

4 結 語

目前，利用工程大腸桿菌生產(chǎn)游離脂肪酸在國內(nèi)外尚處于探索階段。大腸桿菌生長速度快，易于代謝調(diào)控，是解決脂肪酸生產(chǎn)現(xiàn)存問題的理想宿主菌株，但正常情況下，脂肪酸多為胞內(nèi)產(chǎn)物，幾乎無胞外分泌，仍需經(jīng)過復雜、耗能的提取分離過程制得，限制大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)應用。作為一種模式菌株，探索脂肪酸轉(zhuǎn)運相關基因和蛋白功能，獲得游離脂肪酸，解析脂肪酸胞外分泌機制，一直是備受國內(nèi)外學者關注的問題，但由于脂肪酸轉(zhuǎn)運是受多因素調(diào)控的復雜過程，這一問題目前仍處于探索階段。

利用現(xiàn)代生物技術手段對大腸桿菌脂肪酸代謝途徑相關基因和蛋白進行定向調(diào)控，調(diào)節(jié)脂肪酸胞外分泌能力，構建高產(chǎn)游離脂肪酸的工程菌株，生產(chǎn)游離脂肪酸，便可直接用于油脂生產(chǎn)，簡化生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本。當前，要獲得產(chǎn)胞外游離脂肪酸的工程菌株，首先要從內(nèi)源或異源的生物體中克隆調(diào)控脂肪酸代謝和轉(zhuǎn)運的酶基因，如內(nèi)源硫脂酶tesA基因、植物硫脂酶AtFatA基因、fadD基因、fadL基因，并在大腸桿菌中表達，探索基因及基因間相互作用對工程菌脂肪酸胞外分泌的影響；其次，結合蛋白質(zhì)組學和綠色熒光蛋白技術，探索與脂肪酸轉(zhuǎn)運相關蛋白功能，像目前研究較多的膜蛋白MsbA；然后，利用代謝組學技術，整合上述與脂肪酸胞外分泌相關的基因和蛋白，構建工程菌株，生產(chǎn)胞外游離脂肪酸。最近，美國學者Steen等[4]通過在大腸桿菌中表達內(nèi)源和異源硫脂酶基因，并敲除fadD基因，構建了工程大腸桿菌，對工程菌脂肪酸轉(zhuǎn)運相關基因進行了定向調(diào)控；同時，用工程菌種表達了水解纖維素的基因，使工程菌能夠自身水解纖維素，并以纖維素水解產(chǎn)物作碳源，工程菌發(fā)酵可獲得1g/L的游離脂肪酸，降低了脂肪酸生產(chǎn)成本，簡化了生產(chǎn)工藝，目前正通過發(fā)酵條件優(yōu)化，提高工程菌胞外游離脂肪酸產(chǎn)量，可望大規(guī)模應用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酸，有良好的工業(yè)應用前景。

通過現(xiàn)代生物技術手段調(diào)控大腸桿菌脂肪酸代謝，為脂肪酸工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供優(yōu)良菌株。這一策略不僅豐富了傳統(tǒng)的油脂工業(yè)生產(chǎn)技術，而且是一條“不與民爭糧，不與糧爭地”的油脂生產(chǎn)新途徑，可為食品、醫(yī)藥、生物液體燃料等油脂工業(yè)生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)原料來源，具有良好的應用前景和現(xiàn)實意義。同時，對脂肪酸轉(zhuǎn)運相關基因功能的探索，也可為進一步解析脂肪酸轉(zhuǎn)運機制奠定理論基礎。

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[40] WU Tao, MCCANDLISH A C, GRONENBERG L S, et al. Identification of a protein complex that assembles lipopolysaccharide in the outer membrane of Escherichia coli[J]. Proc Natl Acad Sci, 2006, 103(31):11754-11759.

Research Progress in Regulation of Fatty Acid Secretion in Engineered E. coli Strain

MENG Xin1，CHENG Tao1,2，LI Liang-zhi1，YANG Jian-ming1，LIU Wei1，XU Xin1，XIAN Mo1,*
(1. Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China；2. School of Materials and Chemical Engineering, Jiangxi University of Science and Technology, Ganzhou 341000, China)

Fatty acids produced by oil-producing microorganisms are stored in cells as the form of triglyceride. The extraction of these fatty acids from the cells is involved in complex processing, high production cost and serious environmental pollution.Targeted regulation for the production of free fatty acids by engineered E. coli strains is becoming one of the hottest topics in current research, which will be an effective strategy for reducing energy crisis and providing high-quality and low-cost raw materials of oil. The research progress of some genes (tesA, fadD and fadL) and regulatory protein (MsbA) related to extracellular secretion of fatty acids in E. coli has been reviewed in this paper. Meanwhile, the target regulation of fatty acid metabolism by using molecular biology and metabolic engineering strategies has been proposed, with the aim of provideing a new direction for producing extracellular fatty acids.

fatty acid；metabolic regulation；transportation

Q547

A

1002-6630(2011)05-0331-05

2010-05-25

中國科學院知識創(chuàng)新工程項目(KGCX2-YW-801)；國家自然科學基金項目(20872075)

孟鑫(1981—)，女，博士，研究方向為生物催化。E-mail：woxing1981@163.com

*通信作者：咸漠(1965—)，男，研究員，博士，研究方向為生物催化。E-mail：xianmo@qibebt.ac.cn